Functionele karakterisering en visualisatie van slokdarmfibroblasten met behulp van organoïde coculturen

Dus voorlopercellen interageren met de omgeving om weefselhomeostase te behouden. En met behulp van dit protocol kunnen we beginnen te begrijpen hoe fibroblasten het gedrag van slokdarmvoorlopercellen beïnvloeden. Het co-kweeksysteem maakt gebruik van eerst geïsoleerde cellen die de normale slokdarmvoorloperniche nabootsen.

Het opruimen van de organoïden vóór beeldvorming maakt de analyse van zowel celinteracties als organoïde morfologie mogelijk. Deze methode kan worden toegepast op menselijke slokdarmorganoïden. Bijvoorbeeld met materialen van gezonde of kankerpatiënten.

Zo kunnen we inzicht krijgen in de specifieke functie van kankergeassocieerde fibroblasten. Dissociatie van epitheel- en stromale cellen is van cruciaal belang om levensvatbare organoïden te verkrijgen. Ondervertering zal resulteren in een lage celopbrengst, waarbij oververtering de levensvatbaarheid van de cel en het organoïdevormingsvermogen zal verminderen.

Verwijder om te beginnen mechanisch de muscularis externa van de slokdarm met behulp van een dissectiemicroscoop en een tang. Houd het distale uiteinde van de ontlede slokdarm vast met behulp van een tang en gebruik de andere tang om de spier van het distale naar het proximale uiteinde van de slokdarm te grijpen en te trekken. Verwijder en gooi de spierlaag weg.

Om de slokdarm in de lengterichting te openen, houdt u het ene uiteinde van de slokdarm vast en steekt u de bal van de microdissectieveerschaar in het lumen om weefselbeschadiging te voorkomen. Snijd de slokdarm open terwijl u het uiteinde vasthoudt en plaats deze in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter of een plaat met 24 putten. Dompel de geopende slokdarm onder in 0,5 milligram per milliliter thermolysine in HBSS en incubeer bij 37 graden Celsius op een rocker shaker gedurende 15 minuten.

Na het verwijderen van de slokdarm uit de thermolysine-oplossing scheidt u zorgvuldig het slokdarmepitheel van het stroma. Breng de epitheliale en stromale laag over naar twee afzonderlijke microcentrifugebuizen van 1,5 milliliter met 200 microliter dissociatieoplossing in HBSS en plaats ze op ijs. Hak het slokdarmepitheel fijn met een scherp scalpel en verzamel het gehakte weefsel uit de petrischaal met 200 microliter dissociatieoplossing.

Breng het over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg 800 microliter verse dissociatie-oplossing toe en plaats de buis met de gehakte epitheellaag gedurende 60 minuten op een rocker shaker bij 37 graden Celsius. Pipetteer de oplossing ongeveer 20 keer op en neer met behulp van een pipetpunt van 200 microliter om de 15 minuten.

Snijd de stromale laag in fijne stukjes in een buis van 1,5 milliliter met 200 microliter dissociatieoplossing met behulp van een dissectieschaar en voeg 800 microliter verse dissociatieoplossing toe. Plaats de buis op een rocker shaker op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten. Na 30 minuten incubatie voor stromale oplossing en 60 minuten incubatie voor epitheeloplossing, pipet u de oplossing nog eens 20 keer op en neer.

Breng de stromale oplossing door een 70 micrometer celzeef en de epitheeloplossing door een 40 micrometer celzeef in nieuwe 1,5 millimeter microcentrifugebuizen. Centrifugeer op 300G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg door de overtollige vloeistof te verwijderen met een pipet van één milliliter. Resuspendeerde de pellet in 200 microliter antilichaammengsel.

Nadat u het mengsel in een flowcytometriebuis hebt overgebracht, incubeert u de cellen gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Voeg drie milliliter 1% FBS toe en centrifugeer opnieuw gedurende vijf minuten. Resuspendeer vervolgens de cellen in minimaal 200 microliter 1% FBS.

Voeg één tot 10.000 verdunde dode celkleurmarkers toe, vijf minuten voor het sorteren van de fax om de levende cellen te isoleren. Meng de gesorteerde epitheelcellen en fibroblasten in een verhouding van één tot twee in een buis. Na het centrifugeren op 300 G gedurende vijf minuten, gooit u het supernatant weg door het voorzichtig te verwijderen met een pipet van 200 microliter.

Was de cellen eenmaal door de pellet opnieuw te suspenderen in koud, basisch organoïde medium en centrifugeer opnieuw gedurende vijf minuten. Plaats de cellen op ijs en gooi het supernatant weg door het voorzichtig te verwijderen met een pipet van 200 microliter. Resuspendeer de cellen in 10 microliter matrixmix per koepel en leg de buis terug op ijs.

Neem de voorverwarmde 48 putplaat uit de 37 graden Celsius incubator en maak één matrixkoepel per put. Voeg met behulp van een pipet van 20 microliter 200 microliter voorverwarmd, ER-laag medium toe aan de matrixkoepels met organoïde coculturen en ENR-medium aan de respectieve matrixkoepels die alleen epitheelorganoïden bevatten. Plaats de plaat in een incubator op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

En vul het medium de eerste twee dagen aan met 10 micromolaire rotsremmers. Verwijder het organoïde medium en voeg 200 microliter ijskoude PBS toe aan de matrixkoepels. Nadat u de plaat gedurende vijf tot 10 minuten op ijs hebt geplaatst, pipet u op en neer en brengt u de oplossing over in een niet-hechtende buis van 0,6 milliliter.

Centrifugeer kort gedurende 30 tot 60 seconden op 100G om de organoïden in de bodem te laten bezinken. Voeg na het verwijderen van de overtollige vloeistof ijskoude PBS toe aan de buis en centrifugeer opnieuw gedurende 30 tot 60 seconden. Verwijder de overtollige vloeistof zoals eerder getoond en fixeer de organoïde met 200 microliter koude, 4% formaldehyde in PBS-oplossing gedurende 30 minuten op ijs.

Plaats de buis rechtop om de organoïde te laten zinken en verwijder de formaldehyde. Voeg 500 microliter koude PBS toe om de resterende formaldehyde weg te spoelen. Voeg na het verwijderen van de overtollige PBS 500 microliter blokkeringsbuffer toe.

Plaats de buis op een rocker shaker gedurende 60 minuten op kamertemperatuur. Verwijder de blokkerende buffer en resuspensie van de organoïden in 200 microliter blokkeringsbuffer met primaire antilichamen. Leg de organoïden een nacht bij vier graden Celsius weer op een rocker shaker.

Verwijder het primaire antilichaammengsel en was de organoïden met 500 microliter 0,02% Triton X 100 in PBS gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal dit drie keer. Verwijder op dezelfde manier de wasbuffer en voeg 200 microliter fluorescentiegeconjugeerd secundair antilichaam toe aan de blokkerende buffer 's nachts bij vier graden Celsius.

Was de organoïden opnieuw met 0,02% Triton X 100 in PBS gevolgd door 500 microliter PBS. Voeg na het verwijderen van alle overtollige vloeistof 10 microliter opruimoplossing toe aan de organoïden en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Plaats een 0,05 millimeter dubbelzijdige kleverige vierputafstandhouder op een microscoopglaasje.

Voeg de 10 microliter opruimoplossing met de organoïden in één put toe en plaats een afdekstrook bovenop de afstandhouder. Verkrijg beelden met behulp van een confocaal microscopiesysteem. Slokdarmvoorlopercellen worden gesorteerd op basis van hun hoge geïntegreerde bèta-vier en e-cadherine-expressie.

De representatieve flowcytometrieplot van epitheelcelisolatie toont het percentage levende cellen van alle afzonderlijke cellen. Het percentage geïsoleerde integrine beta vier en e-cadherine voorlopercellen van alle levende cellen wordt hier weergegeven. De hier getoonde flowcytometrieplots vertegenwoordigen het percentage geïsoleerde DPP4+- en Pdgf-receptor-alfapositieve fibroblasten.

De heldere veldbeelden met de organoïden co-gekweekt met Pdgf-receptor alfa H2 BEGFP-positieve fibroblasten tonen het nucleaire EGFP-signaal. De heldere veldbeelden van de hele matrixkoepel op dag zes zijn hier te zien. De organoïdevormende efficiëntie wordt gepresenteerd door deze grafische afbeelding.

Elke stip vertegenwoordigt een matrixkoepel en de balk vertegenwoordigt het gemiddelde van alle stippen per voorwaarde. Het heldere veld en fluorescerende beelden van dag zes organoïden co-cultuur met Pdgf receptor alfa-positieve fibroblasten worden hier getoond. De hele mount-afbeeldingen van de co-gekweekte organoïden tonen 3D-oppervlakken van de organoïden met vimentine-positieve fibroblasten gewikkeld rond en in nauw contact met de organoïde.

De hele mount-kleuring van mono- en co-gekweekte organoïden met Pdgf-receptor alfa-positieve fibroblasten onthult verschillende basale en suprabasale celpopulaties. De organoïdevormende efficiëntie en de organoïdegrootte worden beïnvloed door de fibroblast die in de co-cultuur is opgenomen. Variaties en resultaten zijn te verwachten bij het gebruik van verschillende fibroblastsubpopulaties.

Dezelfde strategie kan worden gebruikt om tumorgeassocieerde fibroblasten bij zowel muizen als mensen te karakteriseren.