Kwantificering van replicatiestress in eierstokkankercellen met behulp van enkelstrengs DNA-immunofluorescentie

Ons protocol presenteert een zeer efficiënte en gemakkelijk reproduceerbare methode om enkelstrengs DNA te kwantificeren, wat een marker is van replicatiestress in verschillende cellijnen. Bovendien zorgt de eenvoud voor toepassingen en schermen met een hoge doorvoer. In het bijzonder maakt deze methode een snelle kwantificering van een replicatiestress mogelijk, een kenmerk van verschillende eierstokkankers.

Het is ook vatbaar voor een host automatische analysesoftware, waardoor de efficiëntie verder wordt verhoogd. Enkelstrengs DNA wordt nu actief overwogen als een biomarker voor respons op chemotherapie gericht op DNA-reparatieroutes. Daarom is deze methode in dat scenario zeer toepasbaar.

Replicatiestress bestaat buiten eierstokkankercontexten of BRCA1, BRCA2-deficiënte kankers. En dus kan deze methode worden toegepast op een breed scala aan andere celtypen of ziektecontexten. Maak om te beginnen polylysine-gecoate afdekstroken door geautoclaveerde afdekstroken met een diameter van 12 millimeter en polylysine-oplossing toe te voegen aan een conische buis van 50 milliliter en plaats deze gedurende 15 minuten op een wip.

Zuig de oplossing op een weefselkweekkap. Was de afdekslip door steriel water toe te voegen en plaats de buis met de dekselslips gedurende vijf minuten terug op de wip. Na het wassen glijdt de hoes drie keer weg, zuig water uit de buis en spreid de hoes uit op een steriele schaal.

Zuig het resterende water op en laat ze drogen in de weefselkweekkap gedurende een uur of totdat er geen waterdruppels meer overblijven. Eenmaal droog, sluit je de schaal af met Parafilm en zet je hem op 4 graden Celsius. Om te voorkomen dat de cellen losraken van de afdekslip tijdens de pre-extractiestap, plaatst u een met polylysine gecoate afdekplaat in elke put van een plaat met 24 putten.

Zodra de OVCAR3-cellen 70 tot 80% confluentie bereiken, zuigt u het medium van de plaat en wast u de cellen met 5 tot 7 milliliter PBS. Zuig de PBS van de plaat. Voeg na het aanzuigen van de PBS 1 milliliter 0,25% trypsine toe en plaats de schaal in de couveuse op 37 graden Celsius gedurende 8 tot 10 minuten of totdat cellen van de bodem van de plaat opstijgen.

Verzamel de cellen met 5 tot 10 milliliter medium en voeg de celsuspensie toe aan een conische buis. Tel de cellen handmatig met een hemocytometer met behulp van standaardprocedures. Verdun vervolgens de celsuspensie en verkrijg een getal dat na drie populaties 70 tot 80% confluentie oplevert.

Voeg 1 milliliter celsuspensie toe aan polylysine-afdekstroken die in de putten van een 24-putplaat zijn geplaatst en laat de cellen onder standaardomstandigheden in het kweekmedium groeien. Na een populatieverdubbeling, zuig de bestaande media van de plaat en pulseer de cellen met 10 micromolaire IdU voor de twee volgende populatieverdubbelingen. Om de cellen te oogsten, vervangt u het medium door ijskoude 0,5% PBSTx op ijs gedurende vijf minuten.

Voor fixatie van cellen, aspirateer PBSTx en incuber de cellen gedurende 15 minuten met 3% paraformaldehyde bij kamertemperatuur. Na drie tot vier wasbeurten met PBS, houd vaste cellen op 4 graden Celsius tot verder gebruik. Permeabiliseer na fixatie de cellen met 0,5% PBSTx op ijs gedurende vijf minuten, zodat de hele afdekslip wordt bedekt.

Na het drie tot vier keer wassen van de cellen met 1 milliliter 0,2% PBST bij kamertemperatuur, zuigt u de PBST op en blokkeert u de monsters met behulp van 5% BSA gemaakt in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Voor immunostaining, bereid een uniforme kamer voor door een natte papieren handdoek op een platte bodem Tupperware te leggen. Bedek het 24-puts plaatdeksel met Parafilm.

Plaats het in de bevochtigde kamer en leg de afdekstroken op het plaatdeksel. Voeg 60 microliter verdund anti-BrdU primair muisantilichaam toe aan de bovenkant van de afdekslip. Als alternatief, om het uitdrogen van het antilichaam te verminderen en minder volume te gebruiken, plaatst u een druppel verdund antilichaam op de Parafilm en draait u de afdekslip erop.

Incubeer vervolgens een uur bij 37 graden Celsius. Na incubatie, aspirateer het primaire antilichaam. Breng de deksels terug naar een bord met 24 tanden en was ze vier keer met 0,2% PBST.

Voeg verdund secundair antilichaam toe aan de afdekslip zoals eerder aangetoond en incubeer gedurende een uur in het donker bij kamertemperatuur. Label een microscoopglaasje en monteer de afdekplaat op de dia's met DAPI-montagemedium. Bewaar dia's in het donker bij kamertemperatuur gedurende 24 uur als het montagemedium moet worden uitgehard of uitgehard.

De kernen afkomstig van de onbehandelde en behandelde cellen met 0,5 millimolair hydroxyureum waren gekleurd en identificeerbaar in de DAPI- en IdU-kanalen. De analyse van deze beelden bestaat uit het kwantificeren van het aantal foci in elke kern. Het aantal foci is evenredig met de mate van replicatiespanning.

Het is belangrijk om rekening te houden met de verdubbelingstijd van de cellijn van keuze, omdat de tijd van IdU-pulsering kan variëren voor langere of kortere verdubbelingsperioden. Als alternatief kunnen we cellen onderzoeken op replicatie-eiwit A om de resultaten te bevestigen en verschillende replicatiestressreacties in cellen te beoordelen. Deze techniek wordt gebruikt voor veel cellijnen in combinatie met elk DNA-schade-inducerend middel om de accumulatie van enkelvoudig gespannen DNA te onderzoeken.

Deze methode is dus breed toegankelijk en toepasbaar.