Een geoptimaliseerde kwantitatieve pull-down analyse van RNA-bindende eiwitten met behulp van kort gebiotinyleerd RNA

Dit protocol maakt de identificatie van eiwitbindende partners van een bekende RNA-sequentie mogelijk door ze uit cellulair extract te trekken met behulp van gebiotinyleerde RNA-oligonucleotiden. In vergelijking met methoden die reinigingsmiddelen of hoge temperaturen vereisen om de eiwitten van het RNA los te maken, gebruiken deze protocollen in plaats daarvan zeer milde omstandigheden die het mogelijk maken om ook potentiële eiwitcomplexen te behouden. De procedure wordt gedemonstreerd door Jakob Rupert, een promovendus onder mijn bepaling.

Begin met de totale eiwitoogst door het medium uit de putten van de HEK 293T-celplaat te verwijderen en de putten van de zes putplaten te wassen met één milliliter PBS. Gooi PBS weg en breng de platen over op ijs, voordat u 200 microliter lysisbuffer aan elke put toevoegt. Maak de cellen los en breek ze met behulp van een celschraper voordat u het celextract afkomstig van twee putten in dezelfde buis van 1,5 milliliter overbrengt.

Na 30 minuten incubatie op ijs en centrifugeren, breng het supernatant over in een voorgekoelde buis. Bereken vervolgens het volume eiwitextract dat overeenkomt met 1,5 milligram eiwitten. Breng vervolgens alle monsters naar een eindvolume van 600 microliter met behulp van een lysisbuffer.

Bewaar de monsters op ijs tot gebruik. Om de kralen te bereiden, mengt u ze in de opslagbuffer door met de buis te vegen. Na het berekenen van de 100 microliter drijfmestmedium per monster, plaatst u het berekende volume van de drijfmest in een magnetisch rek.

Om de kralen te wassen, verwijdert u de opslagoplossing en wast u de kralen door een milliliter lysisbuffer toe te voegen en deze handmatig om te keren. Verwijder vervolgens de buffer met behulp van het magnetische rek en herhaal de wasstap. Voeg aan de kralen een volume lysisbuffer toe dat gelijk is aan het oorspronkelijke volume slurrymedium en meng het door de buis te vegen voordat u het medium gelijkmatig in zoveel 1,5 milliliterbuizen als monsters doseert.

Voor het blokkeren van kralen, verwijder de buffer met behulp van het magnetische rek en voeg 600 microliter van 0,25 milligram per milliliter gist TRNA-oplossing bereid in lysisbuffer toe. Incubeer het gedurende een uur bij kamertemperatuur op een roterend wiel. Verwijder de TRNA-oplossing met behulp van het magnetische rek voordat u 600 microliter lysisbuffer toevoegt en was deze door handmatig te mengen.

Herhaal de wasstap en gooi de buffer weg. Bereid voor elke buis die de initiële 100 microliter van het slurrymedium bevat 200 microgram RNA-oligonucleotide in 600 microliter lysisbuffer. Voeg de oligo toe aan de kralen en incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur terwijl je draait.

Verwijder de oplossing uit de kralen en was tweemaal met 600 microliter lysisbuffer door de buisjes elk vijf minuten op kamertemperatuur te draaien. Gooi de buffer weg. Voor eiwitbinding op kralen, scheid 5% of 30 microliter volume van de 600 microliter eiwitoplossing en bewaar het als input of IN voor verdere analyse.

Voeg de resterende eiwitmix toe aan elke tube geladen kralen en incubeer met langzame rotaties 's nachts bij vier graden Celsius. Verwijder de ongebonden eiwitfractie uit de kralen met behulp van het magnetische rek. Bespaar 5% of 30 microliter van het volume en label het doorstromen of FT. Voeg een milliliter wasbuffer 1 toe aan de kralen en draai deze vijf minuten bij vier graden Celsius.

Gooi de buffer weg en herhaal deze was een keer. Voeg een milliliter wasbuffer 2 toe aan de kralen. En na vijf minuten broeden bij vier graden Celsius op een rotator, gooi je het supernatant weg.

Voeg voor het elueren van de specifieke bindmiddelen 100 microliter elutiebuffer 1 toe aan de kralen. Na handmatig mengen door te vegen, incubeer het gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Plaats de buizen in een thermische mixer en schud krachtig gedurende vijf minuten bij 95 graden Celsius.

Plaats vervolgens de buis in het magnetische rek en verzamel de geëlueerde fractie in een schone buis. Als je klaar bent, draai je de kralen snel met een bankcentrifuge om het herstel van het eluaat te maximaliseren. En bespaar 5% of vijf microliter van het totale eluate of EL-volume voor verdere analyses.

De geëlueerde eiwitten werden geïdentificeerd door massaspectrometrie. Het plotten van de significant verrijkte eiwitten in een vulkaanplot onthulde dat het totale eiwitgehalte en de verrijkte eiwitten geëlueerd uit RNA significant hoger waren dan RNA, wat suggereert dat RNA een hoger aantal specifieke interacties kan vaststellen. Als voorbeelden van de overeenkomst tussen voorspelde en verkregen resultaten, toonden de interactiescores voor plus RNA en minus RNA met eiwitten uit menselijk proteoom aan dat HNRNPH3 werd voorspeld om plus RNA selectief te binden, en PCBP2 om specifiek te interageren met RNA.

Bovendien werd voorspeld dat het eiwit RBM41 promiscue zou zijn voor beide RNA-oligonucleotiden. De massaspectroscopie-analyse van eiwit pull-down assay monsters bevestigde de aanwezigheid van HNRNPH3 in RNA en PCBP2 in minus RNA. Terwijl RBM41 met beide bleek te interageren.

Western blot werd gebruikt om de aanwezigheid van TDP-43 in de resultaten en protocoloptimalisatiestappen te detecteren. In RNA werd TDP-43 waargenomen in het invoermonster en het eluaat, wat wijst op de aanwezigheid ervan vanaf het begin. TDP-43 werd tijdens de wasstappen door RNA vastgehouden en aan het einde geëlueerd met een hoge zoutbuffer.

Door eiwit-RNA-interacties in kaart te brengen, kan deze methode macromoleculaire netwerken achter vele fysiologische routes onthullen. Bijvoorbeeld transcriptionele regulatie of pathologische mechanismen waaronder kanker en neurodegeneratie.