Ontwikkeling van Leishmania-soortenstammen met constitutieve expressie van eGFP

Dit protocol is de sleutel voor het genereren van stammen die kunnen worden gebruikt in high-throughput screening assays om het potentieel en de traditionele activiteit van moleculen te evalueren Juana Quintero en Laura Pineda, onderzoeksassistenten van mijn laboratorium, zullen de procedure demonstreren. Om te beginnen, amplify het doelgen met behulp van een high fidelity polymerase om de coderende sequentie te behouden. Voeg de primers toe aan het reactiemengsel in een eindconcentratie van 0,2 micromolair en voer een PCR-cyclusprotocol uit zoals beschreven in het manuscript.

Zuiver het versterkte PCR-fragment met behulp van een conventionele PCR-productzuiveringskit. Om de uiteinden van het eGFP PCR-product bij te snijden, stelt u een reactie in met Kpn I-enzym volgens de instructies van de fabrikant en incubeert u gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens 100 millimolair natriumchloride en 10 eenheden Bgl II toe aan de reactie en incubeer gedurende 15 minuten.

Zuiver na de spijsvertering de reactie zoals eerder getoond. Verlaag vervolgens pLEXSY-expressievector met Bgl II en Kpl I na de sequentiële vertering zoals eerder aangetoond. Ligate 100 nanogram verteerde pLEXSY-vector en 28 nanogram verteerde eGFP in een reactie van 20 microliter met ligasebuffer en drie eenheden T4-DNA-ligase.

Incubeer 's nachts bij vier graden Celsius. Transformeer aan het einde van de incubatie competente Escherichia coli-cellen met het ligatieproduct met behulp van standaardtransformatieprotocollen. Plaats de getransformeerde cellen in LB ampicilline agar en incubeer gedurende 24 uur bij 30 graden Celsius om recombinante klonen te selecteren.

Na het screenen van de kolonies, zuivert u plasmide-DNA van een positieve kloon voor daaropvolgende transfectie met behulp van een commerciële plasmide-isolatiekit. Om gelineariseerde fragmenten van het plasmide te produceren, neemt u ten minste 10 microgram van het gezuiverde pLEXSY eGFP-plasmide en verteert u het met SWA1 gedurende drie tot vier uur bij 25 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, warmte inactiveren het verteringsproduct bij 65 graden Celsius gedurende 20 minuten.

Voer vervolgens het verteringsproduct uit in agarose-gel-elektroforese om de resulterende fragmenten te scheiden. Zuiver de expressiecassette met behulp van een commerciële agarosegelextractiekit volgens de instructies van de fabrikant. Laat de parasietculturen groeien totdat er voldoende logfase of vroege stationaire fase promastigoten zijn.

Bundel indien nodig de inhoud van meerdere kweekkolven. Centrifugeer de parasietcultuur bij 2.000 G gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de pellet in elektroporatiebuffer bij vier graden Celsius om een concentratie van één maal 10 tot de achtste parasieten per milliliter te krijgen en houd hem 10 minuten op ijs.

Tegelijkertijd worden pre-chill buizen met 2 tot 10 microgram gelineariseerde pLEXSY eGFP gebouwd in 50 microliter water of 10 millimolar tris buffer met pH 8,0 en elektroporatiecuvetten met een diameter van twee millimeter. Voeg vervolgens 350 microliter voorgekoelde parasieten toe aan de buis met het gelineariseerde plasmide en breng de volledige 400 microliter over naar de elektroporatiecuvet op ijs. Elektroporate de parasietcellen met plasmide en parallel daaraan parasietcellen zonder plasmide-DNA als negatieve controle.

Zet de cuvette 10 minuten op het ijs. Breng de geëlektroponeerde parasieten over op vijf milliliter van het juiste kweekmedium en incubeer gedurende 20 uur bij 26 graden Celsius. Observeer ongeveer 20 uur na elektroporatie de culturen onder een microscoop en voeg het juiste selectieve antibioticum toe, afhankelijk van het gebruikte pLEXSY-plasmide.

Volg de culturen microscopisch totdat er een duidelijk verschil is tussen parasieten geëlektropoeerd met en zonder plasmide-DNA. Om de fluorescentie van de parasiet te verifiëren door middel van flowcytometrie, centrifugeert u één milliliter van de stationaire fasecultuur bij 2.000 G gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Nadat u de cellen tweemaal in PBS hebt gewassen, resuspensie van de laatste pellet in één milliliter PBS.

Voer monsters uit en verzamel 20.000 gebeurtenissen met een snelheid van 0,5 microliter per seconde. Stel versterkingswaarden voor de kanalen forward scatter, side scatter en fluorescence one in als respectievelijk 225,0, 200,0 en 520,0. Maak een poort G1 met de parasietpopulatie.

Filter het FL1-kanaal door die poort om de autofluorescentie van promastigoten te bepalen en stel een bereikpoort G2 in voor het FL1-kanaal. Voer de getransfecteerde parasieten uit om te controleren of er fluorescentie is. Noteer het percentage parasieten in G1 dat fluorescerend is en het gemiddelde van de fluorescentie-intensiteit in G2. Zuiver genomisch DNA van twee tot vijf milliliter van een stationaire fase parasietcultuur door conventionele fenolchloroformextractie of met een commerciële kit.

Voer diagnostische PCR uit voor pLEXSY-sat2.1 met behulp van een fietsprotocol zoals beschreven in het manuscript. Bereid na bevestiging van fluorescentie door middel van flowcytometrie een verdunning van recombinante parasieten in een concentratie van vijf promastigoten per milliliter. Voeg 100 microliter van deze verdunning toe aan elk putje van een 96-putplaat en laat de plaat minstens 12 uur ongestoord.

Volg de plaat microscopisch met een minimale vergroting van 100X totdat putjes met parasietgroei worden gedetecteerd. Wanneer een put vol parasieten zit, gebruik dan de inhoud om een cultuur van vijf milliliter te enten. Zodra de gekloonde gezaaide culturen de stationaire fase bereiken, controleert u de fluorescentie met behulp van flowcytometrie zoals eerder beschreven.

Selecteer klonen met 98% tot 99% fluorescerende parasieten en de hoogste gemiddelde fluorescentie-intensiteit voor in vitro en in vivo assays. Kolonie-PCR van de E.coli-cellen getransformeerd met pLEXSY eGFP-construct genereerde een 859-basenpaarproduct. Totale vertering van het plasmide met behulp van SWA1 resulteerde in twee fragmenten, een 2,9 kilobasepaarfragment met alle noodzakelijke elementen voor replicatie en selectie in E.coli en een zeven tot acht kilobasepaarfragment dat de gelineariseerde expressiecassette vertegenwoordigt die wordt gebruikt voor transfectie.

Flowcytometrie-analyse toonde aan dat 82% van de getransfecteerde L.panamensis-parasieten eGFP tot expressie bracht. Na polyklonale selectie was 98,44% van de L.donovani-parasieten geanalyseerd door flowcytometrie fluorescerend in vergelijking met 82,0% van L.panamensis. De succesvolle integratie van pLEXSY eGFP in de SSU-locus resulteerde in een 2,3 kilobasepaarproduct in de diagnostische PCR.

Klonen met het hoogste percentage fluorescerende parasieten en gemiddelde fluorescentie-intensiteit werden geselecteerd voor verder gebruik in screeningstests voor geneesmiddelen. Deze methode maakt de productie van recombinante Leishmania-parasieten mogelijk met de