"Celoppervlakvangst"-werkstroom voor labelvrije kwantificering van het celoppervlak-proteoom
March 24th, 2023
Hier beschrijven we een proteomics workflow voor de karakterisering van het celoppervlakteproteoom van verschillende celtypen. Deze workflow omvat verrijking van celoppervlakte-eiwitten, daaropvolgende monstervoorbereiding, analyse met behulp van een LC-MS/MS-platform en gegevensverwerking met gespecialiseerde software.
Dit protocol stelt ons in staat om antigenen die aanwezig zijn op het celoppervlak van verschillende celtypen te onderzoeken om antigenen specifiek voor dat type cel of weefsel te vinden. De techniek die we hier presenteren maakt verrijking van celmembraaneiwitten uit een volledige cellysaat mogelijk, uiteindelijk voor analyse door middel van massaspectrometrie-gebaseerde proteomics. Dus een specifieke toepassing van dit protocol is om het toe te passen op tumorcellen om te zoeken naar antigenen die aanwezig zijn op het oppervlak van die kankercellen en niet op normale cellen die kunnen dienen als nieuwe doelen voor kanker immunotherapieën.
Een ding om op te merken over dit protocol is dat het belangrijk kan zijn om uw steekproefinput te optimaliseren voor uw experiment van belang. Dus het kan meerdere iteraties of titraties duren om de optimale omstandigheden te vinden. Dus het demonstreren van de procedure zal Akul Naik zijn, een junior specialist uit ons laboratorium.
Om te beginnen, verwijdert u de bevroren biotin-gelabelde cel pellet uit min 80 graden Celsius en ontdooit deze op ijs. Voeg 500 microliter 2X Lysis Buffer toe aan de pellet, meng grondig en vortex krachtig gedurende 30 seconden. Soniceer het cellysaat op ijs en centrifugeer het lysaat bij 17.200 G gedurende 10 minuten bij 4 graden Celsius om eventuele resterende deeltjes te bezinken.
Terwijl het lysaat wordt gecentrifugeerd, voegt u 100 microliter NeutrAvidin Agarose harskralen toe aan een filtratiekolom die is bevestigd aan de vacuüm manifold. Breng een zachte vacuüm aan en was de kralen door 3 milliliter Wash Buffer 1 erover te laten stromen. Verwijder de filtratiekolom van de vacuüm manifold, sluit de onderkant en voeg de opgehelderde cellysaat toe aan de kolom met de kralen.
Sluit de bovenkant van de kolom af en incubeer het lysaat met de kralen op een end-to-end rotor gedurende 120 minuten bij 4 graden Celsius. Nadat de lysaatincubatie is voltooid, plaatst u de filtratiekolom terug op de vacuüm manifold en brengt u een zachte vacuüm aan. Was de kralen door vijf milliliter Wash Buffer 1 erover te laten stromen.
Herhaal de wasstap met vijf milliliter Wash Buffer 2 en Wash Buffer 3. Zodra de laatste Wash Buffer volledig door de kralen is gestroomd, verwijdert u de kolom van de manifold. Voeg vervolgens 100 microliter lyse-oplossing toe aan de kralen en breng ze over naar een 1,7-milliliter lage eiwitbinding micro centrifugeerbuis met een pipet.
Spin de buis kort om de kralen te laten bezinken en verwijder 50 microliter van de oplossing. Plaats vervolgens de buis op een heat block shaker bij 65 graden Celsius gedurende 10 minuten bij 1000 RPM schommelen. Resuspendeer het gedroogde trypsine in de verteringsbuis uit de kit door 210 microliter van de resuspendeeroplossing toe te voegen en deze meerdere keren op en neer te pipetten om ervoor te zorgen dat al het gedroogde trypsine is gesuspendeerd.
Aan het einde van de kraalincubatie, verwijdert u deze van de heat block shaker en voegt u 50 microliter van de gesuspendeerde trypsinoplossing toe aan de kralen. Incubeer de buis bij 37 graden Celsius, schommelend bij 500 RPM gedurende minimaal 90 minuten om het eiwit te verteren. Zodra de vertering voltooid is, brengt u de oplossing met de kralen over naar een spinkolom en plaatst u de kolom in een 1,7-milliliter lage eiwitbinding micro centrifugeerbuis.
Spin de buis om de geverteerde peptide-oplossing te scheiden van de kralen. Voeg vervolgens 100 microliter van de stopoplossing toe om de verteringsreactie te stoppen en de peptide-oplossing te acidificeren. Gebruik een buisadapter om een desalting kolom in een 1,7-milliliter lage eiwitbinding micro centrifugeerbuis te plaatsen.
Voeg de volledige geacidificeerde peptide-oplossing toe aan de kolom. Spin de kolom bij 3.800 G gedurende 3 minuten, zodat de oplossing door de kolom stroomt. Gooi de flow-through weg, omdat de peptiden nu aan de kolom zijn gebonden.
Voeg 200 microliter Wash 1-oplossing toe aan de kolom, spin bij 3.800 G gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur en gooi vervolgens de flow-through weg. Herhaal de wasstap met 200 microliter Wash 2-oplossing. Breng de kolom over naar een nieuwe gelabelde 1,7-milliliter lage eiwitbinding micro centrifugeerbuis.
Voeg 100 microliter elueeroplossing toe aan de kolom en spin bij 3.800 G gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. De peptiden worden nu van de kolom geëlueerd in de buis. Plaats de peptide-oplossing in een vacuümcentrifuge en laat deze overnacht drogen.
Plaats de opgedroogde peptiden bij min 80 graden Celsius totdat ze klaar zijn om te kwantificeren en te analyseren op de massaspectrometer. Proteoomanalyse werd uitgevoerd om de verrijkte celoppervlak-eiwitten te karakteriseren met behulp van vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie. Een uiteindelijke peptideconcentratie van ongeveer 630 nanogram per microliter werd verkregen op basis van de colorimetrische peptide kwantificeringstest.
Massaspectrometrie gegevens geanalyseerd met behulp van MaxQuant en daaropvolgende dataset analyse van de celoppervlak-eiwitten leverde 601 oppervlakte-eiwitten in het monster op, ongeveer 27% van alle geïdentificeerde eiwitten. Een plot die de verdeling van het geïdentificeerde eiwit in Andromeda score weergeeft, is hier getoond, en de scatter plot illustreert de correlatie van monster tot monster. De boxplots tonen de variatie van run tot run.
En de monstergewijze verdelingsplot vertegenwoordigde de gegevenskwaliteit van replica's. Het belangrijkste om in gedachten te houden is waar de peptiden zich in elke stap bevinden. Aanvankelijk zitten ze in oplossing, dan zijn ze gebonden aan de kralen tot de vertering, dan zijn ze gebonden aan de desalting kolom totdat ze eindelijk worden geëlueerd.
Volgens deze procedure zijn er verschillende manieren om een aantal van de geïdentificeerde eiwitten te valideren, zoals gerichte flowcytometrie en gerichte proteomics. Dit zal meer gedetailleerde informatie geven over de expressieniveaus van deze eiwitt
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft een workflow voor het karakteriseren van het celoppervlakte-proteoom van verschillende celtypen, met focus op antigeenidentificatie. Het omvat stappen voor eiwitverrijking, monstervoorbereiding en massaspectrometrieanalyse.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Proteomics
- Celbiologie
- Kankeronderzoek
Achtergrond
- Het begrijpen van celoppervlakte-eiwitten is cruciaal voor het identificeren van specifieke antigenen.
- Celmembraaneiwitten kunnen dienen als doelwitten voor immunotherapieën.
- Optimalisatie van monsterinvoer is essentieel voor nauwkeurige resultaten.
- Dit protocol kan worden toegepast op verschillende celtypen, inclusief tumorcellen.
Doel van het onderzoek
- Om celoppervlakte-eiwitten uit volledige cellysaten te verrijken en te analyseren.
- Om antigenen specifiek voor verschillende celtypen te identificeren.
- Om mogelijke doelwitten voor kankerimmunotherapie te verkennen.
Gebruikte methoden
- Technieken voor eiwitverrijking aan het celoppervlak.
- Monstervoorbereiding voor massaspectrometrie.
- LC-MS/MS-analyse voor eiwitidentificatie.
- Gegevensverwerking met gespecialiseerde software.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle verrijking van celmembraaneiwitten.
- Identificatie van unieke antigenen op tumorcellen.
- Demonstratie van de effectiviteit van het protocol door middel van iteratieve optimalisatie.
- Mogelijkheid tot het ontdekken van nieuwe doelwitten voor kankerimmunotherapie.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van celoppervlakte-proteooms.
- Het benadrukt het belang van het optimaliseren van experimentele condities.
- De bevindingen kunnen leiden tot verbeteringen in kankerbehandelingsstrategieën.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Comprehensive cell surface proteome profiling is critical for target validation and therapeutic hypothesis generation in oncology and immunotherapy pipelines. The described workflow enables label-free quantification and enrichment of membrane proteins, directly supporting the identification of disease-specific antigens and actionable targets. This capability enhances predictive confidence at the early discovery and lead identification stages, informing portfolio triage and risk-adjusted advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic identification of cell-type and disease-specific surface antigens for target nomination.
- Supports biological de-risking by distinguishing tumor-associated proteins from normal cell surface markers.
- Facilitates functional target validation through quantitative proteomic outputs.
- Improves predictive confidence for downstream immunotherapy and antibody development.
Screening & Assay Development
- Provides enriched, validated protein samples for robust assay development and screening workflows.
- Delivers quantitative, reproducible data suitable for standardization across discovery teams.
- Enables scalable profiling of multiple cell types or conditions for comparative analysis.
- Supports reliable evaluation of candidate molecules targeting surface proteins.
Translational & Preclinical Research
- Aligns surfaceome profiling with disease-relevant models to inform translational biomarker strategies.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by enabling targeted follow-up (e.g., flow cytometry, targeted proteomics).
- Reduces mechanistic ambiguity in target selection for preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing a bridge to preclinical validation for surface protein targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping the surfaceome landscape.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative protein enrichment for assay readiness and cross-sample comparison.
- Analytics: Generates robust mass spectrometry data and statistical outputs (e.g., Andromeda scores, sample-to-sample correlation) for confident decision-making.
- Translational Research: Enables targeted validation of candidate antigens in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for surfaceome profiling across diverse cell types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target selection.
- Operational Value: Standardizes enrichment and quantification workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by focusing on validated surface targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of immunotherapy and antibody programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in proteomics, mass spectrometry, and sample preparation optimization.
- Demands access to advanced analytical instrumentation and data processing software (e.g., MaxQuant).
- Necessitates cross-team standardization for sample input and workflow reproducibility.
- Adaptable to various cell types but may require iterative optimization for each context.
- Dependent on robust validation strategies (e.g., targeted flow cytometry) for downstream confirmation.
