Isolatie en transcriptoomanalyse van plantenceltypen

Transcriptoomanalyse op enkele cel- of celtypen kan het subtiele verschil van genexpressie detecteren dat wordt gemaskeerd door heterogeniteit, wat een krachtig hulpmiddel is om de uitgebreide intracellulaire regulerende mechanismen bloot te leggen. Fluorescentie geactiveerde celsortering gevolgd door RN-seq-analyse kan worden uitgevoerd op zowel eencellige als bulkceltypemodus met een hoge transcriptdetectiegevoeligheid en compatibiliteit met andere multi-omische benaderingen. Nieuwe gebruikers van dit protocol moeten aandacht besteden aan enkele stappen in de protoplastsortering en RNA-seq-bibliotheekvoorbereiding.

Samen met Jun Zhang zal Dr.Rongrong Xie, een postdoc in ons laboratorium, helpen bij het demonstreren van de procedure. Om te beginnen, doe de Arabidopsis thaliana wild type en fluorescerende marker lijn zaden in 20% bleekmiddel en incuberen met behulp van een roterende incubator bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten om de zaden te steriliseren. Spoel tijdens het werken op een steriele bank de zaden drie tot vijf keer af in dubbel gedestilleerd water.

Plak de wild type en reporter line zaden op halfsterkte MS medium met 0,8% gewicht per volume agar. Stratificeer de planten gedurende twee dagen op vier graden Celsius. Laat ze vervolgens vijf dagen verticaal groeien bij 23 graden Celsius onder 16-uurs licht en 18-uurs donkere cycli.

Ontdooi de protoplastische oplossingen die oplossing A en oplossing B worden genoemd voorzichtig op ijs voorafgaand aan het experiment. Knip de wortels van de planten af met een schoon mes of schaar en hak de wortels in stukjes van ongeveer 0,5 centimeter. Dompel de gehakte wortels onder in 1,5 milliliter oplossing B, gevolgd door een zachte rotatie bij kamertemperatuur gedurende 1,5 tot 2 uur.

Filtreer de resulterende wortelprotoplasten door een zeefgaas van 40 micron en spoel het gaas af met één tot twee milliliter oplossing A.Centrifugeer de gecombineerde filtraten bij 300 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg met behulp van een pipet, resuspensie van de celkorrel in 500 tot 600 microliter oplossing A en plaats deze onmiddellijk op ijs. Breng voor het sorteren van cellen de geresuspendeerde celoplossing over in een nieuwe reageerbuis van vijf milliliter.

Vul de mantelvloeistoftank en controleer de afvaltank. Schakel vervolgens de fluorescentie-geactiveerde celsorteer- of FACS-machine in. Voer de instrumentinstellingen en automatische kalibratiestappen uit op de sorteerder.

Selecteer de fluorescentiekanalen en gebruik een wild type plant zonder fluorescentie als basislijncontrole. Pas de sorteerpoort aan op basis van de fluorescentie-intensiteit en voorwaartse verstrooiing en zijverstrooiing singlets. Na het toevoegen van 500 microliter oplossing A in een opvangbuis van 1,5 milliliter, begint u met sorteren en verzamelt u 2.000 tot 3.000 cellen per buis.

Plaats de monsters na het sorteren onmiddellijk op ijs. Centrifugeer de opvangbuis met de cellen bij 300 G en vier graden Celsius gedurende vijf minuten en verwijder het supernatant met een pipet. Neem twee microliter gesorteerde cellen en controleer op fluorescentie met behulp van een fluorescentiemicroscoop.

Bewaar de gesorteerde cellen bij min 80 graden Celsius als ze niet onmiddellijk worden gebruikt. Voor het sorteren van een enkele celindex plaatst u de 96-putsplaat met membraan in de adapter. Kalibreer de positie van de plaat zodat de druppel in het middelste gat van de plaat valt.

Verwijder het membraan van de 96-putplaat en plaats de 96-putplaat in de adapter. Selecteer de sorteermodus met één cel tijdens het sorteren. Voer het doelaantal gesorteerde cellen als één in en begin met sorteren.

Voordat u met het experiment begint, reinigt u de bank met een oppervlakteontsmettingsmiddel en 75% ethanol. Gebruik alle apparatuur alleen voor het sequentiëren van bibliotheekvoorbereiding. Nadat u een microliter vers bereid mengsel A aan het gesorteerde monster hebt toegevoegd, maalt u het met een steriele stamper.

Vul met behulp van RNAse-vrij water het volume aan tot 14 microliter. Breng vervolgens elk monster over in een dunwandige PCR-buis van 0,2 milliliter. Bereid vervolgens mengsel B.Voeg 4,4 microliter in mengsel B toe aan elke PCR-buis met monsters en meng door voorzichtig pipetteren.

Incubeer de monsters bij 72 graden Celsius gedurende drie minuten. Na incubatie zet u de monsters onmiddellijk op ijs om de oligo dT te hybridiseren naar de poly-A-staart. Bereid het omgekeerde transcriptiereactiemengsel of mengsel C in een 21,6 microliter ervan voor elke buis die de monsters bevat.

Onderwerp de monsters aan een omgekeerde transcriptiereactie in een gemeenschappelijk PCR-instrument volgens het reverse transcriptieprogramma. Voeg 40,8 microliter van het vers bereide voorversterkingsreactiemengsel of mengsel D toe aan het omgekeerde transcriptiereactieproduct en voer het voorversterkingsprogramma uit. De amplificatiecyclus kan worden bepaald door kwantitatieve PCR wanneer de reactie net de exponentiële fase ingaat.

Om de voorversterkingsreactieproducten te zuiveren, brengt u de voorversterkte producten over van een PCR-buis naar een buis van 1,5 milliliter. Voeg 48 microliter AMPure XP-kralen toe aan elk monster en meng voorzichtig door pipetteren voor incubatie. Plaats de buisjes van 1,5 milliliter met de monsters en kralen gedurende vijf minuten op een magnetische scheidingsstandaard.

Gooi het supernatant voorzichtig uit de monsters weg zonder de kralen te verstoren. Nadat je ze opnieuw hebt gesuspendeerd in 200 microliter 80% ethanol, plaats je ze nog eens drie minuten op de magnetische scheidingsstandaard. Na het weggooien van de ethanol die supernatant bevat, drogen de monsters aan de lucht in een buis gedurende 10 minuten.

Resuspendeer de kralen in 20 microliter nucleasevrij water en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Plaats ze vervolgens vijf minuten op de magnetische scheidingsstandaard. Breng met behulp van een pipet 18 microliter van het supernatant van elke buis over in een nieuwe centrifugebuis van 1,5 milliliter.

Volg ten slotte de stappen die in de tekst worden beschreven om de pre-bibliotheek te karakteriseren, gevolgd door bibliotheekconstructie, zuivering en kwantificering. De fluorescerende Arabidopsis thaliana markers lijnen werden ontwikkeld door fluorescerende eiwitten te fuseren met genen die specifiek tot expressie komen in doelceltypen of door gebruik te maken van enhancer trap lijnen. De fluorescentie-specifieke gemarkeerde protoplasten werden met succes gesorteerd op basis van de fluorescentie-intensiteit en voorwaartse verstrooiing en zijverstrooiing singlets.

De gesorteerde cellen werden gevisualiseerd met behulp van brightfield- en fluorescentiebeeldvorming. De representatieve resultaten van de RNA-sequencing bibliotheek van ongeveer 2.000 xyleem pool pericycle cellen, laterale wortel primordiale cellen, endodermis of cortex cellen, en laterale wortel cap cellen worden getoond. Een kleine bibliotheek met primer- of adapterdimerpieken kan na grootteselectie nog steeds worden gesequenced.

Een bibliotheek met een abnormale grootteverdeling duidde op een mislukte bibliotheekvoorbereiding. De genexpressiepatronen werden geanalyseerd. De genen verrijkt in een van de vier wortelceltypen werden geclusterd en weergegeven in een heatmap die de specificiteit van genexpressies tussen verschillende celtypen laat zien.

Hoge kwaliteit en zuiverheid van doelcellen door middel van correcte gating en sortering en het voorkomen van RNA-degradatie zijn de sleutel tot succesvolle bibliotheekconstructie. Voor RNA-seq in de single cell-modus zijn onlangs verschillende methoden gemeld die zijn geïntegreerd met de unieke moleculaire identificatie die de prestaties aanzienlijk hebben verbeterd.