Name: Functionele karakterisering en visualisatie van slokdarmfibroblasten met behulp van organoïde coculturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Leer een co-cultuurmethode met slokdarmorganoïden en fibroblasten om stamcelgedrag te bestuderen. Dit protocol maakt whole mount imaging mogelijk voor visualisatie van celinteracties en morfologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door ERC StG TroyCAN (851241). E.E. is een Cancerfonden Postdoctoral Associate. M.G. is een Ragnar Söderberg Fellow en Cancerfonden Junior Investigator. We zijn dankbaar voor de technische assistentie van de kernfaciliteiten van het Karolinska Institutet, waaronder de Biomedicum Flow Cytometry Core Facility, de Biomedicum Imaging Core (BIC) en de Comparative Medicine Biomedicum (KMB) dierenfaciliteit. We bedanken de leden van het Genander lab voor het zorgvuldig lezen en becommentariëren van het protocol.

<ol><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).</li>
<li>Lohmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+cervical+tissue+dynamics+and+viral+oncogenesis+in+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer.</a> Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Smukler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+mouse+and+human+pancreas+contain+rare+multipotent+stem+cells+that+express+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin.</a> Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).</li>
<li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+murine+esophageal+organoid+culture+method+and+organoid-based+model+of+esophageal+squamous+cell+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia.</a> iScience. 24 (12), 103440(2021).</li>
<li>DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+heterogeneity+in+the+mouse+esophagus+implicates+the+presence+of+a+nonquiescent+epithelial+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population.</a> Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).</li>
<li>Kasagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+esophageal+organoid+system+reveals+functional+interplay+between+notch+and+cytokines+in+reactive+epithelial+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The esophageal organoid system reveals functional interplay between notch and cytokines in reactive epithelial changes.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (3), 333-352 (2018).</li>
<li>Plikus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts%3A+Origins%2C+definitions%2C+and+functions+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts: Origins, definitions, and functions in health and disease.</a> Cell. 184 (15), 3852-3872 (2021).</li>
<li>McCarthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mesenchymal+cell+populations+generate+the+essential+intestinal+BMP+signaling+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct mesenchymal cell populations generate the essential intestinal BMP signaling gradient.</a> Cell Stem Cell. 26 (3), 391-402 (2020).</li>
<li>Cordero-Espinoza, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+cell+contacts+between+periportal+mesenchyme+and+ductal+epithelium+act+as+a+rheostat+for+liver+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic cell contacts between periportal mesenchyme and ductal epithelium act as a rheostat for liver cell proliferation.</a> Cell Stem Cell. 28 (11), 1907-1921 (2021).</li>
<li>Pastula, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+gastrointestinal+organoid+culture+in+combination+with+nerves+or+fibroblasts%3A+a+method+to+characterize+the+gastrointestinal+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional gastrointestinal organoid culture in combination with nerves or fibroblasts: a method to characterize the gastrointestinal stem cell niche.</a> Stem Cells International. 2016, 3710836(2016).</li>
<li>Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+divergence+of+platelet-derived+growth+factor+alpha+receptor+signaling+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).</li>
<li>McGinn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomechanical+switch+regulates+the+transition+towards+homeostasis+in+oesophageal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A biomechanical switch regulates the transition towards homeostasis in oesophageal epithelium.</a> Nature Cell Biology. 23 (5), 511-525 (2021).</li>
<li>Zhang, Y., Bailey, D., Yang, P., Kim, E., Que, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+stem+cells+of+the+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The development and stem cells of the esophagus.</a> Development. 148 (6), (2021).</li>
<li>Ohlund, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+populations+of+inflammatory+fibroblasts+and+myofibroblasts+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214 (3), 579-596 (2017).</li>
<li>Pentinmikko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notum+produced+by+Paneth+cells+attenuates+regeneration+of+aged+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Notum produced by Paneth cells attenuates regeneration of aged intestinal epithelium.</a> Nature. 571 (7765), 398-402 (2019).</li>
<li>Janson, D., Rietveld, M., Willemze, R., El Ghalbzouri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+serially+passaged+fibroblasts+on+dermal+and+epidermal+morphogenesis+in+human+skin+equivalents%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Effects of serially passaged fibroblasts on dermal and epidermal morphogenesis in human skin equivalents.</a> Biogerontology. 14 (2), 131-140 (2013).</li>
<li>Landry, N. M., Rattan, S. G., Dixon, I. M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+of+maintaining+primary+murine+cardiac+fibroblasts+in+two-dimensional+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An improved method of maintaining primary murine cardiac fibroblasts in two-dimensional cell culture.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12889(2019).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

Het hier gepresenteerde protocol stelt een in vitro model vast voor het onderzoeken van functionele oesofageale epitheel-fibroblastinteracties.
De epitheellaag is gescheiden van het stroma, waardoor een geoptimaliseerd dissociatieprotocol mogelijk is voor zowel het epitheliale als het stromale compartiment. Ondanks optimalisatie van het epitheliale dissociatieprotocol blijven weefselklonters zichtbaar. Elke 15 minuten krachtig op en neer pipetteren vermindert het aantal en de grootte van de klonten aanzienlijk. Andere protocollen gebruiken trypsine om de epitheellaagverder te dissociëren 5,6. Hier wordt het gebruik van trypsine, of het verder verhogen van de dissociatietijd, niet aanbevolen, omdat dit meestal resulteert in verminderde levensvatbaarheid van epitheelcellen en organoïdevormende efficiëntie. In tegenstelling tot het epitheel is het stroma gemakkelijk gedissocieerd en 30 minuten in dissociatieoplossing resulteert in een eencellige suspensie met ~ 90% fibroblast levensvatbaarheid (figuur 1E). Het uitsluiten van de epitheliale-stomale scheidingsstap in het protocol verhoogt de dissociatietijd aanzienlijk, wat resulteert in een verminderde levensvatbaarheid van fibroblasten en een lagere opbrengst van epitheelcellen. Bovendien biedt het scheiden van het epitheel van het stroma de mogelijkheid om het celaantal van elke populatie te bepalen en epitheelcellen en fibroblasten van verschillende muislijnen te mengen bij het opzetten van de co-culturen.
Het bestuderen van de fibroblastfunctie op organoïdegroei is een veelgebruikte methode in de stamcelbiologie 9,10,11,15,16. Gevestigde co-cultuur media zijn ofwel DMEM aangevuld met 10% foetaal kalf serum (FCS)9,15 of groeifactor verlaagd medium10,16. In dit protocol wordt het groeifactor gereduceerd medium gebruikt om de omstandigheden in de in vivo stamcelniche na te bootsen, waar fibroblasten grotendeels rustig zijn. FCS is een groeifactorrijk serum dat resulteert in activering en proliferatie van fibroblasten in de co-culturen, waarschijnlijk overeenkomend met een fibroblastceltoestand die verschilt van de in vivo toestand. Door FCS uit te sluiten en groeifactoren te verminderen, zodat het medium alleen (ERlaag) de organoïde groei niet ondersteunt en de proliferatie van fibroblasten niet stimuleert, is het mogelijk om het effect van de fibroblasten op de organoïde groei te isoleren. In dit medium wordt NOGGIN verwijderd en RSPO tot een minimum beperkt (10% RPSO). Van zowel NOGGIN als RSPO is aangetoond dat ze essentieel zijn voor de groei van slokdarmorganoïden6. EFG werd behouden in het cocultuurmedium, omdat het zelf de groei van organoïden niet ondersteunt. Fibroblasten zijn echter ook in staat om organoïde groei te ondersteunen in een EGF-gereduceerd medium (E laag Rlaag; Figuur 2B,D).
Organoïde coculturen kunnen niet worden onderhouden door passaging, omdat fibroblasten verloren gaan tijdens trypsinisatie. Organoïde passaging werd echter opgenomen in het protocol, omdat slokdarmorganoïden kunnen worden onderhouden, uitgebreid en gebruikt voor verdere experimenten als monoculturen. Gepasseerde organoïden uit monoculturen kunnen worden gebruikt om coculturen op te zetten met vers geïsoleerde fibroblasten. Een nadeel van het gebruik van primaire cellen is het aantal muizen dat nodig is om meerdere organoïde coculturen op te zetten. Wanneer zich wordt gericht op kleine subpopulaties van fibroblasten, is het aantal verkregen coculturen beperkt. In andere protocollen worden fibroblasten eerst in cultuur uitgebreid voordat ze worden gebruikt om organoïde coculturen op te zetten10. Fibroblasten veranderen echter morfologie en identiteit tijdens het passeren, aangetoond door het gebruik van primaire huid- en hartfibroblasten17,18. Conventionele 2D-passaging van slokdarmfibroblasten resulteert in zowel morfologie als fenotypeveranderingen, wat aantoont dat in vitro verrijking van fibroblasten niet geschikt is voor co-culturen die gericht zijn op fenocopie van de endogene stamcelniche.
Whole mount kleuring biedt een hulpmiddel om fibroblast-organoïde interactie te behouden en te visualiseren. Opgemerkt moet worden dat, hoewel niet alle organoïden fibroblasten direct aan hen hebben bevestigd, de meeste organoïden in contact komen met fibroblasten (zie figuur 2C). Om epitheliale-fibroblastinteracties te behouden, is het belangrijk om de organoïden met zorg te behandelen en krachtig pipetteren, vortexing en snel spinnen te vermijden. Optimale fixatie is belangrijk om de 3D-weefselarchitectuur te behouden en endogene fluorescentie te behouden. Een fixatie van 30 minuten volstaat om het H2BeGFP-signaal te behouden en is optimaal voor de antilichamen die in dit protocol worden gebruikt, maar dit kan variëren tussen de gebruikte fluoroforen en antilichamen. Het opruimen van de organoïden vermindert lichtverstrooiing en verbetert de visualisatie van de hele 3D-structuur aanzienlijk. Omdat de organoïden klein zijn, is het opruimen gemakkelijk en snel; het in beeld brengen van hele organoïden met behulp van laserscannende confocale microscopie kan echter tijdrovend zijn, omdat er meerdere Z-stacks moeten worden gemaakt. Confocale microscopen, zoals de draaiende schijf, kunnen worden gebruikt om de beeldvormingstijd te verkorten.
Over het algemeen bieden slokdarmorganoïden gekweekt in de aanwezigheid van fibroblasten een waardevol hulpmiddel om aspecten van de slokdarmstamcelniche te begrijpen. Bovendien biedt whole mount clearing een toegankelijke methode om de interactie tussen fibroblasten en organoïden te visualiseren.

Organoïden worden gebruikt als 3D in vitro assays om stam- en voorlopercellen te karakteriseren, evenals om de signaalsignalen te begrijpen die zijn afgeleid van de cellulaire componenten van de stamcelniche 1,2,3,4. Muisslokdarmorganoïden werden voor het eerst beschreven in 2014 en verschillende artikelen hebben groeifactoren geïdentificeerd, zoals R-Spondin (RSPO), NOGGIN en epidermale groeifactor (EGF), die nodig zijn om slokdarmorganoïden 5,6,7 te behouden en te passeren, met het argument dat vergelijkbare signaalsignalen nodig zijn voor in vivo voorlopercelvernieuwing. Groeifactoren worden echter vaak toegevoegd in niet-fysiologische concentraties, wat resulteert in organoïde groeiomstandigheden die niet noodzakelijkerwijs de in vivo signaleringsomgeving weerspiegelen.
Fibroblasten zijn heterogene stromale celpopulaties die voorloperceleigenschappen ondersteunen in veel stamcelniches8. Het combineren van epitheliale voorlopercellen en fibroblasten in dezelfde organoïde cultuur maakt organoïdevorming mogelijk in verminderde concentraties van exogeen aangevulde groeifactoren. Organoïde co-cultuursystemen van intestinale en hepatische epithelia worden beschreven, maar een protocol om slokdarmorganoïde-fibroblast co-culturen vast te stellen is nog steeds uitstekend 9,10,11.
In dit protocol worden twee fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) strategieën voor fibroblasten uit de slokdarm geschetst, met behulp van transgene PdgfrαH2BeGFP-muizen 12 of wild-type muizen met klassieke antilichaamkleuring. Verschillende subpopulaties van fibroblasten kunnen worden geïsoleerd met behulp van celoppervlakmarkers naar keuze, waardoor het protocol flexibiliteit krijgt. Bovendien wordt een 3D-fluorescentiebeeldvormingstechniek met behoud van organoïde morfologie gebruikt om fibroblast-organoïde interacties te karakteriseren. Organoïde clearing biedt een snelle methode om de lichtpenetratiediepte in de organoïden te vergroten, de visualisatie van organoïde-fibroblastverbindingen te verbeteren en de recapitulatie van de organoïde structuur in zijn geheel mogelijk te maken. Dit protocol combineert slokdarm organoïde co-cultuur met een hele mount imaging strategie, waardoor functionele karakterisering van de fibroblast-organoïde interactie mogelijk is.

<table><tbody><tr><td>B-27 Supplement (50X), serum free</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix</td><td>fisher scientific</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>11320074</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>14175-129</td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Jackson Immuno</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 solution</td><td>Merck</td><td>93443-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals, Peptides, and recombinant proteins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI Solution</td><td>Thermo Fisher</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Dissociation solution: 0.25 mg/ml Liberase TM, 0.25 mg/ml Dnase in HBSS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde, 37%, with 10-15% methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-1L</td><td></td></tr><tr><td>Liberase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401127001</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetyl-cysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-25G</td><td></td></tr><tr><td>Noggin murine</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear 1.47</td><td>SunJin Lab</td><td>#RC147001</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse EGF Protein, CF</td><td>R&amp;D systems</td><td>2028-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin-1 murine</td><td>Peprotech</td><td>315-32</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Blue Dead Cell Stain</td><td>Thermo Fisher</td><td>S34857</td><td></td></tr><tr><td>Thermolysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7902-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Plastic &amp; Glassware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Sterile Cell Strainers 40um</td><td>VWR</td><td>15360801</td><td></td></tr><tr><td>Corning Sterile Cell Strainers 70um</td><td>VWR</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Menzel Deckgläser/ cover slips</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q10143263NR15</td><td></td></tr><tr><td>SafeSeal reaction tube, 1.5 mL, PP</td><td>Sarstedt</td><td>72.706</td><td></td></tr><tr><td>Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes 0.6 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>3446</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Slides</td><td>VWR</td><td>631-9483</td><td></td></tr><tr><td>Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.05 mm 4 circular well iSpacer</td><td>SunJin Lab</td><td>#IS204</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps, biology tip</td><td>F.S.T</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Pen</td><td>VectorLaboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Spring Scissors Angled to Side Ball Tip 8mm Cutting Edge</td><td>F.S.T</td><td>15033-09</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope Stellaris 5 </td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope ZEISS Stemi 305</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS ARIA III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conjugated Antibodies for FACS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD104 Antibody Clone: 346-11A</td><td>123608</td><td>123608</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD26 (DPP-4) Antibody</td><td>H194-112</td><td>H194-112</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-mouse/human CD324 (E-Cadherin) Antibody</td><td>147310</td><td>147310</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies for Immunofluorescence</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD104 (β-integrin 4) Clone: 346-11A</td><td>BioLegend</td><td>553745</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeratin 14</td><td>Acris Antibodies (AbD Serotec)</td><td>BP5009</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeratin13 Clone: EPR3671</td><td>abcam</td><td>ab92551</td><td></td></tr><tr><td>E-cadherin (CD324) Clone: 2.40E+11</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3195</td><td></td></tr><tr><td>Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified Clone: Poly9059</td><td>BioLegend</td><td>905901</td><td></td></tr><tr><td>p63 Clone: 4a4</td><td>abcam</td><td>ab735</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Anti-KLF4 antibod Clone: EPR20753-25</td><td>abcam</td><td>ab214666</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5733</td><td></td></tr><tr><td>Secondary antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-species* antibodies with fluorophore of choice</td><td>Jackson Immuno</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

functionele karakterisering en visualisatie van slokdarmfibroblasten met behulp van organoïde coculturen

Functional Characterization and Visualization of Esophageal Fibroblasts Using Organoid Co-Cultures

Epitheelstam- en voorlopercellen dragen bij aan de vorming en het onderhoud van de epitheelbarrière gedurende het hele leven. De meeste stam- en voorlopercelpopulaties zijn weggestopt op anatomisch verschillende locaties, waardoor exclusieve interacties mogelijk zijn met nichesignalen die de stam behouden. Hoewel de ontwikkeling van epitheliale organoïde culturen een krachtig hulpmiddel biedt voor het begrijpen van de rol van stam- en voorlopercellen in homeostase en ziekte, is de interactie binnen de niche-omgeving grotendeels afwezig, waardoor de identificatie van factoren die het gedrag van stamcellen beïnvloeden, wordt belemmerd. Fibroblasten spelen een sleutelrol bij het sturen van epitheliale stam en voorloper lot. Hier wordt een uitgebreid organoïde-fibroblast co-cultuurprotocol gepresenteerd dat de afbakening van fibroblastsubpopulaties in slokdarmvoorlopercelvernieuwing en -differentiatie mogelijk maakt. In dit protocol wordt een methode beschreven om zowel epitheelcellen als fibroblasten parallel aan de slokdarm te isoleren. Verschillende fluorescentie-geactiveerde celsorteerstrategieën om zowel de slokdarmvoorlopercellen als de fibroblastsubpopulaties te isoleren van transgene reporter- of wild-type muizen worden geschetst. Dit protocol biedt een veelzijdige aanpak die kan worden aangepast aan de isolatie van specifieke fibroblastsubpopulaties. Het vaststellen en doorgeven van slokdarmepitheelorganoïde monoculturen is opgenomen in dit protocol, waardoor een directe vergelijking met het cocultuursysteem mogelijk is. Daarnaast wordt een 3D-clearingbenadering beschreven die gedetailleerde beeldanalyse van epitheliale-fibroblastinteracties mogelijk maakt. Gezamenlijk beschrijft dit protocol een vergelijkende en relatief high-throughput methode voor het identificeren en begrijpen van slokdarmstamcelnichecomponenten in vitro.

De slokdarm is verdeeld in verschillende lagen: epitheel, lamina propria, submucosa en muscularis externa (figuur 1A). Fibroblasten bevinden zich in de submucosa en lamina propria, aangeduid als het stroma. In dit protocol wordt de muscularis externa mechanisch verwijderd (figuur 1B), wat niet leidt tot een verlies van fibroblasten (PdgfrαH2BeGFP+) die zich in het stroma bevinden (figuur 1C). Vóór dissociatie wordt het epitheel gescheiden van het stroma, wat resulteert in twee weefselsegmenten (figuur 1B). Het scheiden van de twee lagen biedt de mogelijkheid om de dissociatietijd te verlengen voor de robuustere epitheellaag in vergelijking met de fragiele stromale laag. Op deze manier wordt een efficiënt isolatieprotocol opgesteld dat zowel levensvatbare epitheliale voorlopercellen als stromale fibroblasten oplevert (figuur 1B). Slokdarmvoorlopercellen worden gesorteerd op basis van hun hoge INTEGRIN-β4- en E-CADHERIN-expressie (figuur 1C,D).
Subpopulaties van fibroblasten kunnen worden geïsoleerd met behulp van verschillende markers. In dit protocol wordt een strategie voor fibroblastisolatie op basis van veelgebruikte fibroblastmarkers PDGFRα en DPP4 (CD26) gegeven. Isolatie door de PdgfrαH2BeGFP-reporterexpressie of DPP4-antilichaam toont aan dat ongeveer 50% van de geïsoleerde cellen fibroblasten zijn (figuur 1E,F). Bovendien is 70% van de PDGFRα+ fibroblasten DPP4+, wat aangeeft dat een grotendeels overlappende, maar niet identieke fibroblastpopulatie wordt verkregen. Na het isoleren van zowel epitheel- als stromale celpopulaties, worden slokdarmvoorlopercellen alleen of samen met fibroblasten in een matrixkoepel gekweekt. Om de bijdrage van fibroblasten aan de vorming van organoïden te bestuderen, wordt de co-cultuur gehandhaafd in een groeifactor gereduceerd medium (figuur 1G).
Slokdarmvoorlopercellen vormen organoïden in aanwezigheid van EGF, NOGGIN en RSPO (ENR). Het verwijderen van NOGGIN en het verminderen van de hoeveelheid RSPO (25 ng / μL; ERlaag) is voldoende om organoïdevorming te voorkomen (figuur 2A). Interessant is dat het toevoegen van DPP4 + of PDGFR + fibroblasten aan de slokdarmvoorlopercellen in het ERlow medium het organoïdevormende vermogen herstelt, wat een ondersteunende functie voor beide fibroblastpopulaties aantoont (figuur 2A-D). Visualisatie van het PdgfrαH2BeGFP-transgen laat zien dat fibroblasten tijdens de vorming van organoïden in nauw contact staan met de epitheelvoorlopercellen (figuur 2A). Op dag 6 zijn PdgfrαH2BeGFP+ fibroblasten nog steeds overvloedig aanwezig in de co-cultuur. Fibroblasten zijn aanwezig in de hele koepel, in de buurt van en raken de organoïden (volledige pijl), of bevestigd aan de organoïden (pijlpunt; Figuur 2D).
Whole mount kleuring toont een 3D-weergave van de interactie van de fibroblasten met de organoïden (figuur 3). Hoewel het mogelijk is om het hele montageprotocol uit te voeren zonder het gebruik van een clearingoplossing, vermindert het de transparantie en laserpenetratie van de organoïde (figuur 3B, z-view). Bij het monteren van organoïden helpt de afstandhouder om de organoïde morfologie te behouden. Daarentegen vlakt het beplaten van de coverslip direct op de organoïden (zonder afstandhouder) de organoïden af en resulteert in verlies van organoïde structuur (figuur 3A, B).
Zowel de DPP4+ als de PDGFRα+ fibroblasten blijken om de organoïden te zijn gewikkeld (Figuur 3C, Video1 en Video 2). Differentiatie van slokdarmorganoïden kan worden beoordeeld met behulp van verschillende markers. Figuur 4 laat zien dat het meegeleverde kleuringsprotocol geschikt is voor gemakkelijker te kleuren keratines (KRT14/13) en moeilijker-te-kleuren transcriptiefactoren (TRP63/KLF4). Het co-cultuurprotocol genereert organoïden met een vergelijkbaar differentiatiepatroon, zoals aangetoond in vivo13,14 en zoals gezien in organoïden gekweekt in ENR-medium; KRT14+ of TRP63+ voorlopercellen vormen de buitenste laag en KRT13+ of KLF4+ gedifferentieerde cellen oriënteren zich naar binnen.
Dit protocol biedt een hulpmiddel om de slokdarmstamcelniche in vitro te bestuderen en visualiseert de interactie tussen organoïden en fibroblasten. Door een protocol te implementeren voor de isolatie van fibroblasten met behulp van antilichamen, is de methode aanpasbaar en kan deze worden gebruikt om fibroblastsubpopulaties te bestuderen zonder de noodzaak van transgene muizen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig01.jpg"> Figuur 1: Isolatie van voorlopercellen en fibroblastsubpopulaties uit de slokdarm. (A) Schematisch overzicht van de verschillende lagen in de slokdarm. Het stroma bevat de lamina propria en submucosa. (B) Schematisch overzicht van het isolatieprotocol. De spier (muscularis externa) wordt mechanisch verwijderd met behulp van een tang; De resterende slokdarm wordt opengesneden en geïncubeerd in thermolysine om de epitheellaag van het stroma te scheiden. Het epitheel en stroma worden gescheiden, mechanisch gehakt en enzymatisch verteerd tot eencellige suspensies. Gedissocieerde cellen worden vervolgens gekleurd en voorbereid op FACS. (C) Doorsnede van de slokdarm ontdaan van de muscularis externa met PdgfrαH2BeGFP+ fibroblasten in het stroma. INTEGRINE-β4 (ITGβ4) en E-CADHERINE (ECAD) dubbelpositieve cellen zijn de epitheliale voorlopercellen van de slokdarm. Schaalbalk = 100 μm. (D) Representatieve flowcytometrieplot van epitheelcelisolatie met het percentage levende cellen (bovenste paneel) van alle afzonderlijke cellen. Het onderste paneel toont het percentage geïsoleerde ITGβ4+ ECAD+ voorlopercellen (Prog.) van alle levende cellen. (E) Representatieve flowcytometrie plot van stromale celisolatie met het percentage levende cellen (paneel linksboven). Representatieve flowcytometrieplots met het percentage geïsoleerde DPP4+ fibroblasten (Fibr.; paneel rechtsboven) en Pdgfrα+ fibroblasten (linkerbenedenpaneel) van alle levende cellen. 70% van de Pdgfrα+ fibroblasten zijn ook DPP4+ (rechterbenedenpaneel). (F) Representatieve flowcytometrieplot van het stroma met alleen DPP4+ cellen (2,5%), DPP4+ PDGFRα+ cellen (37,5%), en PDGFRα+ alleen cellen (17,7%). De percentages zijn van alle levende cellen. (G) Alleen epitheelcellen worden geplateerd in een matrixkoepel in aanwezigheid van 50 ng/μL EGF, 100 ng/μL NOGGIN en 250 ng/μL RSPO (ENR), of samen met fibroblasten in aanwezigheid van EGF en een lage concentratie RSPO (25 ng/μL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig02.jpg"> Figuur 2: Representatieve resultaten van organoïde coculturen. (A) Brightfield-beelden die de groei van de organoïden van dag 1 tot dag 6 laten zien. De brightfield-beelden met de organoïden die samen met PdgfrαH2BeGFP+ fibroblasten zijn gekweekt, tonen ook het nucleaire eGFP-signaal. Schaalbalk = 25 μm. (B) Brightfieldbeelden van de hele matrixkoepel op dag 6. De linkerkolom toont organoïde co-culturen gekweekt in de aanwezigheid van Pdgfrα+ fibroblasten in ER laag of E laag Rlaagmedium. De middelste kolom toont organoïde co-culturen gekweekt in de aanwezigheid van DPP4 + fibroblasten in ER laag of E laag Rlaagmedium. De rechterkolom toont organoïde monoculturen gekweekt in ENR-medium. ENR-medium = EGF (50 ng/μL), NOGGIN (100 ng/μL) en RSPO (250 ng/μL). ERlaag = EFG en 25 ng/μL RSPO. E laagRlaag = 5 ng/μL EGF en 25 ng/μL RSPO. Schaalbalk = 500 μm. (C) Grafiek met de organoïdevormingsefficiëntie (%) (d.w.z. het percentage cellen dat organoïden vormt in verschillende kweekomstandigheden). Elke stip vertegenwoordigt een matrixkoepel en de balk vertegenwoordigt het gemiddelde van alle stippen per voorwaarde. (D) Brightfield en fluorescerend beeld van dag 6 organoïden co-gekweekt met PdgfrαH2BeGFP+ fibroblasten. PdgfrαH2BeGFP+ fibroblasten zijn aanwezig in de koepel, bevestigd aan de organoïden (pijlpunt) en ongebonden maar in contact met de organoïden (volledige pijl). Schaalbalk = 250 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig03.jpg"> Figuur 3: Whole mount staining protocol voor de studie van fibroblast-organoïde interacties . (A) Schematisch overzicht van het gehele mount immunofluorescentie protocol. AB = antilichaam. (B) Immunofluorescentiebeeld van onduidelijke kleuring van de hele berg die een verminderde transparantie en penetratie van het laserlicht laat zien in vergelijking met de geklaarde organoïden. De afwezigheid van een spacer resulteert in afplatting van de organoïde en verlies in organoïde morfologie. (C) Hele montagebeelden van de co-gekweekte organoïden tonen 3D-oppervlakken van de organoïden met VIMENTIN + fibroblasten (Fibr.) gewikkeld rond en in nauw contact met de organoïde. 3D-doorsneden en 2D-vlakbeelden tonen het lumen van de organoïde. Schaalbalk = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig04.jpg"> Figuur 4: Whole mount images tonen verschillende basale en suprabasale celpopulaties. (A) Whole mount kleuring van mono- en co-gekweekte organoïden met PdgfrαH2BeGFP+ fibroblasten met KRT14+ basale cellen in de buitenste laag en KRT13+ gedifferentieerde suprabasale cellen. Schaalbalk = 50 μm. (B) Whole mount kleuring van mono- en co-gekweekte organoïden met PdgfrαH2BeGFP+ fibroblasten met TRP63+ basale cellen in de buitenste laag en KLF4+ gedifferentieerde suprabasale cellen. Schaalbalk = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Tabel 1: Tabel met een beschrijving van de componenten van de organoïde cultuurmedia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/Table1_revised_RE.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Video 1: PdgfrαH2BeGFP+ fibroblast gewikkeld rond en in nauw contact met de organoïde. De video vergezelt het bovenste paneel van figuur 3C. De schaalbalk in figuur 3C is 50 μm en de organoïde is ~120 μm in diameter. VIMENTIN wordt weergegeven in wit, E-CADHERIN in rood, PdgfrαH2BeGFP in groen en DAPI in blauw. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/Video%201_Re.avi" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>
Video 2: DPP4+ fibroblast gewikkeld rond en in nauw contact met de organoïde. De video vergezelt het onderste paneel van figuur 3C. De schaalbalk in figuur 3C is 50 μm en de organoïde is ~120 μm in diameter. VIMENTIN wordt weergegeven in wit, E-CADHERIN in rood en DAPI in blauw. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/Video%202_RE.avi" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>

Organoïde-fibroblast co-culturen bieden een model om de in vivo stamcelniche te bestuderen. Hier wordt een protocol voor slokdarmorganoïde-fibroblast co-culturen beschreven. Bovendien wordt beeldvorming van de hele montage gebruikt om de fibroblast-organoïde interactie te visualiseren.

Functionele karakterisering en visualisatie van slokdarmfibroblasten met behulp van organoïde coculturen

Epithelial stem and progenitor cells contribute to the formation and maintenance of the epithelial barrier throughout life. Most stem and progenitor cell ...

Dus voorlopercellen interageren met de omgeving om weefselhomeostase te behouden. En met behulp van dit protocol kunnen we beginnen te begrijpen hoe fibroblasten het gedrag van slokdarmvoorlopercellen beïnvloeden. Het co-kweeksysteem maakt gebruik van eerst geïsoleerde cellen die de normale slokdarmvoorloperniche nabootsen.Het opruimen van de organoïden vóór beeldvorming maakt de analyse van zowel celinteracties als organoïde morfologie mogelijk. Deze methode kan worden toegepast op menselijke slokdarmorganoïden. Bijvoorbeeld met materialen van gezonde of kankerpatiënten.Zo kunnen we inzicht krijgen in de specifieke functie van kankergeassocieerde fibroblasten. Dissociatie van epitheel- en stromale cellen is van cruciaal belang om levensvatbare organoïden te verkrijgen. Ondervertering zal resulteren in een lage celopbrengst, waarbij oververtering de levensvatbaarheid van de cel en het organoïdevormingsvermogen zal verminderen.Verwijder om te beginnen mechanisch de muscularis externa van de slokdarm met behulp van een dissectiemicroscoop en een tang. Houd het distale uiteinde van de ontlede slokdarm vast met behulp van een tang en gebruik de andere tang om de spier van het distale naar het proximale uiteinde van de slokdarm te grijpen en te trekken. Verwijder en gooi de spierlaag weg.Om de slokdarm in de lengterichting te openen, houdt u het ene uiteinde van de slokdarm vast en steekt u de bal van de microdissectieveerschaar in het lumen om weefselbeschadiging te voorkomen. Snijd de slokdarm open terwijl u het uiteinde vasthoudt en plaats deze in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter of een plaat met 24 putten. Dompel de geopende slokdarm onder in 0,5 milligram per milliliter thermolysine in HBSS en incubeer bij 37 graden Celsius op een rocker shaker gedurende 15 minuten.Na het verwijderen van de slokdarm uit de thermolysine-oplossing scheidt u zorgvuldig het slokdarmepitheel van het stroma. Breng de epitheliale en stromale laag over naar twee afzonderlijke microcentrifugebuizen van 1,5 milliliter met 200 microliter dissociatieoplossing in HBSS en plaats ze op ijs. Hak het slokdarmepitheel fijn met een scherp scalpel en verzamel het gehakte weefsel uit de petrischaal met 200 microliter dissociatieoplossing.Breng het over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg 800 microliter verse dissociatie-oplossing toe en plaats de buis met de gehakte epitheellaag gedurende 60 minuten op een rocker shaker bij 37 graden Celsius. Pipetteer de oplossing ongeveer 20 keer op en neer met behulp van een pipetpunt van 200 microliter om de 15 minuten.Snijd de stromale laag in fijne stukjes in een buis van 1,5 milliliter met 200 microliter dissociatieoplossing met behulp van een dissectieschaar en voeg 800 microliter verse dissociatieoplossing toe. Plaats de buis op een rocker shaker op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten. Na 30 minuten incubatie voor stromale oplossing en 60 minuten incubatie voor epitheeloplossing, pipet u de oplossing nog eens 20 keer op en neer.Breng de stromale oplossing door een 70 micrometer celzeef en de epitheeloplossing door een 40 micrometer celzeef in nieuwe 1,5 millimeter microcentrifugebuizen. Centrifugeer op 300G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg door de overtollige vloeistof te verwijderen met een pipet van één milliliter. Resuspendeerde de pellet in 200 microliter antilichaammengsel.Nadat u het mengsel in een flowcytometriebuis hebt overgebracht, incubeert u de cellen gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Voeg drie milliliter 1% FBS toe en centrifugeer opnieuw gedurende vijf minuten. Resuspendeer vervolgens de cellen in minimaal 200 microliter 1% FBS.Voeg één tot 10.000 verdunde dode celkleurmarkers toe, vijf minuten voor het sorteren van de fax om de levende cellen te isoleren. Meng de gesorteerde epitheelcellen en fibroblasten in een verhouding van één tot twee in een buis. Na het centrifugeren op 300 G gedurende vijf minuten, gooit u het supernatant weg door het voorzichtig te verwijderen met een pipet van 200 microliter.Was de cellen eenmaal door de pellet opnieuw te suspenderen in koud, basisch organoïde medium en centrifugeer opnieuw gedurende vijf minuten. Plaats de cellen op ijs en gooi het supernatant weg door het voorzichtig te verwijderen met een pipet van 200 microliter. Resuspendeer de cellen in 10 microliter matrixmix per koepel en leg de buis terug op ijs.Neem de voorverwarmde 48 putplaat uit de 37 graden Celsius incubator en maak één matrixkoepel per put. Voeg met behulp van een pipet van 20 microliter 200 microliter voorverwarmd, ER-laag medium toe aan de matrixkoepels met organoïde coculturen en ENR-medium aan de respectieve matrixkoepels die alleen epitheelorganoïden bevatten. Plaats de plaat in een incubator op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.En vul het medium de eerste twee dagen aan met 10 micromolaire rotsremmers. Verwijder het organoïde medium en voeg 200 microliter ijskoude PBS toe aan de matrixkoepels. Nadat u de plaat gedurende vijf tot 10 minuten op ijs hebt geplaatst, pipet u op en neer en brengt u de oplossing over in een niet-hechtende buis van 0,6 milliliter.Centrifugeer kort gedurende 30 tot 60 seconden op 100G om de organoïden in de bodem te laten bezinken. Voeg na het verwijderen van de overtollige vloeistof ijskoude PBS toe aan de buis en centrifugeer opnieuw gedurende 30 tot 60 seconden. Verwijder de overtollige vloeistof zoals eerder getoond en fixeer de organoïde met 200 microliter koude, 4% formaldehyde in PBS-oplossing gedurende 30 minuten op ijs.Plaats de buis rechtop om de organoïde te laten zinken en verwijder de formaldehyde. Voeg 500 microliter koude PBS toe om de resterende formaldehyde weg te spoelen. Voeg na het verwijderen van de overtollige PBS 500 microliter blokkeringsbuffer toe.Plaats de buis op een rocker shaker gedurende 60 minuten op kamertemperatuur. Verwijder de blokkerende buffer en resuspensie van de organoïden in 200 microliter blokkeringsbuffer met primaire antilichamen. Leg de organoïden een nacht bij vier graden Celsius weer op een rocker shaker.Verwijder het primaire antilichaammengsel en was de organoïden met 500 microliter 0,02% Triton X 100 in PBS gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal dit drie keer. Verwijder op dezelfde manier de wasbuffer en voeg 200 microliter fluorescentiegeconjugeerd secundair antilichaam toe aan de blokkerende buffer 's nachts bij vier graden Celsius.Was de organoïden opnieuw met 0,02% Triton X 100 in PBS gevolgd door 500 microliter PBS. Voeg na het verwijderen van alle overtollige vloeistof 10 microliter opruimoplossing toe aan de organoïden en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Plaats een 0,05 millimeter dubbelzijdige kleverige vierputafstandhouder op een microscoopglaasje.Voeg de 10 microliter opruimoplossing met de organoïden in één put toe en plaats een afdekstrook bovenop de afstandhouder. Verkrijg beelden met behulp van een confocaal microscopiesysteem. Slokdarmvoorlopercellen worden gesorteerd op basis van hun hoge geïntegreerde bèta-vier en e-cadherine-expressie.De representatieve flowcytometrieplot van epitheelcelisolatie toont het percentage levende cellen van alle afzonderlijke cellen. Het percentage geïsoleerde integrine beta vier en e-cadherine voorlopercellen van alle levende cellen wordt hier weergegeven. De hier getoonde flowcytometrieplots vertegenwoordigen het percentage geïsoleerde DPP4+- en Pdgf-receptor-alfapositieve fibroblasten.De heldere veldbeelden met de organoïden co-gekweekt met Pdgf-receptor alfa H2 BEGFP-positieve fibroblasten tonen het nucleaire EGFP-signaal. De heldere veldbeelden van de hele matrixkoepel op dag zes zijn hier te zien. De organoïdevormende efficiëntie wordt gepresenteerd door deze grafische afbeelding.Elke stip vertegenwoordigt een matrixkoepel en de balk vertegenwoordigt het gemiddelde van alle stippen per voorwaarde. Het heldere veld en fluorescerende beelden van dag zes organoïden co-cultuur met Pdgf receptor alfa-positieve fibroblasten worden hier getoond. De hele mount-afbeeldingen van de co-gekweekte organoïden tonen 3D-oppervlakken van de organoïden met vimentine-positieve fibroblasten gewikkeld rond en in nauw contact met de organoïde.De hele mount-kleuring van mono- en co-gekweekte organoïden met Pdgf-receptor alfa-positieve fibroblasten onthult verschillende basale en suprabasale celpopulaties. De organoïdevormende efficiëntie en de organoïdegrootte worden beïnvloed door de fibroblast die in de co-cultuur is opgenomen. Variaties en resultaten zijn te verwachten bij het gebruik van verschillende fibroblastsubpopulaties.Dezelfde strategie kan worden gebruikt om tumorgeassocieerde fibroblasten bij zowel muizen als mensen te karakteriseren.

functional-characterization-visualization-esophageal-fibroblasts

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video describes an in vitro culture technique to generate human organotypic esophageal constructs by co-culturing primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells within a decellularized porcine scaffold. These 3D culture models mimic the function and physiology of their in vivo tissue counterparts.

Esophageal 3D Raft Culture Model: An In Vitro Culture Technique to Generate Human Esophageal Mucosa Model

We presenteren een protocol om primaire culturen van muis- en menselijke slokdarmstroomacellen met een myofibroblast-fenotype te genereren. De gekweekte cellen hebben een spindelvormige morfologie, drukken α-SMA en vimentin uit en missen epitheliale, hematopoëtische en endotheelcel-oppervlaktemarkers. Gekarakteriseerde stromacellen kunnen worden gebruikt in functionele studies van epitheel-stroma interacties.

Isolatie van Myofibroblasten van muis en mens slokdarm

Dit manuscript beschrijft de productie, karakterisering en toepassingsmogelijkheden van een tissue engineered 3D-oesofageale construct bereid uit normale primaire menselijke slokdarm fibroblast en squameuze epitheelcellen gezaaid binnen een de-cellularized varkens schavot. De resultaten tonen de vorming van een volwassen gelaagd epitheel gelijk aan de normale menselijke esophagus.

Productie, karakterisering en toepassingsmogelijkheden van een 3D Tissue-engineered Human Slokdarmkanker Mucosale Model

Vooruitgang in biomateriaaltechnologieën maakt de ontwikkeling van driedimensionale constructen met meerdere celtypen mogelijk. We hebben electrospinning protocollen ontwikkeld om drie individuele scaffolds te produceren om de belangrijkste structurele cellen van de luchtweg te kweken en zo een 3D in vitro model van de wand van de bronchiolen in de luchtweg te bieden.

Aanpassing van de elektrospinproces te bieden drie unieke omgevingen voor een Tri-layered<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van de Airway Muur

Een gedetailleerd protocol wordt hier gepresenteerd om een in vitro organoïde model van menselijke neusepitheelcellen te beschrijven. Het protocol heeft opties voor metingen die standaard laboratoriumapparatuur vereisen, met extra mogelijkheden voor gespecialiseerde apparatuur en software.

Cultuur en beeldvorming van menselijke nasale epitheliale organoïden

Dit protocol beschrijft de belangrijkste stappen voor het genereren en karakteriseren van muriene orale-oesofageale 3D-organoïden die normale, preneoplastische en plaveiselcelcarcinoomlaesies vertegenwoordigen die worden geïnduceerd via chemische carcinogenese.

Modellering van oraal-oesofageaal plaveiselcelcarcinoom in 3D-organoïden

Hier wordt een protocol verstrekt voor de cultuur van menselijke slokdarmorganoïden en lucht-vloeistof-interfacecultuur. De lucht-vloeistofinterfacecultuur van slokdarmorganoïden kan worden gebruikt om de impact van cytokines op de slokdarmepitheelbarrière te bestuderen.

Driedimensionale celkweekmodellen om de epitheelbarrière bij eosinofiele oesofagitis te onderzoeken 

Er is een kritieke behoefte aan 3D-kankermodellen die heterocellulaire overspraak vastleggen om kankermetastasen te bestuderen. Onze studie presenteert de generatie van heteromulticellulair stromaal-epitheel in een steiger- en steigervrije omgeving die kan worden gebruikt om invasie en cellulaire ruimtelijke verdelingen te bestuderen.

Heteromulticellulaire stromale cellen in steigervrije 3D-culturen van epitheelkankercellen om invasie te stimuleren

Het huidige protocol beschrijft de opstelling en histologische analyse van slokdarmorganoïdemodellen die verschillende stadia van tumorprogressie vertegenwoordigen. Deze methode stelt onderzoekers in staat om veranderingen in cellulaire morfologie, ruimtelijke organisatie en moleculaire markerexpressiepatronen te bestuderen tijdens de overgang van normale naar kankerweefsels.

Oprichting en histologische analyse van slokdarmorganoïden die de progressie van normale naar kankerachtige weefsels modelleren

Dit protocol beschrijft een methode om kankerorganoïden, carcinoma-geassocieerde fibroblasten (AF's) en niet-tumor-geassocieerde fibroblasten (CF's) gelijktijdig te isoleren van dezelfde patiënt met slokdarmplaveiselcelcarcinoom (ESCC). Het gebruik van deze patiënt-gematchte materialen zou problemen door interpatibulaire variabiliteit kunnen voorkomen en een passend experimenteel platform bieden voor ESCC-onderzoek.

Vestiging van tumororganoïden, carcinoom-geassocieerde fibroblasten en tegenhangende fibroblasten van dezelfde slokdarmkankerpatiënt

Leer een co-cultuurmethode met slokdarmorganoïden en fibroblasten om stamcelgedrag te bestuderen. Dit protocol maakt whole mount imaging mogelijk voor visualisatie van celinteracties en morfologie.

Functionele karakterisering en visualisatie van slokdarmfibroblasten met behulp van organoïde coculturen

Meer video's verkennen