Gelijktijdige beoordeling van verwantschap, delingsgetal en fenotype via flowcytometrie voor hematopoëtische stam- en voorlopercellen

Weinig methoden maken het mogelijk om snel de functionaliteit van hematopoietische voorlopercellen te beoordelen. Dit protocol meet de impact van de eerste celdelingen op het lot en de inzet van cellen. Dit protocol maakt het mogelijk om gelijktijdig deling en differentiatie te meten op eencellig niveau en met een hoge doorvoer zonder complexe en uitgebreide manipulatie te vereisen.

Deze methode is geschikt voor elke hematopoietische populatie die in cultuur kan worden gehouden. Het kan dus gemakkelijk worden toegepast op kankerbiologie, immunologie en ontwikkelingsbiologie. Om te beginnen, aliquot 250 microliter van de CD34 + fractie gelijkelijk in vier 15 milliliter polypropyleen buizen.

Label de buizen zoals beschreven in het tekstmanuscript. Aliquot 250 microliter van de CD34-fractie in nog eens vier polypropyleenbuizen van 15 milliliter en label de buizen. Bereid CFSE high en CSFE low oplossingen voor zoals beschreven in het manuscript van de tekst.

Voeg 250 microliter van de CFSE-hoogoplossing toe aan de CF- en CV-buis, 250 microliter van de CFSE-laagoplossing aan de VC-buis en 250 microliter Dulbecco's Modified Eagle Medium, of DMEM, zonder foetaal runderserum, of FBS, aan de VI-buis. Om een efficiënte mix van celsuspensie in celkleurstof te garanderen, kantelt u de buis 90 graden en deponeert u de CFSE-oplossingen op de buiswand. Houd vervolgens de buis verticaal en meng drie of vier keer om een snelle menging van de CFSE-oplossingen met de geresuspendeerde cellen te garanderen.

Incubeer de suspensie bij 37 graden Celsius gedurende acht minuten. Voeg na incubatie vijf milliliter DMEM met 10% FBS toe en plaats de buizen gedurende vijf minuten op 37 graden Celsius. Draai de buisjes vijf minuten op 300 G.

Verwijder het supernatant via aspiratie zonder de pellet te verstoren en was de pellet met vijf milliliter PBS, ETDA. Draai de buizen opnieuw en gooi het supernatant weg voordat u de pellet opnieuw in 40 microliter PBS, ETDA, suspenseert. Om de CD34+ cellen te kleuren, bereidt u een hoofdmengsel van antilichamen in een enkele buis van 0,5 milliliter.

Voeg zeven microliter uit de antilichaammastermix toe aan elk van de vier CD34+-condities. Resuspendeer de cellen in kleurbuffer met elk ongeveer 500 microliter voor de kralen in CD34+cellen en één milliliter voor de CD34-buisjes. Voor het sorteren van cellen stelt u de gatingstrategie in door puntplotdiagrammen te maken.

Visualiseer eerst de cellen op een FSCA versus SSCA dot plot en dubbelklik op de Polygon gating tool om de populatie met lage side scatter te selecteren. Label deze nieuw gemaakte poort als Cellen. Klik in de volgende dot plot, FSCA versus FSCH, met de rechtermuisknop op de plot en selecteer de gate Cells in het vervolgkeuzemenu door erop te klikken.

Gebruik hetzelfde gating-gereedschap om een strakke populatie op de diagonaal tussen de twee assen te selecteren. Label deze poort als Enkele cellen. In de derde dot plot, APC versus FSH-H, worden de populatie Single Cells weergegeven en worden de cellen negatief gegate voor de expressie van APC-afstamming.

Label deze nieuw gecreëerde populatie als Afstammingsnegatief. In de vierde plot, CFSE versus CTV, toont u de populatie Lineage Negative en maakt u vier afzonderlijke poorten, één voor elke kleurstofcombinatie. Gate VI wordt hier als voorbeeld getoond.

Gebruik de vijfde en zesde plot om de voorlopers van belang te identificeren. Royaal poort CD34+CD38-bevolking en de CD34+CD38+in het vijfde perceel. Selecteer vervolgens de CD34 + CD38-populatie in de zesde plot en teken drie poorten voor LMPP, HSC en MPP.

Voer de CD34+fracties uit en registreer ten minste 5.000 gebeurtenissen in de poort met één cel. Pas de poort aan voor elke kleurstofcombinatie en stel een strakke poort in om een homogene populatie te selecteren. Bereid de sjabloon Plaatsortering voor met de indeling Experimentsorteer.

De putten met de naam CD34 bevatten 5.000 tot 10.000 cellen gesorteerd op de CF, CV, VC, VI poort. De bulkputten bevatten 500 cellen gesorteerd op de poort CD34+CD38-De eencellige putten bevatten slechts één gebeurtenis per celdelingskleurstofcombinatie per put, dus vier gebeurtenissen per put in totaal. Begin vervolgens met het sorteren van de CD34-CF in de yield purity-modus.

Klik op de knop Verkrijgen en vervolgens op de knop Sorteren. Klik op Verwerven en vervolgens op de knop Sorteren, zodat u 0160 als zuiverheidsklasse hebt aangevinkt. Sorteer ten slotte de cellen van belang, één cel per put, in een enkele celzuiverheid, en zorg ervoor dat u de optie Index sorteren hebt aangevinkt.

Centrifugeer de plaat gedurende vijf minuten op 300 G en verwijder het supernatant door de plaat onder de kap snel om te keren over een papieren handdoek. Voeg acht microliter staande buffer toe aan de putten A1 tot en met A4, gevolgd door acht microliter van het mengsel toe te voegen aan de andere putten. Was de cellen door 100 microliter kleurbuffer per put toe te voegen met behulp van een meerkanaals pipet.

Centrifugeer en verwijder het supernatant voordat u de cellen opnieuw in 85 microliter kleuringsbuffer plaatst. Start de analyse op de flowcytometer in acquisitiemodus met behulp van de speciale sjabloon en klik op Aangepast. Nadat u de fluoroforen van belang in de lijst hebt geselecteerd, stelt u de plaatopstelling in volgens de plaatsjabloon gecorrigeerd voor het aantal putten met ten minste één cel.

Vink de optie Agitatie aan en selecteer 100 microliter als de limiet voor het acquisitievolume. Stel vervolgens de acquisitiesnelheid niet hoger in dan één microliter per seconde, omdat een lagere snelheid het totale geanalyseerde volume per put verbetert. Voor representatieve gating, voeg de verschillende bulkputten samen in één bestand.

Nadat u op de optie Populaties aaneenschakelen hebt geklikt, selecteert u Alle niet-gecompenseerde parameters in het menu Parameters en klikt u vervolgens op Aaneenschakelen. Upload het aaneengeschakelde bestand naar de werkruimte en pas vervolgens de compensatiematrix toe via slepen en neerzetten. Cellabels met CV en VC hebben een getransformeerde waarde nodig.

Klik op Tools and Derive Parameter om de getransformeerde waarde te krijgen. Plak de aangegeven formule in het formulevak. Pas de gating toe op elke kleur afzonderlijk als een histogramplot.

Stel voor CF en VI respectievelijk CFSE-A en CTV-A in op de X-as. Voor CV en VC stelt u de nieuw afgeleide parameter in op de X-as en stelt u vervolgens poorten in die overeenkomen met elke piek. Pas de gating toe op elke afzonderlijke afzonderlijke celput.

Zorg ervoor dat u de afgeleide parameter aan elk geanalyseerd goed toevoegt. Controleer handmatig elke kleurpoort voor elke put om gebeurtenissen te detecteren die onjuist zijn toegewezen aan een bepaalde piek. De flowcytometrie-analyse na celkweek vereist nauwkeurige gating om de verwantschap van elke individuele cel vast te stellen, samen met de cellulaire fenotypering.

Piekdefinitie en -toewijzing zijn cruciale aspecten van flowcytometrie-analyse. De histogrammen tonen twee voorbeelden van families verspreid over meerdere pieken, een van twee vergelijkbare intensiteitspieken en een met twee verschillende intensiteitspieken. Verschillende soorten gegevensrepresentatie en statistische tests worden hier getoond voor twee afzonderlijke experimenten die na 72 uur worden uitgevoerd voor HSC's en MPP's.

De heatmap voor de aandoening HSC-differentiatie vertegenwoordigt verschillende celfamilies, zowel in celloten als celdelingen. Het histogram waarin het lot van HSC's en MPP's afgeleide celfamilies wordt vergeleken, wordt hier weergegeven. Voor beide celtypen wordt de vergelijking tussen de voorwaarde GT en de conditiedifferentiatie weergegeven samen met de statistische tests die zijn uitgevoerd voor MPP's.

Histogrammen die het percentage celfamilies per generatie vergelijken met het type symmetrie of asymmetrie in het lot voor de eerste deling worden hier getoond. De verdeling van lotgevallen per generatie voor MPP's en de conditiedifferentiatie worden hier weergegeven. Deze procedure vereist dat cellen in bulk worden geïsoleerd om de juiste gating-strategie in te stellen.

Het is daarom beter om de kleuring te starten met minstens 10.000 cellen. Het combineren van deze methode met continue meting, zoals levende cellen zich voorstellen, kan zeer krachtig zijn, omdat de twee samen een gedetailleerde beschrijving kunnen geven van de vroege voorlopers van celdynamica. Deze aanpak werd voor het eerst ontwikkeld voor T-celbiologie door de Hopkins Labs.

Deze versie, aangepast voor bloedstamcellen, breidt zich nu uit naar kanker en stamcelbiologie.