Name: Celoppervlakvangst-werkstroom voor labelvrije kwantificering van het celoppervlak-proteoom (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Leer celoppervlak-eiwitten verrijken en analyseren voor proteomics en kankeronderzoek met LC-MS/MS. Deze methode identificeert specifieke antigenen op tumorcellen voor immunotherapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Dr. Kamal Mandal (Afdeling Laboratoriumgeneeskunde, UCSF) voor hulp bij het opzetten van de LC-MS/MS-run, Deeptarup Biswas (BSBE, IIT Bombay) voor hulp bij gegevensanalyse, en Dr. Audrey Reeves (Afdeling Laboratoriumgeneeskunde, UCSF) voor hulp bij gegevensanalyse. Verwant werk in het A.P.W. lab wordt ondersteund door NIH R01 CA226851 en de Chan Zuckerberg Biohub. Figuur 1 en Figuur 2B zijn gemaakt met BioRender.com.

OPMERKING: AMO1 plasmacytoomcellen werden gebruikt voor dit celoppervlak proteoomexperiment. Hetzelfde protocol kan ook worden gebruikt voor andere celtypen, inclusief een breed scala aan suspensie- en adherente cellijnen9, evenals verschillende soorten primaire monsters10. De celnummers (startmateriaal voor het experiment) moeten echter doorgaans worden geoptimaliseerd voor gelijkwaardige proteoomdekking. Voor details met betrekking tot materialen en apparatuur, zie de Tabel van Materialen. Voor details met betrekking tot buffers en reagentiëoplossingen en hun samenstelling, zie Tabel 1.
1. Celoppervlak labelen met biotin
<ol>
	<li>Tel de gekweekte cellen en pellet ongeveer 3,5 x 107 levende cellen door centrifugatie (5 min bij 500 x g, 24 °C). 
	OPMERKING: De AMO1 plasmacytoomcellen werden elke 3 dagen voorafgaand aan het oogsten gepasseerd met vers medium.</li>
	<li>Aspereer het supernatant en resuspendeer de pellet door 1 mL koude (4 °C) Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (D-PBS) (geen calcium, geen magnesium) toe te voegen en voorzichtig op en neer te pipetteren.</li>
	<li>Pellet de cellen opnieuw (zoals in stap 1.1) en herhaal de wasstap (stap 1.2) nog een keer (twee wasbeurten in totaal).</li>
	<li>Na de tweede wasbeurt, pellet de cellen (zoals in stap 1.1) en resuspendeer ze in 990 μL koude D-PBS door voorzichtig te pipetteren.</li>
	<li>Bereid vooraf een voorraadoplossing van 160 mM natriummetaperiodaat (NaIO4) voor. Splits in 50 μL aliquoten en bewaar bij -20 °C gedurende maximaal 6 maanden. Voeg 10 μL van 160 mM natriummetaperiodaat-oplossing toe aan de celsuspensie in stap 1.4, meng grondig en incubeer gedurende 20 min bij 4 °C op een end-to-end rotor.</li>
	<li>Nadat de incubatie voltooid is, pellet de cellen (zoals in stap 1.1), decanteer het supernatant en resuspendeer in 1 mL koude D-PBS. Herhaal deze wasstap twee keer (drie wasbeurten in totaal). Na de derde wasbeurt, resuspendeer de cellen in 989 μL D-PBS.</li>
	<li>Bereid vooraf een voorraadoplossing van 100 mM biocytinehydrazide voor. Splits in 50 μL aliquoten, en bewaar bij -20 °C gedurende maximaal 6 maanden. Voeg 1 μL aniline en 10 μL van 100 mM biocytinehydrazide toe aan de celsuspensie in stap 1.6, meng grondig en incubeer gedurende 60 min bij 4 °C op een end-to-end rotor.</li>
	<li>Nadat de incubatie voltooid is, pellet de cellen (zoals in stap 1.1), decanteer het supernatant en resuspendeer in 1 mL koude D-PBS. Herhaal deze wasstap twee keer (drie wasbeurten in totaal).</li>
	<li>Na de derde wasbeurt, aspireer het supernatant voorzichtig met een pipet, en snap-vries de celpellet door de buis in vloeibare N2 te plaatsen. Plaats de bevroren pellet bij -80 °C, totdat klaar om verder te gaan met lysis en pulldown.</li>
</ol>
2. Cellyse en biotin pulldown
<ol>
	<li>Ontdooi de bevroren celpellet op ijs.</li>
	<li>Voeg 500 μL van 2x lysisbuffer toe aan de pellet, meng grondig en vortex gedurende 30 s. 
	OPMERKING: Krachtig pipetteren en vortexen kunnen vereist zijn om de pellet volledig te lyseren. Sommige onoplosbare deeltjes (dwz DNA) zijn acceptabel, aangezien deze worden verwijderd in de daaropvolgende sonicatiestap.</li>
	<li>Soniceer het cellysaat op ijs (drie bursts, 20 s elk, 60% duty cycle).</li>
	<li>Centrifugeer het lysaat om eventuele resterende deeltjes te pelleten (10 min bij 17.200 x g bij 4 °C).</li>
	<li>Terwijl het lysaat wordt gecentrifugeerd, voeg 100 μL neutravidine agarose resin bead toe aan een filtratiekolom. Bevestig de kolom aan een vacuüm manifold, pas een lichte vacuüm toe en was de korrels door 3 mL wasbuffer 1 erdoor te laten stromen.</li>
	<li>Verwijder de filtratiekolom van de vacuüm manifold, doe de bodem af en voeg het opgehelderde cellysaat toe aan de kolom met de korrels. Doe de bovenkant van de kolom af en incubeer het lysaat met de korrels op een end-to-end rotor gedurende 120 min bij 4 °C. 
	OPMERKING: Wanneer de bovenkant van de kolom wordt afgedekt, moet de bodem stevig op zijn plaats worden gehouden, anders kan deze losraken en kan het cellysaat lekken tijdens de incubatie.</li>
	<li>Bereid wasbuffers 1, 2 en 3 voor (ongeveer 5 mL van elke wasbuffer per monster, zie Tabel 1) en plaats ze in een 42 °C waterbad</li>
	<li>Nadat het lysaat de incubatie heeft voltooid, plaats de filtratiekolom terug op de vacuüm manifold, pas een lichte vacuüm toe en was de korrels door 5 mL wasbuffer 1 erdoor te laten stromen. 
	OPMERKING: Meer dan 5 mL van de wasbuffers kan worden gebruikt voor het wassen; extra wassen kan achtergrond, niet-specifieke binding op de korrels verminderen.</li>
	<li>Herhaal de wasstap met 5 mL wasbuffer 2.</li>
	<li>Herhaal de wasstap met 5 mL wasbuffer 3.</li>
	<li>Zodra de laatste wasbuffer volledig door de korrels is gegaan, verwijder de kolom uit de manifold. Voeg 100 μL van de "Lyse" oplossing toe aan de korrels en breng ze over naar een 1,7 mL low-protein-binding microcentrifugebuis met een pipet. Spin de buis kort om de korrels te laten bezinken en verwijder 50 μL van de oplossing zonder de bezonken korrels te verstoren. 
	OPMERKING: De reagentia in deze stap en alle volgende stappen gebruiken een commercieel

<ol><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+exploration+of+proteome+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function.</a> Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).</li>
<li>Aslam, B., Basit, M. B., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics%3A+technologies+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatographic+Science%22%5BJournal%5D)">Proteomics: technologies and their applications.</a> Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).</li>
<li>Bausch-Fluck, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+silico+human+surfaceome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The in silico human surfaceome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (46), 10988-10997 (2018).</li>
<li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+advance+in+tumor+specific+antigens%3A+A+narrative+review%5BTitle%5D)+AND+%22AME+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Research advance in tumor specific antigens: A narrative review.</a> AME Medical Journal. 6, 35(2021).</li>
<li>Li, Y., Qin, H., Ye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+on+enrichment+methods+for+cell+surface+proteome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Separation+Science%22%5BJournal%5D)">An overview on enrichment methods for cell surface proteome profiling.</a> Journal of Separation Science. 43 (1), 292-312 (2020).</li>
<li>Wollscheid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+identification+and+relative+quantification+of+N-linked+cell+surface+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins.</a> Nature Biotechnology. 27 (4), 378-386 (2009).</li>
<li>Chandler, K. B., Costello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycomics+and+glycoproteomics+of+membrane+proteins+and+cell-surface+receptors%3A+present+trends+and+future+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Glycomics and glycoproteomics of membrane proteins and cell-surface receptors: present trends and future opportunities.</a> Electrophoresis. 37 (11), 1407-1419 (2016).</li>
<li>Ferguson, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surfaceome+of+multiple+myeloma+cells+suggests+potential+immunotherapeutic+strategies+and+protein+markers+of+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The surfaceome of multiple myeloma cells suggests potential immunotherapeutic strategies and protein markers of drug resistance.</a> Nature Communications. 13 (1), 4121(2022).</li>
<li>Karcini, A., Lazar, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SKBR3+cell-membrane+proteome+reveals+telltales+of+aberrant+cancer+cell+proliferation+and+targets+for+precision+medicine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The SKBR3 cell-membrane proteome reveals telltales of aberrant cancer cell proliferation and targets for precision medicine applications.</a> Scientific Reports. 12 (1), 10847(2022).</li>
<li>Köhnke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+multiomic+approach+for+identification+of+novel+immunotherapeutic+targets+in+AML%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+Research%22%5BJournal%5D)">Integrated multiomic approach for identification of novel immunotherapeutic targets in AML.</a> Biomarker Research. 10 (1), 43(2022).</li>
<li>Verma, A., Kumar, V., Ghantasala, S., Mukherjee, S., Srivastava, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+workflow+of+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics+of+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), e61786(2021).</li>
<li>Leung, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+and+thematic+remodeling+of+the+surfaceome+and+glycoproteome+on+isogenic+cells+transformed+with+driving+proliferative+oncogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Broad and thematic remodeling of the surfaceome and glycoproteome on isogenic cells transformed with driving proliferative oncogenes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (14), 7764-7775 (2020).</li>
<li>Nix, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+proteomics+reveals+CD72+as+a+target+for+in+vitro-evolved+nanobody-based+CAR-T+cells+in+KMT2A%2FMLL1-rearranged+B-ALL%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Surface proteomics reveals CD72 as a target for in vitro-evolved nanobody-based CAR-T cells in KMT2A/MLL1-rearranged B-ALL.</a> Cancer Discovery. 11 (8), 2032-2049 (2021).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Andromeda%3A+a+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li>
<li>Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+cancer+immunotherapy%3A+from+T+cell+basic+science+to+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice.</a> Nature Reviews Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).</li>
<li>Hosen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activated+conformation+of+integrin+%CE%B27+is+a+novel+multiple+myeloma-specific+target+for+CAR+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The activated conformation of integrin β7 is a novel multiple myeloma-specific target for CAR T cell therapy.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1436-1443 (2017).</li>
<li>Costa, A. F., Campos, D., Reis, C. A., Gomes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+glycosylation%3A+A+new+road+for+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting glycosylation: A new road for cancer drug discovery.</a> Trends in Cancer. 6 (9), 757-766 (2020).</li>
<li>Gundry, R. L., Boheler, K. R., Van Eyk, J. E., Wollscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+proteomics+in+the+discovery+of+cell-surface+markers+on+stem+cells%3A+Scratching+the+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics.+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">A novel role for proteomics in the discovery of cell-surface markers on stem cells: Scratching the surface.</a> Proteomics. Clinical Applications. 2 (6), 892-903 (2008).</li>
<li>Itzhak, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mass+spectrometry-based+approach+for+mapping+protein+subcellular+localization+reveals+the+spatial+proteome+of+mouse+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A mass spectrometry-based approach for mapping protein subcellular localization reveals the spatial proteome of mouse primary neurons.</a> Cell Reports. 20 (11), 2706-2718 (2017).</li>
<li>Kirkemo, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+tethered+promiscuous+biotinylators+enable+comparative+small-scale+surface+proteomic+analysis+of+human+extracellular+vesicles+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cell-surface tethered promiscuous biotinylators enable comparative small-scale surface proteomic analysis of human extracellular vesicles and cells.</a> eLife. 11, 73982(2022).</li>
<li>Wojtkiewicz, M., Berg Luecke, L., Kelly, M. I., Gundry, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+preparation+of+peptides+for+mass+spectrometry+analysis+in+bottom-up+proteomics+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Facile preparation of peptides for mass spectrometry analysis in bottom-up proteomics workflows.</a> Current Protocols. 1 (3), 85(2021).</li>
<li>Välikangas, T., Suomi, T., Elo, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+evaluation+of+popular+proteomics+software+workflows+for+label-free+proteome+quantification+and+imputation%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A comprehensive evaluation of popular proteomics software workflows for label-free proteome quantification and imputation.</a> Briefings in Bioinformatics. 19 (6), 1344-1355 (2018).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Bausch-Fluck, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mass+spectrometric-derived+cell+surface+protein+atlas%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A mass spectrometric-derived cell surface protein atlas.</a> PLoS One. 10 (3), 0121314(2015).</li>
<li>Griss, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ReactomeGSA-efficient+multi-omics+comparative+pathway+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">ReactomeGSA-efficient multi-omics comparative pathway analysis.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 19 (12), 2115-2125 (2020).</li>
<li>Waas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SurfaceGenie%3A+a+web-based+application+for+prioritizing+cell-type-specific+marker+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">SurfaceGenie: a web-based application for prioritizing cell-type-specific marker candidates.</a> Bioinformatics. 36 (11), 3447-3456 (2020).</li>
<li>Mellacheruvu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRAPome%3A+a+contaminant+repository+for+affinity+purification-mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).</li>
<li>van Oostrum, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+mouse+B+cell+types+using+surfaceome+proteotype+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Classification of mouse B cell types using surfaceome proteotype maps.</a> Nature Communications. 10 (1), 5734(2019).</li>
<li>Berg Luecke, L., Gundry, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+streptavidin+bead+binding+capacity+to+improve+quality+of+streptavidin-based+enrichment+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Assessment of streptavidin bead binding capacity to improve quality of streptavidin-based enrichment studies.</a> Journal of Proteome Research. 20 (2), 1153-1164 (2021).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

Proteomics op basis van massaspectrometrie is een krachtig hulpmiddel dat een onbevooroordeelde karakterisering van duizenden onbekende eiwitten op een voorheen onmogelijke schaal mogelijk heeft gemaakt. Deze aanpak stelt ons in staat om eiwitten te identificeren en te kwantificeren, evenals een reeks inzichten te verzamelen over de structurele en signaalcapaciteiten van cellen en weefsels, door de verscheidenheid aan eiwitten in een specifiek monster te karakteriseren. Verder dan globale eiwitprofilering in een monster,...

Eiwitten dienen als fundamentele eenheden waardoor het merendeel van cellulaire functies wordt uitgevoerd. Het karakteriseren van de structuur en functie van relevante eiwitten is een essentiële stap om biologische processen te begrijpen. In het afgelopen decennium hebben vorderingen in massaspectrometrie technologie, analysesoftware en databases de nauwkeurige detectie en meting van eiwitten op een proteoom-breed niveau mogelijk gemaakt1. Massaspectrometrie-gebaseerde proteomiek kan worden gebruikt in een diverse reeks toepassingen, van basiswetenschappelijke analyse van biochemische paden, tot identificatie van nieuwe doelwitten voor geneesmiddelen in een translationeel kader, tot diagnose en monitoring van ziekten in de kliniek2. Bij het screenen op nieuwe doelwitten voor geneesmiddelen is de karakterisering van het celoppervlak proteoom bijzonder belangrijk, met meer dan 65% van de momenteel goedgekeurde humane geneesmiddelen die zich richten op celoppervlakte-eiwitten3. Het gebied van kankerimmunotherapie is ook volledig afhankelijk van kanker-specifieke celoppervlakte-antigenen om tumorcellen te targeten en specifiek te elimineren4. Massaspectrometrie-gebaseerde proteomiek kan dus dienen als een veelbelovend hulpmiddel om nieuwe celoppervlakte-eiwitten te identificeren voor therapeutische interventies.
Er zijn echter verschillende beperkingen bij het gebruik van conventionele proteomics-methoden om tumorcellen te onderzoeken op nieuwe celoppervlakte-eiwitdoelwitten. Een belangrijke zorg is dat oppervlakte-eiwitten een zeer klein deel uitmaken van de totale eiwitmoleculen in een cel. Daarom worden fragmenten van deze eiwitten gemaskeerd door een hoge abundantie van intracellulaire eiwitten bij het uitvoeren van massaspectrometrie-analyse van het gehele cellysaat5. Deze beperking maakt het uitdagend om het celoppervlakte-proteoom nauwkeurig te karakteriseren met een traditionele proteomics-workflow. Om deze uitdaging aan te pakken, is het noodzakelijk om manieren te ontwikkelen om celoppervlakte-eiwitten uit het gehele cellysaat te verrijken, vóór analyse op de massaspectrometer. Een van deze methoden omvat de oxidatie en biotin-labeling van geglycoseerde celoppervlakte-eiwitten in intacte cellen, en daaropvolgende verrijking van deze biotinylerende eiwitten uit het lysaat met een neutravidine pulldown, een proces dat "celoppervlakte-vangst" wordt genoemd6. Aangezien ~85% van de zoogdierceloppervlakte-eiwitten glycosyleerd worden geacht7, dient dit als een effectieve methode om het celoppervlakte-proteoom uit het hele cellysaat te verrijken. Dit artikel beschrijft een complete workflow, beginnend met gekweekte cellen, van celoppervlakte-biotin-labeling, en daaropvolgende monstervoorbereiding voor massaspectrometrie-analyse (Figuur 1). Over verschillende replica's biedt deze methode een robuuste dekking van het celoppervlakte-proteoom van een bepaald monster. Het gebruik van deze methode om het celoppervlakte-proteoom van zowel tumor- als gezonde cellen te karakteriseren, kan de ontdekking van nieuwe celoppervlakte-antigenen faciliteren om potentiële immunotherapeutische doelwitten te identificeren8.

<table><tbody><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96X iST Sample Preparation Kit</td><td>PreOmics</td><td>P.O.00027</td><td>Proteomics sample preparation kit. Bevat reagentia voor reductie, alkylering en digestie. Bevat ook ontzoutingskolommen en reagentia.&nbsp;</td></tr><tr><td>Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td><td>Thermo</td><td>23275</td><td>Peptide kwantificeringskit. Bevat peptide standaarden en componenten van werkreagentia.&nbsp;</td></tr><tr><td>Reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate</td><td>Millipore Sigma</td><td>09830-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin hydrazide</td><td>Biotium</td><td>90060</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (zonder calcium- en magnesiumzouten)</td><td>UCSF Cell Culture Facility</td><td>CCFAL003-225B01</td><td></td></tr><tr><td>Formic Acid</td><td>Honeywell</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Single-Use Cocktail</td><td>Thermo</td><td>1861280</td><td></td></tr><tr><td>High Capacity Neutravidin Agarose Resin</td><td>Thermo</td><td>29204</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>UCSF Cell Culture Facility</td><td>CCFAL001-22J01</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Lysis Buffer, 10x</td><td>Millipore Sigma</td><td>20-188</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Sodium metaperiodate</td><td>Alfa Aesar</td><td>13798</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Urea (Proteomics Grade)</td><td>VWR</td><td>M123-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC20 Automated Cell Counter</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>PrismR Microcentrifuge</td><td>Labnet International</td><td>C2500-R-230V</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>VWR</td><td>Branson Sonifier 240</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum Manifold</td><td>Promega</td><td>Promega Vac-Man</td><td></td></tr><tr><td>Shaking Heatblock</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf Thermomixer C</td><td></td></tr><tr><td>End-to-End rotator</td><td>Labnet</td><td>Revolver Adjustable Rotator</td><td></td></tr><tr><td>LC</td><td>Thermo</td><td>Ultimate 3000 HPLC en UHPLC</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrapole Orbitrap Mass Spectrometer</td><td>Thermo</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Biotek</td><td>Biotek Synergy 2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum Concentrator</td><td>Labconco</td><td>7810010</td><td></td></tr><tr><td>Benodigdheden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Protein LoBind Tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>1,7 mL Microcentrifuge Tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtratiekolomnen</td><td>Bio-Rad</td><td>7326008</td><td></td></tr><tr><td>Spin Columns</td><td>Thermo</td><td>69725</td><td></td></tr></tbody></table>

"celoppervlakvangst"-werkstroom voor labelvrije kwantificering van het celoppervlak-proteoom

"Cell Surface Capture" Workflow for Label-Free Quantification of the Cell Surface Proteome

Gedurende het afgelopen decennium heeft proteomics op basis van massaspectrometrie een grondige karakterisering van biologische systemen mogelijk gemaakt voor een breed scala aan toepassingen. Het celoppervlakte-proteoom ("surfaceome") bij menselijke ziekten is van groot belang, aangezien plasmamembraaneiwitten de primaire doelwitten zijn van de meeste klinisch goedgekeurde therapieën, evenals een belangrijk kenmerk om zieke cellen diagnostisch te onderscheiden van gezonde weefsels. Echter, de gefocuste karakterisering van membraan- en oppervlakte-eiwitten van de cel is uitdagend gebleven, voornamelijk vanwege de complexiteit van cellulaire lysaten, die eiwitten van belang maskeren door andere eiwitten met een hoge abundantie. Om deze technische barrière te overwinnen en het celoppervlakte-proteoom van verschillende celtypen nauwkeurig te definiëren met behulp van massaspectrometrie-proteomics, is het noodzakelijk om het cellysaat te verrijken voor celoppervlakte-eiwitten vóór analyse op de massaspectrometer. Dit artikel presenteert een gedetailleerde workflow voor het labelen van celoppervlakte-eiwitten van kankercellen, het verrijken van deze eiwitten uit het cellysaat, en daaropvolgende monstervoorbereiding voor massaspectrometrie-analyse.

Voor dit experiment hebben we het celoppervlakproteoom van een tumorcellijn gekarakteriseerd door N-glycosyleerde membraaneiwitten van intacte cellen te labelen met biotine, en deze gelabelde eiwitten uit het totale cellysaat te verrijken met een neutravidine-pulldown (Figuur 1). Daarnaast hebben we proteoomanalyse uitgevoerd met LC-MS/MS om de verrijkte celoppervlakte-eiwitten te karakteriseren. In tegenstelling tot de analyse van het volledige celproteoom was het doel hier om uits...

Hier beschrijven we een proteomics workflow voor de karakterisering van het celoppervlakteproteoom van verschillende celtypen. Deze workflow omvat verrijking van celoppervlakte-eiwitten, daaropvolgende monstervoorbereiding, analyse met behulp van een LC-MS/MS-platform en gegevensverwerking met gespecialiseerde software.

"Celoppervlakvangst"-werkstroom voor labelvrije kwantificering van het celoppervlak-proteoom

Over the past decade, mass spectrometry-based proteomics has enabled an in-depth characterization of biological systems across a broad array of ...

Dit protocol stelt ons in staat om antigenen die aanwezig zijn op het celoppervlak van verschillende celtypen te onderzoeken om antigenen specifiek voor dat type cel of weefsel te vinden. De techniek die we hier presenteren maakt verrijking van celmembraaneiwitten uit een volledige cellysaat mogelijk, uiteindelijk voor analyse door middel van massaspectrometrie-gebaseerde proteomics. Dus een specifieke toepassing van dit protocol is om het toe te passen op tumorcellen om te zoeken naar antigenen die aanwezig zijn op het oppervlak van die kankercellen en niet op normale cellen die kunnen dienen als nieuwe doelen voor kanker immunotherapieën.Een ding om op te merken over dit protocol is dat het belangrijk kan zijn om uw steekproefinput te optimaliseren voor uw experiment van belang. Dus het kan meerdere iteraties of titraties duren om de optimale omstandigheden te vinden. Dus het demonstreren van de procedure zal Akul Naik zijn, een junior specialist uit ons laboratorium.Om te beginnen, verwijdert u de bevroren biotin-gelabelde cel pellet uit min 80 graden Celsius en ontdooit deze op ijs. Voeg 500 microliter 2X Lysis Buffer toe aan de pellet, meng grondig en vortex krachtig gedurende 30 seconden. Soniceer het cellysaat op ijs en centrifugeer het lysaat bij 17.200 G gedurende 10 minuten bij 4 graden Celsius om eventuele resterende deeltjes te bezinken.Terwijl het lysaat wordt gecentrifugeerd, voegt u 100 microliter NeutrAvidin Agarose harskralen toe aan een filtratiekolom die is bevestigd aan de vacuüm manifold. Breng een zachte vacuüm aan en was de kralen door 3 milliliter Wash Buffer 1 erover te laten stromen. Verwijder de filtratiekolom van de vacuüm manifold, sluit de onderkant en voeg de opgehelderde cellysaat toe aan de kolom met de kralen.Sluit de bovenkant van de kolom af en incubeer het lysaat met de kralen op een end-to-end rotor gedurende 120 minuten bij 4 graden Celsius. Nadat de lysaatincubatie is voltooid, plaatst u de filtratiekolom terug op de vacuüm manifold en brengt u een zachte vacuüm aan. Was de kralen door vijf milliliter Wash Buffer 1 erover te laten stromen.Herhaal de wasstap met vijf milliliter Wash Buffer 2 en Wash Buffer 3. Zodra de laatste Wash Buffer volledig door de kralen is gestroomd, verwijdert u de kolom van de manifold. Voeg vervolgens 100 microliter lyse-oplossing toe aan de kralen en breng ze over naar een 1,7-milliliter lage eiwitbinding micro centrifugeerbuis met een pipet.Spin de buis kort om de kralen te laten bezinken en verwijder 50 microliter van de oplossing. Plaats vervolgens de buis op een heat block shaker bij 65 graden Celsius gedurende 10 minuten bij 1000 RPM schommelen. Resuspendeer het gedroogde trypsine in de verteringsbuis uit de kit door 210 microliter van de resuspendeeroplossing toe te voegen en deze meerdere keren op en neer te pipetten om ervoor te zorgen dat al het gedroogde trypsine is gesuspendeerd.Aan het einde van de kraalincubatie, verwijdert u deze van de heat block shaker en voegt u 50 microliter van de gesuspendeerde trypsinoplossing toe aan de kralen. Incubeer de buis bij 37 graden Celsius, schommelend bij 500 RPM gedurende minimaal 90 minuten om het eiwit te verteren. Zodra de vertering voltooid is, brengt u de oplossing met de kralen over naar een spinkolom en plaatst u de kolom in een 1,7-milliliter lage eiwitbinding micro centrifugeerbuis.Spin de buis om de geverteerde peptide-oplossing te scheiden van de kralen. Voeg vervolgens 100 microliter van de stopoplossing toe om de verteringsreactie te stoppen en de peptide-oplossing te acidificeren. Gebruik een buisadapter om een desalting kolom in een 1,7-milliliter lage eiwitbinding micro centrifugeerbuis te plaatsen.Voeg de volledige geacidificeerde peptide-oplossing toe aan de kolom. Spin de kolom bij 3.800 G gedurende 3 minuten, zodat de oplossing door de kolom stroomt. Gooi de flow-through weg, omdat de peptiden nu aan de kolom zijn gebonden.Voeg 200 microliter Wash 1-oplossing toe aan de kolom, spin bij 3.800 G gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur en gooi vervolgens de flow-through weg. Herhaal de wasstap met 200 microliter Wash 2-oplossing. Breng de kolom over naar een nieuwe gelabelde 1,7-milliliter lage eiwitbinding micro centrifugeerbuis.Voeg 100 microliter elueeroplossing toe aan de kolom en spin bij 3.800 G gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. De peptiden worden nu van de kolom geëlueerd in de buis. Plaats de peptide-oplossing in een vacuümcentrifuge en laat deze overnacht drogen.Plaats de opgedroogde peptiden bij min 80 graden Celsius totdat ze klaar zijn om te kwantificeren en te analyseren op de massaspectrometer. Proteoomanalyse werd uitgevoerd om de verrijkte celoppervlak-eiwitten te karakteriseren met behulp van vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie. Een uiteindelijke peptideconcentratie van ongeveer 630 nanogram per microliter werd verkregen op basis van de colorimetrische peptide kwantificeringstest.Massaspectrometrie gegevens geanalyseerd met behulp van MaxQuant en daaropvolgende dataset analyse van de celoppervlak-eiwitten leverde 601 oppervlakte-eiwitten in het monster op, ongeveer 27% van alle geïdentificeerde eiwitten. Een plot die de verdeling van het geïdentificeerde eiwit in Andromeda score weergeeft, is hier getoond, en de scatter plot illustreert de correlatie van monster tot monster. De boxplots tonen de variatie van run tot run.En de monstergewijze verdelingsplot vertegenwoordigde de gegevenskwaliteit van replica's. Het belangrijkste om in gedachten te houden is waar de peptiden zich in elke stap bevinden. Aanvankelijk zitten ze in oplossing, dan zijn ze gebonden aan de kralen tot de vertering, dan zijn ze gebonden aan de desalting kolom totdat ze eindelijk worden geëlueerd.Volgens deze procedure zijn er verschillende manieren om een aantal van de geïdentificeerde eiwitten te valideren, zoals gerichte flowcytometrie en gerichte proteomics. Dit zal meer gedetailleerde informatie geven over de expressieniveaus van deze eiwitt

cell-surface-capture-workflow-for-label-free-quantification-cell

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Een eenvoudige en specifieke methode werd aangetoond voor tl-etikettering en de verbeterde detectie van cel-oppervlakte-eiwitten zonder fractionering stap. Differentiële overvloed in cel oppervlakte-eiwitten werd geanalyseerd met behulp van twee-dimensionale (2-D) elektroforese en Ettan ™ DIGE technologie.

Selectieve Etikettering van Cell-oppervlakte-eiwitten met behulp van CyDye DIGE Fluor Minimal Kleurstoffen

Advances in massaspectrometrie toestemming hebben high throughput analyse van eiwitexpressie en modificatie in een groot aantal weefsels. Gecombineerd met subcellulaire fractionering en ziektemodellen, kwantitatieve massaspectrometrie en bioinformatica nieuwe eigenschappen kunnen onthullen in biologische systemen. De werkwijze hierin beschreven analyseert chromatine-geassocieerde eiwitten in de vaststelling van hart-en vaatziekten en is gemakkelijk toepasbaar op...

Kwantitatieve analyse van chromatine proteomen in de ziekte van

Celoppervlakeiwitten biologisch belangrijke en sterk geglycosyleerd. We introduceren hier een glycopeptide-capture benadering oplosbaar te maken, te verrijken, en deglycosylate deze eiwitten voor facile LC-MS gebaseerde proteomics analyses.

Glycopeptide Capture voor celoppervlak Proteomics

Gepresenteerd is een flexibele informatica workflow waardoor multiplex-image-based analyse van fluorescent gelabelde cellen. De workflow kwantificeert nucleaire en cytoplasmatische markers en berekent marker translocatie tussen deze compartimenten. Procedures zijn voorzien verstoring van cellen met siRNA en betrouwbare methode voor het merkerdetectie door indirecte immunofluorescentie in 96-well formaat.

Workflow voor High-inhoud, individuele cel Kwantificering van fluorescente merkers van Universal Microscoop gegevens, Ondersteund door Open Source Software

Intercellulaire communicatie kritisch om diverse fysiologische activiteiten binnen en buiten de cel. Dit document beschrijft een protocol voor het meten van de ruimtelijke en temporele karakter van enkele cel afscheidingen. Om dit te bereiken, is een multidisciplinaire aanpak waarin label-free nanoplasmonic sensing met live-cell imaging integreert.

A-Label gratis Techniek voor de ruimte en tijd Imaging van Single Cell afscheiding

We beschrijven hier een methode voor de identificatie van klein molecuul-bindende eiwitten met behulp van fotoaffiniteitslabeling. Het voordeel van deze techniek is dat binding en covalente labeling van de doeleiwitten plaatsvindt binnen de levende cellulaire omgeving, waardoor het risico van verstoring van de native eiwitstructuur en bindingscondities bij cellyse wordt geëlimineerd.

Identificatie van kleine synthetische molecules bindende eiwitten in een Inheemse cellulaire omgeving door live-cell fotoaffiniteitslabeling

We presenteren een protocol om te kwantificeren nauwkeurig eiwitten met isobaar etikettering, uitgebreide fractionering, bioinformatica tools en kwaliteitscontrole stappen in combinatie met vloeibare chromatografie geïnterfacet met een hoge resolutie massaspectrometer.

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

Dit manuscript beschrijft het protocol voor Bimolecular complementatie affiniteit zuivering (BiCAP). Deze nieuwe methode vergemakkelijkt de specifieke isolatie en downstream proteomic karakterisering van elk twee interacterende eiwitten, terwijl met uitzondering van VN-complexvorm individuele eiwitten evenals complexen gevormd met concurrerende bindende partners.

Ontleden multi signalering eiwitcomplexen door Bimolecular complementatie affiniteit zuivering (BiCAP)

Hier presenteren we een protocol om te beoordelen van de labeling homogeniteit voor elke soort eiwit in een complexe eiwitSteekproef op het niveau van één molecuul.

Proteoom bestrijkende kwantificering van Labeling homogeniteit op het niveau van één molecuul

Beschreven is een proteomica-workflow voor het identificeren van eiwit interactie partners uit een nucleaire subcellulaire fractie met behulp van immunoaffinity verrijking van een gegeven proteïne van belang en label-vrije massaspectrometrie. De workflow omvat subcellulaire fractionering, immunoprecipitatie, filter aided monstervoorbereiding, offline opruimen, massaspectrometrie, en een downstream bioinformatica pijpleiding.

Label-vrije Immunoprecipitation massaspectrometrie workflow voor grootschalige nucleaire interactome profilering

Hier presenteren we een protocol om het samenspel tussen gastheer en ziekteverwekker te profileren tijdens infectie door op massaspectrometrie gebaseerde proteomics. Dit protocol maakt gebruik van labelvrije kwantificering om veranderingen in eiwitrijkdom van zowel gastheer (bijv. macrofagen) als ziekteverwekker (bijv. Cryptococcus neoformans)in één experiment te meten.

Labelvrije kwantitatieve proteomics workflow voor discovery-driven host-pathogen interacties

Leer celoppervlak-eiwitten verrijken en analyseren voor proteomics en kankeronderzoek met LC-MS/MS. Deze methode identificeert specifieke antigenen op tumorcellen voor immunotherapie.

"Celoppervlakvangst"-werkstroom voor labelvrije kwantificering van het celoppervlak-proteoom

Meer video's verkennen