Name: Isolatie en zuivering van schimmel β-glucaan als immunotherapiestrategie voor glioblastoom (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Leer de isolatie en zuivering van schimmel β-glucaan als immunotherapiestrategie voor glioblastoom. Dit protocol toont de immunomodulerende effecten op microglia en de impact op tumorcellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen dr. Vasiliki Economopoulos bedanken voor haar interne script om het fuluorescence-signaal in ImageJ te meten. We willen ook de CITIUS (Universiteit van Sevilla) en al hun personeel bedanken voor hun steun tijdens de demonstratie. Dit werk werd ondersteund door de Spaanse FEDER I + D + i-USE, US-1264152 van de Universiteit van Sevilla, en het Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00

De vier verschillende paddenstoelvarianten die in dit protocol worden beschreven, zijn verkregen uit een commerciële bron (zie tabel met materialen).
1. Isolatie van schimmel β-glucanen
<ol><li>Extractie en isolatie van oplosbare paddenstoelpolysachariden OPMERKING: Oplosbare paddenstoelpolysachariden (SMP's) werden verkregen volgens de procedure die schematisch is weergegeven in figuur 1.<ol><li>Spoel verse P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus en G. lucidum vruchtlichamen (ongeveer 2.000 g/paddenstoel) vijf keer voorzichtig af in gedestilleerd water.</li>
		<li>Droog de vruchtlichamen bij 50 ± 2 °C in een conventionele luchtdroogoven tot een constant gewicht is bereikt (~24 uur).</li>
		<li>Vermaal de gedroogde paddenstoelen in een bladmolen en haal ongeveer 200 g poeder uit elke paddenstoel.</li>
		<li>Suspensie 100 g champignonpoeder (MP) (P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus en G. lucidum) in 1.000 ml H2Od. Vervolgens de autoclaaf bij 121 °C gedurende 15 minuten en ten slotte gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Centrifugeer de resulterende suspensie gedurende 10 minuten bij 6.000 x g bij 4 °C.</li>
		<li>Droog het neerslag dat onoplosbare paddenstoelpolysachariden (GMP's) bevat bij 50 ± 2 °C gedurende 24 uur in een aan de lucht drogende oven.</li>
		<li>Gooi het neerslag weg en houd het bovennatuurlijke middel. Concentreer het supernatant 10 keer in een roterende verdamper.</li>
		<li>Neerslag het concentraat dat SMP's bevat neer met ethanol (80% eindconcentratie) bij 4 °C gedurende een nacht.</li>
		<li>Centrifugeer de ethanolsuspensie gedurende 15 minuten bij 4 °C bij 6.000 x g , houd de pellet vast (neerslag) en gooi het supernatant weg met een pipet.</li>
		<li>Was het neerslag drie keer met 80% ethanol voordat het wordt opgelost in H2Od (10% w / v). Stel de pH in op 6,5/7 en de temperatuur op 37 °C en behandel met respectievelijk 2 U en 4 U α-amylase en glucoamylase om α-glucanen op te lossen volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel).</li>
		<li>Stel na de behandeling met α-amylase/glucoamylase de pH en temperatuur in op respectievelijk 8,0 en 50 °C en behandel met alcalase (2,5 E/g eiwit) (zie Tabel met materialen) om de eiwitten op te lossen. OPMERKING: Deze sequentiële enzymatische behandeling verwijdert de meeste α-glucanen en eiwitten die samen met β-glucanen neerslaan in de ethanolprecipitatie.</li>
		<li>Na hydrolyse centrifugeert u het hydrolysaat bij 6.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C en het schone supernatantconcentraat vijf keer in een roterende verdamper. Opnieuw neerslaan met 80% ethanol.</li>
		<li>Solubiliseer het resulterende neerslag in H2Od en dialyseer gedurende 24 uur in gedestilleerd water met behulp van cellulosebuismembranen (12.000 Da-afsnijmembranen; zie tabel met materialen) om moleculen met een laag molecuulgewicht te verwijderen. Recupereer het in water oplosbare deel en vriesdroog het om oplosbare β-glucanen (SβGs) te produceren.</li>
	</ol></li>
	<li>Suiker- en eiwitmeting<ol><li>Meet het totale suikergehalte van elke fractie met de fenol-zwavelzuurmethode, met glucose als standaard8. OPMERKING: Kwantificering van het β-glucaangehalte kan ook worden gedaan met behulp van de β-glucaantestkit (paddenstoel en gist; zie materiaaltabel), gebaseerd op enzymatische hydrolyse en de activiteit van oxidoreductasen: namelijk exo-1,3-β-glucanase, glucoseoxidase, β-glucosidase en peroxidase, met de daaropvolgende vorming van de chinoneimine. Volg de instructies van de fabrikant, met kleine wijzigingen.</li>
		<li>Gebruik 18 MH 2 SO4 in plaats van 12 MH2SO4.</li>
		<li>Evalueer het gehalte aan de totale glucanen en α-glucanen afzonderlijk.</li>
		<li>Meet de resulterende β-glucaanwaarden als het verschil tussen de totale glucaan- en α-glucaanwaarden (drievoudige waarden) volgens het Kjeldahl-protocol. In bepaalde gevallen kan het eiwitgehalte worden bepaald met behulp van de Lowry-methode, waarbij albumine wordt gebruikt om de kalibratiecurve11,12 uit te zetten.</li>
	</ol></li>
	<li>Ultraviolette absorptiespectroscopie analyse<ol><li>Verkrijg de SβG ultraviolette (UV) spectra met behulp van een UV-zichtbare spectrofotometer (zie Tabel van Materialen) door de monsters te scannen in het 200-400 nm gebied (Figuur 2).</li>
		<li>Bereid 1,0 mg/ml van elke SβG in H2Od, breng de oplossing over in een kwartscuvet en scan bij kamertemperatuur.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse van de molecuulgewichtsverdeling<ol><li>Schat de homogeniteit van SβGs en het molecuulgewicht van polymeren naar grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) met behulp van een high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) -systeem (zie materiaaltabel) uitgerust met een brekingsindexdetector en een ultra-hydrogel lineaire gelfiltratiekolom (300 mm x 7,8 mm; Figuur 3).</li>
		<li>Voer de test uit bij 40 °C met gedeïoniseerd water als eluent met een stroomsnelheid van 0,5 ml/min-1 en dextrans (110, 80 en 50 kDa) als standaarden (zie materiaaltabel). Verzamel een fractie van 5 ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Fourier-transform infrarood (FTIR) analyse<ol><li>Noteer de infraroodspectra (figuur 4) op een FTIR-spectrometer in het bereik van 4000-500 cm-1. De monsters moeten vooraf worden gemengd met KBr om films te vormen (standaard FTIR-procedure; zie de instructies van de fabrikant en de materiaaltabel).</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse van de moleculaire samenstelling<ol><li>Schat de moleculaire samenstellingen van SβG's door middel van high-performance dunnelaagchromatografie (HPTLC) en gaschromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (GC-MS), volgens standaardprocedures12.</li>
	</ol></li>
</ol>2. In vitro onderzoek naar β-glucaan-geïnduceerde microgliastimulatie
<ol><li>Celkweek van muisglioblastoom en microgliacellen in 8-well kamerglaasjes OPMERKING: Dit protocol is specifiek voor GL261 (glioblastoom) en BV2 (microglia) cellijnen. Met kleine aanpassingen kunnen deze stappen echter mogelijk worden gebruikt om andere kanker- en immuuncellijnen te bestuderen.<ol><li>Bereid Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) compleet medium gemodificeerd met L-glutamine, 4,5 g / L D-glucose en zonder pyruvaat. Voeg 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine toe (zie tabel met materialen). Verwarm het materiaal voor in een waterbad op 37 °C gedurende 15 min.</li>
		<li>Ontdooi bevroren BV2- en GL261-aliquots gedurende 2 minuten in een waterbad (37 °C) en voer ze vlak voordat ze volledig ontdooien in een laminaire stroomkap en plaats de cellen in twee verschillende steriele T25-kolven (één voor elke cellijn).</li>
		<li>Incubeer de T25-kolven bij 37 °C, 5% CO2 totdat de cultuur samenvloeit. OPMERKING: Afhankelijk van de vriesomstandigheden en de tijd onder cryopreservatie, kan de tijd tot samenvloeiing variëren. Deze cellijnen hebben meestal tussen de 3 en 5 dagen nodig om confluentie in een T75-kolf te bereiken.</li>
		<li>Nadat de BV2-celcultuur confluent is geworden, brengt u deze over in 8-well kamerglaasjes 0,6 x 106 cellen / put. Houd de 8-puts kamerschuiven 24 uur in de incubator.</li>
		<li>Zodra de microgliacellen in de 8-putkamerglaasjes zijn geplaatst, herhaalt u hetzelfde protocol met de GL261-cellen.</li>
	</ol></li>
	<li>Activering van microglia met β-glucanen<ol><li>Bedek de BV2-cellen met vier verschillende β-glucanen (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum en H. erinaceus) in een concentratie van 0,2 mg/ml gedurende 72 uur. Eén experimentele aandoening moet onbehandeld blijven (normaal medium) en fungeert als controlegroep.</li>
		<li>Vang het supernatant na 72 uur op met een pipet en laat het resterende volume door een spuitfilter van 0,20 μm lopen. Vries het supernatant vervolgens gedurende ten minste 24 uur in bij -80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Behandeling van GL261 met vooraf geactiveerd microglia-geconditioneerd medium<ol><li>Zodra de GL261 voor 80% samenvloeit is in de 8-well kamerglaasjes, voegt u β-glucaan-behandeld microgliaal medium (stap 2.2.2) toe bij een uiteindelijke volumeconcentratie van 25% gedurende 72 uur (totaal volume: 250 μl/put).</li>
		<li>Verwijder het medium na 72 uur incubatie en gooi het weg.</li>
		<li>Was de cellen drie keer gedurende 5 minuten met fosfaatbufferzoutoplossing (PBS; pH 7,4, 0,1 M).</li>
		<li>Bevestig de cellen door 200 μL 4% paraformaldehyde (PFA) toe te voegen bij 4 °C gedurende 15 minuten. OPMERKING: Afhankelijk van de verschillende antilichamen die kunnen worden gebruikt voor immunofluorescentie, kunnen fixatiemethoden verschillen van typische 4% PFA. Op alcohol gebaseerde fixatieven kunnen efficiënter zijn in het behoud van bepaalde epitopen.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunofluorescentie onderzoek<ol><li>Was de monsters met PBS met triton X (PBST; 0,01%) gedurende 10 minuten drie keer.</li>
		<li>Verwijder de PBST en voeg runderserumalbumine (BSA) blokkerende buffer 10% in PBST (tabel 1) toe gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Verwijder de blokkeringsbuffer en voeg 200 μL toe per putje PBS dat het primaire antilichamenmengsel bevat (1:500 rat Ki-67 monoklonaal antilichaam en 1:500 konijn gekloofd caspase-3 antilichaam; zie tabel met materialen). Incubeer een nacht bij 4 °C.</li>
		<li>Laat de monsters na 24 uur incubatie bij 4 °C gedurende 30 minuten op kamertemperatuur staan.</li>
		<li>Was de putjes drie keer gedurende 10 minuten met PBS op een shaker (lage snelheid).</li>
		<li>Verwijder de PBS en vervang door 200 μL per putje PBS met daarin het mengsel van secundaire antilichamen (1:200 ezel anti-rat IgG (H + L) sterk gekruist geadsorbeerd secundair antilichaam, Alexa Fluor 488 en 1:200 ezel anti-konijn IgG (H + L) sterk kruisgeadsorbeerd secundair antilichaam, Alexa Fluor 647; zie Materiaaltabel) gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur in het donker.</li>
		<li>Was de monsters met PBS gedurende 10 minuten op een multifunctionele shaker.</li>
		<li>Verwijder de PBS en voeg 200 μL per putje van 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) verdund in PBS (1:5.000) gedurende 1 min.</li>
		<li>Verwijder DAPI (zie materiaaltabel) en was de cellen gedurende 5 minuten in PBS.</li>
		<li>Verwijder het putframe en voeg 50 μL PBS:glycerol (1:1) toe aan elke put en dek af met een coverslip.</li>
		<li>Sluit de dia's af met nagellak.</li>
		<li>Verkrijg beelden op 20x met behulp van een confocaal microscoopsysteem (zie tabel met materialen).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Kwantificering en analyse van tumorcelproliferatie en apoptose
OPMERKING: Om het potentiële effect van de verschillende β-glucanen op tumorcelproliferatie en apoptose te meten, werd een intern script gebruikt in ImageJ-software om het aantal positieve pixels van Ki67 (proliferatie) en cCasp3 (apoptose) te kwantificeren13.
<ol><li>Open AfbeeldingJ. Klik op de knop Plug-ins . Klik op Coloc2, een plug-in die eerder in de plug-inmap is geïnstalleerd en selecteer ten slotte de afbeelding om11 te analyseren. OPMERKING: Deze plug-in was beschikbaar na eerder contact met Dr. Vasiliki Economopoulos (veconom@uwo.ca). In plaats van het script hebben zowel ImageJ- als Fiji-software verschillende tools voor colokalisatieanalyse (zie materiaaltabel), met vergelijkbare eigenschappen.</li>
	<li>Stel drempelwaarden in op basis van de controlevoorwaarden (onbehandeld, alleen DMEM). Klik op de knop OK . OPMERKING: Om achtergrond- en intensiteitsverschillen te voorkomen, moeten alle afbeeldingen onder dezelfde omstandigheden worden gemaakt. Bij voorkeur moeten beeldvormingssessies op dezelfde dag worden uitgevoerd en microscoopparameters ongewijzigd over afbeeldingen worden uitgevoerd.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de resulterende afbeeldingen van de gecolokaliseerde pixels en een overzichtsvenster met het percentage of het onbewerkte aantal pixels boven de drempel verschijnen. Normaliseer de resultaten met betrekking tot de controle (onbehandelde) aandoeningen. OPMERKING: Alle gegevens worden gegeven als gemiddelde ± SEM. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van grafische en analysesoftware (zie Materiaaltabel). Er werd gebruik gemaakt van een eenrichtings-ANOVA met de meervoudige vergelijkingstest van Tukey. Fouten worden weergegeven als standaardfout van het gemiddelde (s.e.m.) (*p < 0,05, **p < 0,01).</li>
</ol>

<ol><li>Aldape, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+to+curing+primary+brain+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Challenges to curing primary brain tumours.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 16 (8), 509-520 (2019).</li>
<li>Himes, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppression+in+glioblastoma%3A+current+understanding+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Immunosuppression in glioblastoma: current understanding and therapeutic implications.</a> Frontiers in Oncology. 11, 770561(2021).</li>
<li>Ma, J., Chen, C. C., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%2Fmicroglia+in+the+glioblastoma+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Macrophages/microglia in the glioblastoma tumor microenvironment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5775(2021).</li>
<li>Sevenich, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+%26%2334%3Bcold%26%2334%3B+into+%26%2334%3Bhot%26%2334%3B+tumors-opportunities+and+challenges+for+radio-immunotherapy+against+primary+and+metastatic+brain+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Turning &#34;cold&#34; into &#34;hot&#34; tumors-opportunities and challenges for radio-immunotherapy against primary and metastatic brain cancers.</a> Frontiers in Oncology. 9, 163(2019).</li>
<li>Niesel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+suppressive+microenvironment+affects+efficacy+of+radio-immunotherapy+in+brain+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The immune suppressive microenvironment affects efficacy of radio-immunotherapy in brain metastasis.</a> EMBO Molecular Medicine. 13 (5), e13412(2021).</li>
<li>McCann, F., Carmona, E., Puri, V., Pagano, R. E., Limper, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+internalization+of+fungal+beta-glucans+is+not+necessary+for+initiation+of+related+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage internalization of fungal beta-glucans is not necessary for initiation of related inflammatory responses.</a> Infection and Immunity. 73 (10), 6340-6349 (2005).</li>
<li>Vetvicka, V., Teplyakova, T. V., Shintyapina, A. B., Korolenko, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+medicinal+fungi-derived+%CE%B2-glucan+on+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fungi%22%5BJournal%5D)">Effects of medicinal fungi-derived β-glucan on tumor progression.</a> Journal of Fungi. 7 (4), 250(2021).</li>
<li>Chan, G. C. F., Chan, W. K., Sze, D. M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+beta-glucan+on+human+immune+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells.</a> Journal of Hematology & Oncology. 2, 25(2009).</li>
<li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).</li>
<li>Klaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidative+activities+and+chemical+characterization+of+polysaccharides+extracted+from+the+basidiomycete+Schizophyllum+commune%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Antioxidative activities and chemical characterization of polysaccharides extracted from the basidiomycete Schizophyllum commune.</a> Food Science and Technology. 44 (10), 2005-2011 (2011).</li>
<li>Soto, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3-mediated+astrocyte+reactivity+associated+with+brain+metastasis+contributes+to+neurovascular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">STAT3-mediated astrocyte reactivity associated with brain metastasis contributes to neurovascular dysfunction.</a> Cancer Research. 80 (24), 5642-5655 (2020).</li>
<li>Chromý, V., Vinklárková, B., Šprongl, L., Bittová, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Kjeldahl+method+as+a+primary+reference+procedure+for+total+protein+in+certified+reference+materials+used+in+clinical+chemistry.+I.+A+review+of+Kjeldahl+methods+adopted+by+laboratory+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Kjeldahl method as a primary reference procedure for total protein in certified reference materials used in clinical chemistry. I. A review of Kjeldahl methods adopted by laboratory medicine.</a> Critical Reviews in Analytical Chemistry. 45 (2), 106-111 (2015).</li>
<li>Waterborg, J. H., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lowry+method+for+protein+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The Lowry method for protein quantitation.</a> Methods in Molecular Biology. 32, 1-4 (1994).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+antioxidant+activities+of+polysaccharides+from+thirteen+boletus+mushrooms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Characterization and antioxidant activities of polysaccharides from thirteen boletus mushrooms.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 113, 1-7 (2018).</li>
<li>Barbosa, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+extracts+rich+in+antioxidant+polysaccharides+from+the+edible+mushroom+Pleurotus+ostreatus+using+binary+system+with+hot+water+and+supercritical+CO2%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Obtaining extracts rich in antioxidant polysaccharides from the edible mushroom Pleurotus ostreatus using binary system with hot water and supercritical CO2.</a> Food Chemistry. 330, 127173(2020).</li>
<li>Ma, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+polysaccharides+from+mycelia+of+genus+Ganoderma+by+mid-infrared+and+near-infrared+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Assessment of polysaccharides from mycelia of genus Ganoderma by mid-infrared and near-infrared spectroscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10(2018).</li>
<li>Nie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-enhancing+effects+of+polysaccharides+MLN-1+from+by-product+of+Mai-luo-ning+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Agricultural+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immune-enhancing effects of polysaccharides MLN-1 from by-product of Mai-luo-ning in vivo and in vitro.</a> Food and Agricultural Immunology. 30 (1), 369-384 (2019).</li>
<li>Cerletti, C., Esposito, S., Iacoviello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Edible+mushrooms+and+beta-glucans%3A+impact+on+human+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Edible mushrooms and beta-glucans: impact on human health.</a> Nutrients. 13 (7), 2195(2021).</li>
<li>Klaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+edible+mushroom+Laetiporus+sulphureus+as+potential+source+of+natural+antioxidants%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Sciences+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">The edible mushroom Laetiporus sulphureus as potential source of natural antioxidants.</a> International Journal of Food Sciences and Nutrition. 64 (5), 599-610 (2013).</li>
<li>Kozarski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+polysaccharide+extracts+of+Agaricus+brasiliensis+fruiting+bodies%3A+chemical+characterization+and+bioactivities+at+different+levels+of+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Research+International%22%5BJournal%5D)">Dietary polysaccharide extracts of Agaricus brasiliensis fruiting bodies: chemical characterization and bioactivities at different levels of purification.</a> Food Research International. 64, 53-64 (2014).</li>
<li>Ayimbila, F., Keawsompong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+composition+and+antioxidant+property+of+crude+polysaccharides+from+the+fruiting+bodies+of+Lentinus+squarrosulus%5BTitle%5D)+AND+%223+Biotech%22%5BJournal%5D)">Functional composition and antioxidant property of crude polysaccharides from the fruiting bodies of Lentinus squarrosulus.</a> 3 Biotech. 11 (1), 7(2021).</li>
<li>de Azambuja, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki-67+as+prognostic+marker+in+early+breast+cancer%3A+a+meta-analysis+of+published+studies+involving+12%2C155+patients%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Ki-67 as prognostic marker in early breast cancer: a meta-analysis of published studies involving 12,155 patients.</a> British Journal of Cancer. 96 (10), 1504-1513 (2007).</li>
<li>Holubec, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+apoptosis+by+immunohistochemical+markers+compared+to+cellular+morphology+in+ex+vivo-stressed+colonic+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Assessment of apoptosis by immunohistochemical markers compared to cellular morphology in ex vivo-stressed colonic mucosa.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (2), 229-235 (2005).</li>
<li>Borges, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+polysaccharide+production+by+a+strain+of+Pleurotus+djamor+isolated+in+the+south+of+Brazil+and+antitumor+activity+on+Sarcoma+180%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Extracellular polysaccharide production by a strain of Pleurotus djamor isolated in the south of Brazil and antitumor activity on Sarcoma 180.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 44 (4), 1059-1065 (2014).</li>
<li>Sohretoglu, D., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganoderma+lucidum+polysaccharides+as+an+anti-cancer+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Anti-Cancer+Agents+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ganoderma lucidum polysaccharides as an anti-cancer agent.</a> Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (5), 667-674 (2018).</li>
</ol>

Er zijn geen tegenstrijdige belangen aan te geven.

Dit werk beschrijft het gebruik van gevestigde technieken om met succes het gehalte aan SβG's uit vier verschillende schimmels te isoleren, te zuiveren en te karakteriseren. De resultaten toonden aan hoe na warmwaterextractie van SMP's, verkregen uit P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum en H. erinaceus, gevolgd door hydrolytische behandeling met α-amylase, glucosidase en protease, het gehalte aan α-glucaan en eiwit werd verminderd, waardoor de hoeveelheid zuivere SβG's aanzienlijk werd ...

Ondanks de komst van nieuwe prestaties op het gebied van neuro-oncologie, blijft de levensverwachting van glioblastoompatiënten mager. Gouden standaard therapieën tegen hersentumoren zijn gebaseerd op de samensmelting van chirurgie, radiotherapie en chemotherapie. In het afgelopen decennium is immunotherapie echter naar voren gekomen als een krachtige strategie om verschillende soorten kanker te behandelen1. Zo is de mogelijkheid om de immuunrespons van het lichaam tegen tumorcellen te benutten onlangs de vierde pijler van de oncologie geworden.
Het is al lang bekend dat een van de grootste uitdagingen in het veld is om de sterke immunosuppressie in de micro-omgeving van de tumorte overwinnen 2. Met name in het geval van glioblastoom, een van de meest voorkomende en agressieve vormen van hersenkanker, kan het ontrafelen van belangrijke routes die dergelijke pro-tumorale scenario's orkestreren en het vinden van nieuwe verbindingen die de deprimerende reactie van het immuunsysteem kunnen tegengaan, de weg vrijmaken voor toekomstige therapieën tegen deze ongeneeslijke ziekte.
De hersenen bezitten hun eigen cellen van het immuunsysteem en het meest relevante celtype zijn microglia. Het is bewezen dat deze cellen een vrij complex gedrag vertonen bij verschillende centrale ziekten3. In het geval van primaire hersentumoren (bijv. Glioblastoom), worden deze cellen verschoven naar een ontstekingsremmend fenotype dat tumorcellen ondersteunt om het hersenparenchym te koloniseren3. Talrijke publicaties hebben de belangrijke rol van deze cellen tijdens tumorprogressie versterkt. Een van de belangrijkste redenen hiervoor is dat glioom-geassocieerde microglia en geïnfiltreerde macrofagen (GAMs) goed zijn voor een derde van de totale tumormassa, wat de ondubbelzinnige invloed van hun activeringstoestanden tijdens de progressie van de hersentumorsuggereert 4,5.
In die geest zijn schimmel β-glucanen beschreven als krachtige moleculen die effectieve immuunresponsen veroorzaken, waaronder fagocytose en pro-inflammatoire factoren productie, wat leidt tot de eliminatie van schadelijke stoffen 6,7,8,9,10. Schimmel β-glucanen zijn over het algemeen bestudeerd met behulp van extracten van verschillende paddenstoeldelen. De toekenning van specifieke effecten vereist echter de zuivering ervan om dubbelzinnigheden te voorkomen en om het werkingsmechanisme van dergelijke moleculen als immunomodulerende middelen te kunnen begrijpen8.
In dit werk worden oplosbare β-glucanen gezuiverd uit het vruchtlichaam van vier verschillende paddenstoelen, regelmatig gebruikt als eetbare (Pleurotus ostreatus en Pleurotus djamor) en als medicinale (Ganoderma lucidum en Hericium erinaceus) paddenstoelen. Met name deze vier paddenstoelen worden veel gebruikt in de voedings- en farmaceutische industrie en werden geproduceerd binnen een milieuvriendelijke circulaire economie in een commerciële onderneming (zie Materiaaltabel).
Om de basis te leggen voor het toekomstige gebruik van schimmel-β-glucanen in hersenkankertherapieën, zijn goed gedefinieerde zuiveringsstrategieën en preklinische studies die zich verdiepen in hun vermeende interactie met cellen van het immuunsysteem essentieel om hun potentiële rol als antitumormediatoren te evalueren. Dit werk beschrijft de talrijke stappen van isolatie en zuivering die nodig zijn om de oplosbare β-glucanen in de vruchtlichamen van de geselecteerde paddenstoel terug te halen. Eenmaal met succes gezuiverd, worden microgliacellen geactiveerd om hun inflammatoire fenotype te verbeteren. Muis glioblastoom cellen (GL261) worden gecoat met een ander microglia-geconditioneerd medium, eerder behandeld met deze extracten, en vervolgens wordt het effect ervan op het gedrag van tumorcellen geëvalueerd. Interessant is dat pilotstudies van ons laboratorium (gegevens niet getoond) hebben blootgelegd hoe pro-inflammatoire microglia de migratie van tumorcellen en invasie-eigenschappen kunnen vertragen, niet alleen in glioblastoomcellen, maar ook in andere kankercellijnen. Dit multidisciplinaire werk kan een nuttig hulpmiddel zijn voor oncologische onderzoekers om veelbelovende verbindingen te testen die de immuunrespons in veel verschillende soorten tumoren kunnen stimuleren.

<table><tbody><tr><td>8-well chamber slides</td><td>Thermo Fisher, USA</td><td>171080</td><td></td></tr><tr><td>Air-drying oven</td><td>J.P. Selecta S.A., Spain</td><td>2000210</td><td></td></tr><tr><td>Albumine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Alcalase</td><td>Novozymes, Denmark</td><td>protease</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Thermofisher, USA</td><td>A32731</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647</td><td>Thermofisher, USA</td><td>A32728</td><td></td></tr><tr><td>Meelmolen</td><td>Retsch, Duitsland</td><td>&nbsp;SM100</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine</td><td>MERK, Duitsland</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Cellulose buis membraan</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td><td>D9402</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>MERK, Duitsland</td><td>Eppendorf, 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Colocalisatie pluggins</td><td>ImageJ</td><td></td><td>(https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis&nbsp;)</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>MERK, Duitsland</td><td>28718-90-3</td><td></td></tr><tr><td>Dextranen</td><td>Pharmacosmos, Holbalk, Denemarken</td><td>Dextran 410, 80, 50</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&acute;s gemodificeerd Eaglesmedium, Gluta MAXTM</td><td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td><td>10564011</td><td></td></tr><tr><td>Extenda (&alpha;- Amylase/Glucoamylase)</td><td>Novozymes, Denmark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td><td>A4736301</td><td></td></tr><tr><td>FT-IR spectromete</td><td>Bruker-Vertex, Zwitserland</td><td>VERTEX 70v</td><td></td></tr><tr><td>Grafische en analysesoftware</td><td>GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC systeem</td><td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td><td>Waters 2695 HPLC</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Eppedorf</td><td>Galaxy 170S</td><td></td></tr><tr><td>Massenspectrometer</td><td>Q Exactive GC, Thermo Scientific</td><td>725500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>MERK, Duitsland</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Crison, Barcelona, Spanje</td><td>Basic 20</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde saline</td><td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td><td>1010-015</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antilichaam</td><td>Abcam, UK</td><td>ab243998</td><td></td></tr><tr><td>Rat Ki-67 Monoklonaal</td><td>Thermofisher, USA</td><td>MA5-14520</td><td></td></tr><tr><td>Roterende verdamper</td><td>B&uuml;chi Ib&eacute;rica S.L.U., Spanje</td><td>El Rotavapor R-100</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-hydrogel lineaire gel-filtratie kolom (300 mm x 7,8 mm)</td><td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td><td>WAT011545</td><td></td></tr><tr><td>UV-Zichtbaar spectrofotometer</td><td>Amersham Bioscience, UK</td><td>Ultrospec 2100 pro</td><td></td></tr><tr><td>VectaMount</td><td>Vector Laboratories, C.A, USA</td><td>H-5000-60</td><td></td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>J.P. Selecta S.A., Spanje</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscoop Systeem.</td><td>Zeiss, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glucaan Assay Kit</td><td>Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ierland</td><td>K-BGLU</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glucanen</td><td>Setas y Hongos del Sur, S.L.</td><td></td><td>Voorzag de vier varianten van paddenstoelen</td></tr></tbody></table>

isolatie en zuivering van schimmel β-glucaan als immunotherapiestrategie voor glioblastoom

Isolation and Purification of Fungal &#946;-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma

Een van de grootste uitdagingen bij het ontwikkelen van effectieve therapieën tegen glioblastoom is het overwinnen van de sterke immuunsuppressie in de micro-omgeving van de tumor. Immunotherapie is naar voren gekomen als een effectieve strategie om de reactie van het immuunsysteem tegen tumorcellen te keren. Glioom-geassocieerde macrofagen en microglia (GAMs) zijn belangrijke aanjagers van dergelijke ontstekingsremmende scenario's. Daarom kan het verbeteren van de antikankerrespons bij GAM's een potentiële co-adjuvante therapie zijn om glioblastoompatiënten te behandelen. In die geest staan schimmel- β-glucaanmoleculen al lang bekend als krachtige immuunmodulatoren. Hun vermogen om de aangeboren immuunactiviteit te stimuleren en de behandelingsrespons te verbeteren is beschreven. Die modulerende kenmerken worden deels toegeschreven aan hun vermogen om te binden aan patroonherkenningsreceptoren, die, interessant genoeg, sterk tot expressie komen in GAMs. Dit werk is dus gericht op de isolatie, zuivering en het daaropvolgende gebruik van schimmel β-glucanen om de tumordodende respons van microglia tegen glioblastoomcellen te verbeteren. De muisglioblastoom (GL261) en microglia (BV-2) cellijnen worden gebruikt om de immunomodulerende eigenschappen te testen van vier verschillende schimmel β-glucanen geëxtraheerd uit paddenstoelen die veel worden gebruikt in de huidige biofarmaceutische industrie: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus en Ganoderma lucidum. Om deze verbindingen te testen, werden co-stimulatietests uitgevoerd om het effect van een vooraf geactiveerd microglia-geconditioneerd medium op de proliferatie en apoptose-activering in glioblastoomcellen te meten.

Succesvolle zuivering van β-glucanen De massa MP, SMP's en SβG's verkregen uit vruchtlichamen van P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum en H. erinaceus na het extractie- en zuiveringsproces is samengevat in tabel 1. De basissamenstelling (totale koolhydraten, β-glucanen en eiwitten) van MP, SMP's en SβG's verkregen uit de schimmels is weergegeven in tabel 2. Deze resultaten laten zien hoe het protocol het mogelijk maakte om een grote ...

Het huidige protocol beschrijft de zuiveringsstappen en daaropvolgende studies van vier verschillende schimmel-β-glucanen als potentiële immunomodulerende moleculen die de anti-tumorale eigenschappen van microglia tegen glioblastoomcellen verbeteren.

Isolatie en zuivering van schimmel β-glucaan als immunotherapiestrategie voor glioblastoom

One of the biggest challenges in developing effective therapies against glioblastoma is overcoming the strong immune suppression within the tumor ...

Schimmel bèta-glucanen zijn belangrijke modulatoren van het immuunsysteem. Het verbeteren van de zuiverheids- en isolatieprotocollen is essentieel om hun potentiële rol als co-adjuvantia voor kankertherapie te bevestigen. Een hoge mate van vier verschillende bèta-glucanen werd bereikt met behulp van verschillende apparaten die vaak worden aangetroffen in moleculaire biologie en proteomische laboratoria.Dit protocol richt zich op het testen van de effecten van bèta-glucanen op microglia, de meest voorkomende inwonende immuuncel van de hersenen. Het moduleren van het microglia fenotype bij glioblastoom kan belangrijke inzichten opleveren. Begin met de extractie van oplosbare paddenstoelpolysacchariden of SMP's door verse vruchtlichamen van Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus en Ganoderma lucidum vijf keer met gedestilleerd water te spoelen.Droog vervolgens de gewassen vruchtlichamen volledig bij 50 graden Celsius in een conventionele luchtdroogoven gedurende ongeveer 24 uur voordat ze in een bladmolen worden gemalen en ongeveer 200 gram poeder van elke paddenstoel wordt verkregen. Suspensie vervolgens 100 gram van alle vier de champignonpoeders of MP in 1.000 mi

isolation-purification-fungal-glucan-as-an-immunotherapy-strategy-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze video protocol toont de isolatie en de uitbreiding van stamcellen als cellen van chirurgisch gereseceerd menselijke glioblastoom mutliforme (GBM) tumor weefsel met behulp van de neurosphere assay kweekmethode.

Isolatie en uitbreiding van de Mens glioblastoma multiforme tumorcellen Met behulp van de Neurosphere Assay

This video demonstrates an in vitro assay utilizing β-glucans to activate microglial cells for the production of superoxide radicals, a reactive oxygen species. In brain cancer cells, the generated reactive oxidants actively suppress tumor cell proliferation and induce cell death.

An Assay for Analyzing Test &beta;-Glucan as an Immunotherapy Strategy against Brain Cancer Cells

The video demonstrates the isolation of tumor-infiltrating peripheral blood mononuclear cells from a mouse brain using mechanical dissociation and enzymatic digestion. This is followed by density gradient centrifugation to collect the immune cells for further analysis.

Isolating Tumor-Infiltrating Immune Cells from a Murine Brain

Protocol voor vermeerdering van gedissocieerde hoogwaardige glioom chirurgische specimens in serumvrij neurosfeermedium om te selecteren voor cellen met kankerstamcelfenotype. Voor specimens die niet als neurosferen groeien, wordt een alternatief protocol voorgesteld. Een paraffine-inbeddingstechniek voor het behoud van de 3D-neurosfeerarchitectuur voor immunocytochemie wordt beschreven.

Optimalisatie van hoogwaardige glioomcelcultuur van chirurgische specimens voor gebruik in klinisch relevante diermodellen en 3D-immunochemie

De lymfodeletieve en immunomodulerende effecten van chemotherapie en stralingsstandaardzorg kunnen worden benut om de antitumor-effectiviteit van T-celimmunotherapie te verbeteren. We schetsen een methode voor het genereren van EGFRvIII-specifieke chimere antigeenreceptor (CAR) T-cellen en het toedienen ervan in de context van glioblastoma standaardzorg.

Generatie van de CAR T-cellen voor adoptieve Therapie in de context van glioblastoma Standard of Care

Hier voorgesteld is een eenvoudige methode voor het isoleren en flowcytometrische analyse van glioma infiltrerende perifere mononucleaire cellen die tijdsafhankelijk kwantitatieve gegevens over het aantal en activeringsstatus van immuuncellen die het begin hersentumor micro oplevert.

Isolatie en Flow cytometrische analyse van Glioom infiltreren perifere mononucleaire bloedcellen

Het begrijpen van het kwaadaardige gedrag van kanker vereist het creëren van nauwkeurige modellen van hoe tumorcellen interageren met componenten van de tumormicro-omgeving, zoals macrofagen. Hier beschrijven we twee methoden om de interactie van glioblastoomcellen met tumorgeassocieerde macrofagen en microglia te bestuderen, waarbij het effect op glioblastoominvasie wordt beoordeeld.

Coculture Testen om te studeren macrofagen en microglia Stimulatie van glioblastoma Invasion

Tumor-zoekende therapeutische mesenchymale stamcellen (MSCs) tonen belofte als een behandeling voor invasieve glioblastoma. Optimale transplantatie gaat om levering van MSCs in de holte van de resectie tumor op steigers. Hier, preklinische technieken om te studeren MSC behandeling van glioblastoma zijn geleverd inclusief: afbeelding-geleide tumor resectie; implantatie van MSC-geplaatste steigers; en postoperatieve therapie volgen.

Image-Guided resectie van Glioblastoma en intracraniële implantatie van therapeutische stamcel-geplaatste steigers

Hier presenteren we een protocol voor de voorbereiding en het stereotaxic beheer van allogene menselijke lymfocyten in immunodeficiëntie muizen uitvoering orthotopic menselijke primaire hersentumoren. Deze studie biedt een bewijs-van-concept voor zowel de haalbaarheid en antitumorale werkzaamheid van cellulaire immuuntherapie intrabrain-geleverd.

Stereotactische adoptief overdracht van cytotoxische immuuncellen in lymfkliertest modellen van Orthotopic mens Glioblastoma Multiforme Xenografts

Neurospheres gegroeid als 3D culturen vormen een krachtig hulpmiddel om te studeren glioma biologie. Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van immunohistochemistry met behoud van de 3D structuur van glioma neurospheres via paraffine insluiten. Deze methode kan de karakterisatie van glioma neurosphere eigenschappen zoals stemness en Neurale differentiatie.

Evaluatie van Biomarkers in Glioma door Immunohistochemistry op 3D Glioma paraffine-ingebedde Neurosphere culturen

Leer de isolatie en zuivering van schimmel β-glucaan als immunotherapiestrategie voor glioblastoom. Dit protocol toont de immunomodulerende effecten op microglia en de impact op tumorcellen.

Isolatie en zuivering van schimmel β-glucaan als immunotherapiestrategie voor glioblastoom

Meer video's verkennen