Lichtgeïnduceerde dielectroforese voor het karakteriseren van het elektrische gedrag van menselijke mesenchymale stamcellen

Dit licht-geïnduceerde dielectroforeseprotocol of LiDEP biedt een stapsgewijze methode voor de karakterisering van menselijke mesenchymale stamcellen. Deze methode kan helpen antwoorden te geven over de heterogeniteit van stamcelmonsters. Het voordeel van LiDEP is de mogelijkheid om real-time wijzigingen aan te brengen in de virtuele elektrodeconfiguratie als reactie op heterogeniteit van stamcellen, wat niet mogelijk is voor traditionele DEP-methoden.

Een nieuwe gebruiker van deze techniek kan moeite hebben met het condenseren van het projectorlicht dat voldoende op het microfluïdische apparaat is gecondenseerd om de virtuele elektrode te maken. We raden u aan de installatie opnieuw te configureren totdat deze werkt. Zuri Rashad, een afgestudeerde student van mijn laboratorium, zal helpen bij het demonstreren van de procedure.

Om te beginnen bereidt u het microkanaal voor door gaten met een diameter van vier millimeter op een dubbelzijdige tape te ponsen op ongeveer vijf tot zes millimeter van de rand van de kortere dimensie en gecentreerd tussen de langere zijden van de tape. Snijd met behulp van een scalpel twee rechte lijnen drie millimeter uit elkaar over de gaten, zodat de beschermende vellen aan beide zijden van de tape tijdens het hele microkanaalsnijden zitten. Markeer de hele locatie met een afwasbare marker en zorg ervoor dat de geboorde gaten uitlijnen met de gaten die in de dubbelzijdige tape zijn gestanst.

Deze twee gaten zullen worden gebruikt als de inlaat- en uitlaatgaten van het microfluïdische apparaat. Boor twee gaten met een diameter van drie millimeter in de bovenste ITO-glasplaat. Plaats vervolgens op de bovenkant van het geboorde ITO-gecoate glas de lange rand van de tape die is uitgelijnd met de lange rand van het glas.

Verwijder één kant van de beschermfolie op de dubbelzijdige tape. Lijn de gaten van de tape in de bovenste ITO-glasplaat uit en druk ze voorzichtig tegen elkaar en verwijder luchtzakken, vooral in de buurt van het microkanaal. Verwijder de andere beschermfolie van de dubbelzijdige tape.

Druk op de molybdeen en amorfe silicium gecoate ITO-glasplaat die overeenkomt met de rand van de fotogeleidende dia tegenover de twee millimeter spelingszijde met de rand van de dubbelzijdige tape naar het midden van de bovenste ITO-glasplaat. Zo ontstaat er een kater tussen de ITO en de fotogeleidende ITO-dia. Druk op een vlak oppervlak om een goede hechting te garanderen en knip de overtollige tape aan de zijkanten af.

Om de functiegenerator aan te sluiten, brengt u kopertape aan op de randen van de ITO-glaslaag en de fotogeleidende gecoate ITO-glaslaag. Wikkel de tape aan de zijkant van de ITO of fotogeleidend materiaal vanaf de rand van de dubbelzijdige tape tot ongeveer drie centimeter op de ongecoate kant van het glassubstraat. Om een succesvolle fabricage van het apparaat te garanderen, gebruikt u een hoogtemeter om de weerstandsmeting te testen tussen de gecoate dia's van beide glassubstraten en de kopertape die aan het glas was bevestigd.

Voeg 25 milliliter ultrapuur water toe aan een conische buis van 50 milliliter met 4,25 gram sucrose en 0,15 gram glucose. Meng goed tot de helft van de sucrose en glucose oplost en vul aan met ultrapuur water tot 50 milliliter. Meng vervolgens krachtig deze DEP-buffer totdat deze volledig is opgelost.

Breng 20 milliliter van de bereide sucrose- en glucoseoplossing in een conische buis van 50 milliliter. Voeg 0,1 gram runderserumalbumine, BSA, toe aan de buis. Vortex goed totdat alle BSA oplost om een uiteindelijke concentratie van 0,5% BSA in de DEP-buffer te krijgen.

Plaats één maal 10 tot de zes menselijke mesenchymale stamcellen of HMSC's of menselijke embryonale nier, HEK293 gesuspendeerd in één milliliter groeimedium in een centrifugebuis van 10 milliliter. Centrifuge, de HEK293 cellen op 201 G gedurende vijf minuten en de HMSCs op 290 G gedurende 10 minuten. Na centrifugeren, zuig het supernatant op.

01 En resuspendien de cellen voorzichtig terug in één milliliter DEP-bufferoplossing met 0,5% BSA. Herhaal de centrifugatie nog twee keer en resuspensie van de cellen in de DEP-buffer met 0,5% BSA. Bereid de experimentele setup-items voor, zoals een laptop, projector, objectieflens, digitale microscoop en een functiegenerator voor het kwantificeren van de cellulaire reacties op LiDEP.

Plaats de 10x objectieflens, LiDEP-chip en houder bovenop de projectorlens. Gebruik de laptop om lichtprojecties zoals ster, diamant, drie lijnen en ovaal te ontwerpen en sluit de laptop aan op de projector. Sluit de LiDEP-chip aan op de functiegenerator om het ac-elektrische veld toe te passen.

Om de cellen te observeren die de LiDEP-kracht ervaren, gebruikt u een digitale microscoop voor het in beeld brengen van NVIDIA-opname. Na het voltooien van de installatie, spoel het microkanaal met 70% ethanol en spoel vervolgens 0,5% BSA-oplossing om de ethanol in eerdere cellen te verwijderen. Herhaal de spoeling drie keer om ervoor te zorgen dat deze volledig wordt weggespoeld, omdat eerder blootgestelde cellen aan het DEP-veld anders reageren dan verse cellen en de gegevensverzameling kunnen verstoren.

Verwijder de 0,5% BSA-oplossing met een pipet. Stel vervolgens de functiegenerator in op de gewenste spanning en frequentie. Voeg voorzichtig 70 microliter van de voorbereide celsuspensie toe aan het microkanaal van het apparaat met behulp van een kleinere pipetpunt, waarbij u deze iets in het gat naar het microkanaal kantelt om morsen te voorkomen vanwege de dunheid van het microkanaal.

Veeg de toegangsoplossing weg met papieren doekjes voor eenmalig gebruik en gooi ze weg in biologisch gevaarlijk afval. Projecteer vervolgens de gewenste virtuele elektrogeometriecirkels, diamanten, sterren of parallelle lijnen op de LiDEP-chip. Stel in de digitale microscoopsoftware de videolengte in op drie minuten.

Stel een labtimer in op twee minuten en 30 seconden. Zodra de cellen stationair zijn in het microkanaal van de LiDEP-chip, drukt u op start in de digitale microscoopsoftware om het video-opnameproces te starten. Druk na 10 seconden op de aan-knop van de kanaaluitgang van de functiegenerator om het elektrische veld van de wisselstroom toe te passen en druk op start voor de timer.

Bewaak het DEP-gedrag van de cel door de digitale microscoop en voorkom schudden of beweging rond de opstelling. Zodra de timer afgaat, drukt u op de aan-knop van de kanaaluitgang van de functiegenerator, waardoor de kanaaluitgang wordt uitgeschakeld en het elektrische wisselstroomveld niet langer door de elektroden wordt geleverd. Stop de video-opname na drie minuten en sla deze op voor toekomstige analyse.

Pipetteer de cellen uit het uitlaatuiteinde van de LiDEP-chip door langzaam 60 microliter DEP-buffer met 0,5% BSA in het microkanaal te duwen en tegelijkertijd de uitlaat te verzamelen. Ga door totdat er weinig tot geen cellen in het microkanaal zijn en herhaal de DEP met alle frequenties zoals aangetoond. De DEP-responsen in termen van snelheid voor de HMSC's en hun levensvatbaarheidspercentage werden bepaald.

De metingen van de positieve DEP-responsen bij vijf, 10, amd 20 spanningspiek tot piek of VPP toonden aan dat de cellen bewogen met een gemiddelde snelheid van respectievelijk 0,025, 0,036 en 0,051 micrometer per seconde. De levensvatbaarheidsbevindingen van de HMSC's na het ervaren van de DEP-kracht toonden aan dat de hogere spanningen over het algemeen resulteerden in een lagere levensvatbaarheid van de cellen met 57% van de cellen levensvatbaar bij 20 VPP. Witte, gele, rode en blauw gekleurde elektroden werden gekozen voor deze studie, maar de verlichting door de LiDEP-dieptechip werd beïnvloed door de fotogeleidende laag, die een roodoranje kleur had.

Vandaar dat de geprojecteerde witte elektrode geel leek met een witte binnenkant, de rode elektrode oranje met een rode omtrek en de blauwe elektrode lichtgroen. Dit fenomeen suggereert dat geel en wit het sterkste DEP-veld hadden, terwijl blauw en rood zwakker waren. De DEP-responsen van HMC's werden gemeten met LiDEP in drie diepteanalysatoren bij 10 VPP.

Bij LiDEP was er een verval in de positieve DEP-respons van 30 kilohertz naar 20 megahertz. Van de drie analysatoren namen de cellen in de positieve DEP toe van 37 tot 255 kilohertz en daalden in positieve DEP van 1.772 kilohertz tot 20 megahertz. Twee belangrijke componenten in deze methode zijn een sterke lichtbron en een solide elektrische verbinding om de productie van het elektrische veld en celmanipulatie te garanderen.

We observeerden celspin als reactie op virtuele elektroden. Elektrorotatie is dus een andere celanalysemethode die kan worden uitgevoerd. Elektrorotatie zou informatie verschaffen over hmsc's heterogeniteit en zeldzame subpopulaties.