Inzicht in de impact van gematigde bacteriofagen op hun lysogenen door middel van transcriptomics

Profagen zijn bacteriefagen, die zijn geïntegreerd in bacteriële genomen. We gebruiken een transcriptomische benadering om de impact van profagen op de biologie van hun bacteriële gastheren uitgebreid te onderzoeken. De hier beschreven methoden richten zich op de belangrijkste uitdaging van spontane inductie van de profaag-lytische cyclus.

Zorgvuldige optimalisatie van kweekomstandigheden maakt een zuivere profilering van genexpressie tijdens de profaagetoestand mogelijk. Profagen worden aangetroffen in de meeste bacteriële pathogenen, maar de betekenis wordt meestal niet begrepen. Deze hulpmiddelen kunnen de rol van profagen als regulatoren van meerdere bacteriële functies belichten.

Er zijn bijna onbeperkte relaties tussen profagage-gastheren die niet bestudeerd zijn. Dit vertegenwoordigt een enorme onaangeboorde bron van potentiële therapeutische doelen die deze protocollen kunnen helpen voorspellen. De belangrijkste uitdaging is het vinden van de juiste kweekconditie om de groei van lysogeen en spontane profage-inductie in evenwicht te brengen.

De bekende secundaire uitdaging, lyson, het handhaven van de RNA-integriteit voor stroomafwaartse studies. Om te beginnen met het opzetten van verse lysogene en indicatorgastheerculturen door de nachtculturen te inoculeren in 100 milliliter LB in een verhouding van één op 100. Incuberen bij 37 graden Celsius met schudden bij 180 RPM.

Om de groei van lysogeen te volgen, verzamelt u gedurende acht uur elk uur een monster van één milliliter vanaf het punt van inoculatie. Verdun de cultuur serieel door 100 microliter toe te voegen aan 900 microliter van het LV-medium. Vortex op de maximale snelheid en ga door met de verdunningsreeks van 10 tot min één tot 10 tot min negen.

Breng 10 microliter van de vereiste verdunning aan op een LB-vijzelplaat. Laat drogen en incuberen bij 30 graden Celsius gedurende 18 tot 24 uur. Tel na incubatie het aantal kolonies en bereken het aantal levensvatbare bacteriecellen met behulp van de gegeven formule.

Voeg vervolgens, om de infectieuze faagdeeltjes in het temporele monster op te sommen, 100 microliter logfase rifampicine-resistente indicatorgastheercellen toe aan de gesmolten bovenste vijzel, samen met rifampicine. Breng 10 microliter serieel verdunde lysogeencultuur aan op de geënte bovenste vijzellaag. Laat drogen en incuberen bij 37 graden Celsius gedurende 18 tot 24 uur.

Tel na incubatie het aantal plaques en bereken de infectieuze faagdeeltjes met behulp van de gegeven formule. Etiketteer de eerste kolf als niet-geïnduceerd en de andere als geïnduceerd, samen met de tijdstippen waarop elk monster moet worden geoogst. Vervolgens subcultuur de 's nachts gekweekte lysogene culturen in 80 milliliter LB in een verhouding van één tot 100 in acht kolven van 250 milliliter.

Incubeer de kolven bij 37 graden Celsius en schud bij 180 RPM. Voeg na 90 minuten, wanneer de optische dichtheid op 600 nanometer tussen 0,1 en 0,2 ligt, vier microliter 1% ijsazijn toe aan de niet-geïnduceerde kolf. Voeg de 80 milliliter cultuur van de niet-geïnduceerde kolf toe aan 720 milliliter LB en voeg onmiddellijk 160 milliliter stopoplossing toe voordat u de kolf gedurende 30 minuten op ijs plaatst om de RNA-transcripten te stabiliseren.

Voeg vervolgens norfloxacine in een eindconcentratie van één microgram per milliliter toe aan de geïnduceerde gelabelde kolf met 80 milliliter cultuur. Meng goed en incubeer bij 37 graden Celsius met schudden op 180 RPM gedurende een uur. Laat de cellen herstellen door 80 milliliter geïnduceerde kweek toe te voegen aan 720 milliliter LB. Oogst de bacteriecellen uit elke kolf elke 10 minuten van nul tot een uur door een stopoplossing toe te voegen.

Centrifugeer bij 10.000 G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg. Voordat u de pellet voorzichtig opnieuw suspendeert in de resterende vloeistof met behulp van de verstelbare automatische pipet. Breng de suspensie over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en centrifugeer gedurende één minuut bij 13.000 g bij vier graden Celsius.

Gooi het resterende supernatans weg en sluit de microfuge-buis, voordat u de pellets snel invriest tot vloeibare stikstof. Voeg een milliliter Trizol toe aan elke bevroren pellet en homogeniseer de suspensie door te pipetteren. Na het identificeren van een set doelgenen die kunnen fungeren als markers voor elk stadium van replicatie van de faag van belang, amplificeert u elk van de doelgenen uit het genomische DNA met behulp van relevante primers.

Voer PCR uit met behulp van de amplificatiecondities die in het tekstmanuscript worden beschreven. Na PCR wordt met behulp van een PCR-zuiveringskit elk amplicon gezuiverd en gekloond in een TA-kloonvector volgens de instructies van de fabrikant. Controleer de volgorde van elk gekloond product door middel van Sanger-sequencing.

Na het berekenen van het aantal kopieën van vier individuele plasmiden, bereidt u een standaardsjabloon voor elk markergen voor door het plasmide-DNA serieel te verdunnen in nucleasevrij water. Voeg één microliter CDNA en de respectieve plasmidestandaarden toe voor elk doel in een plaat met 96 putjes. En voer kwantitatieve PCR uit volgens de instructies van de fabrikant.

Gebruik na PCR het Excel-programma om het aantal log-DNA-kopieën uit te zetten tegen de cyclusdrempel. Voer een lineaire regressieberekening uit om de bepalingscoëfficiënt en een lineaire vergelijking weer te geven. Schat vervolgens het aantal kopieën voor elk doel met behulp van de lineaire vergelijking die is afgeleid van de lineaire regressie.

Bereken vervolgens de werkzaamheid van de PCR-amplificatie met behulp van de parameters uit de lineaire regressie van de standaardcurve en de gegeven vergelijking. Na het valideren van primers in termen van hun procentuele efficiëntie, berekent u het absolute aantal kopieën van het DNA. Temporele opsomming van spontane minder profageproductie suggereerde de laagste PFU-aantallen per cel na twee uur en de hoogste PFU-aantallen per cel na zes uur.

Het lysogeen was toen het meest stabiel na twee uur. Deze voorwaarde werd dus gebruikt voor QRTPCR-profilering. Een duidelijke toename van de expressie van het cro-gen, een vroege marker van lytische replicatie van 2,31 keer 10 tot de negende kopie in niet-geïnduceerde culturen tot 3,02 keer 10 tot de 11e kopie 30 minuten na inductie werd waargenomen.

Evenzo vertoonden P- en O-eiwitten, de marker in het middenstadium van lytische replicatie, ook een significante opregulatie van respectievelijk 1,74 keer 10 naar de achtste naar 1,25 keer 10 naar de 10e kopieën, en van 6,05 keer 10 naar de tweede tot 5,68 keer 10 tot de vijfde kopieën. De late marker van de lytische replicatiecyclus vertoonde een aanzienlijke toename van de expressie in niet-geïnduceerde culturen tot 30 minuten na inductie. Van de geteste interne controles had RPOD de meest stabiele expressie in vergelijking met 16 SRNA- of ProC-genen.

Vergeleken met de markers voor lytische replicatie was de expressie van het C-one-gen relatief stabiel. Toch was het aantal kopieën van het C-one-gen geruststellend hoog in de niet-geïnduceerde culturen, vergeleken met de markers voor lytische replicatie. Er kunnen geen goede gegevens of interpretaties uit een slecht voorbereide RNA-bibliotheek komen.

Het beheersen van spontane inductie en RNA-integriteit zijn de belangrijkste dingen. De temporele dynamiek van elk gen kan worden bestudeerd met behulp van expressieprofilering. Het afstemmen van de juiste experimentele omstandigheden en tijdstippen is belangrijk voor het correct in kaart brengen van biologische reacties op elke stimulus.

Deze techniek heeft voorheen onbekende interacties geïdentificeerd tussen twee verschillende prophage-gastheerpartnerschappen. Aangezien de meeste bacteriën niet-bestudeerde profagen bevatten, zou deze benadering kunnen helpen om veel nieuwe therapeutische doelen of toepassingen te ontdekken.