TACI: Een ImageJ Plugin voor 3D Calcium Imaging Analyse

Tijdens het opnemen van calciumbeeldvorming bewegen cellen in alle richtingen. Er zijn veel hulpmiddelen ontwikkeld om de X- en Y-beweging te corrigeren, maar beweging op de Z-as moet ook expliciet worden gediagnosticeerd en gecorrigeerd. TACI is een gebruiksvriendelijke open source image J plug-in.

Het controleert Z-drift en analyseert 3D-calciumbeeldvorming met beweging in alle richtingen. Na het bereiden van de vliegenlarven, spoel ze drie keer in PBS. Pipetteer 75 microliter PBS op het midden van een glasplaat.

Zet een of twee larven in PBS en plaats de thermokoppel micrprobe in de buurt van de larven. Bedek de larven en het thermokoppel microprobe met een glazen afdekslip en sluit deze af met nagellak. Plaats de dia op het microscooppodium.

Vind de focus met behulp van een 25-voudig objectief en plaats de thermo-elektrische koeler op de glijbaan. In confocale software, focus op de fluorescerende cellen van belang. Pas het laservermogen aan om oververzadiging te voorkomen en stel de eerste en laatste segmentposities in de Z-stackinstelling in.

Start tegelijkertijd het scannen en de temperatuurregistratie van de Z-stack. Regel de voeding die de Peltier van stroom voorziet om de oppervlaktetemperatuur van de Peltier te veranderen. Stop daarna met het scannen van de Z-stack en de temperatuurregistratie.

Na het downloaden van de TACI calcium imaging dot jar installeert u de plug-in in Fiji door op plug-ins in de menubalk te klikken, gevolgd door installatie in het vervolgkeuzemenu. Start vervolgens Fiji opnieuw op en voer de plug-in uit door op plug-ins te klikken en TACI-calciumbeeldvorming te kiezen. Kies de functie naam wijzigen om de TIFF-bestandsnamen naar de gewenste structuur te converteren.

Kies de map waarin de TIFF-afbeeldingen moeten worden hernoemd door op Bladeren door mappen te klikken en wacht tot de bestandsnaam automatisch wordt ingevuld De mapnaam gebruiken. controleer de maximale T-positie en de maximale Z-positie. Zorg ervoor dat de parameterwaarden voor de maximale T-positie en de maximale Z-positie alle cijfers bevatten.

Voer de positie van elke parameter in de aangegeven volgorde in. Als de TIFF-bestandsnamen de zin en het kanaal niet bevatten, laat u de bijbehorende parameterwaarde leeg en kiest u NA in de aangegeven volgorde. Als er een posttekst is, toegevoegd aan de parameter posttext.

Klik op naam wijzigen om een map met dezelfde naam te maken, gevolgd door onderstrepingsteken R.Merk op dat de TIFF-bestandsnamen in de map zijn geherstructureerd om compatibel te zijn met de organisatiefunctie. Gebruik vervolgens de functie organiseren om de TIFF-afbeeldingen op dezelfde Z-positie in één map op te slaan. Kies de map waarin de T-afbeeldingen moeten worden geordend door op Bladeren door mappen te klikken.

Als het CSV-bestand met de parameter bestaat, wacht u totdat de parameterwaarden automatisch zijn ingevuld. Als het CSV-bestand van de parameter niet bestaat, vult u de parameterwaarden handmatig in. Zorg ervoor dat de parameterwaarden van fase en kanaal letters bevatten indien aanwezig, terwijl de parameterwaarden van de T-positie en Z-positie de grootste getallen van de T- en Z-posities moeten zijn.

Als de namen van de afbeeldingsbestanden de fase of het kanaal niet bevatten, voert u NA in. Maak vervolgens indien nodig TIFF-afbeeldingen in grijstinten door ervoor te zorgen dat het vakje R-afbeeldingen grijs is uitgeschakeld. Klik op Organiseren om een map met dezelfde naam te maken, gevolgd door grijze onderstrepingstekenstapels en om mappen met dezelfde naam te genereren, gevolgd door onderstrepingsteken en het Z-positienummer in de map. Merk vervolgens op dat de TIFF-bestanden in overeenkomstige mappen worden gesorteerd op Z-posities en dat een bestand met de naam param dot CSV wordt gegenereerd waarin de parameters en hun waarden kunnen worden gevonden.

Gebruik nu trackmate in Fiji om de fluorescentie-intensiteiten van de cellen van belang uit elke Z-positie te extraheren. Open de TIFF-afbeeldingen in een Z-positiemap van Fiji en voer TRACKMATE uit door op plug-ins te klikken en tracking te selecteren, gevolgd door Trackmate. Pas de parameters aan met behulp van DOG- of LOG-detectoren.

Wijzig de drempelwaarde voor de blobdiameter en het mediaanfilter. Stel de filters in om de irrelevante signalen te verwijderen. Stel de maximale afstand van de koppeling, de maximale afstand van de opening en de maximale framekloof voor het sluiten van de kloof in.

Exporteer de fluorescentie-intensiteiten van de relevante regio's naar een CSV-bestand. Maak voor elk neuron een map en geef deze een naam met behulp van het neuronnummer. Beginnend bij neuron nul.

Sla de CSV-bestanden met de fluorescentie-informatie van het overeenkomstige neuron op in de map. Geef de CSV-bestanden een naam als gemiddelde intensiteit Z-positienummer punt CSV en neem ten minste twee kolommen op, positie T en gemiddelde intensiteit, of gemiddelde intensiteitskanaal één. Maak het CSV-bestand met achtergrondonderstrepingstekenslijst dat de informatie van alle neuronen in een specifieke indeling bevat, te beginnen met neuron nul.

Vul de neuronnummers in, zoals neuron nul in rij één. Geef vervolgens de achtergrondintensiteit op voor elke geanalyseerde Z-positie. Als vier Z-posities worden geanalyseerd voor neuron nul, vul dan vier achtergrondintensiteitswaarden in onder neuron nul.

Sla het gemaakte CSV-bestand met achtergrondlijsten en mappen met de CSV-bestanden van de fluorescentie-informatie op in één map. Open TACI en kies de extractfunctie. Kies vervolgens de map door op bladeren door bestanden te klikken.

Het achtergrondbestand wordt automatisch ingevuld. Vul het grootste aantal T-posities in voor het aantal T-posities. Klik op uitpakken om een resultatenmap te maken met de CSV-bestanden en -plots van elk neuron.

De CSV-bestanden bevatten de maximale fluorescentie-intensiteit en delta F over delta nul op elke T-positie. De plots zijn lijndiagrammen van delta F over F nul versus T posities. Gebruik de samenvoegfunctie om het gemiddelde van de delta F over F nul van alle neuronen te berekenen.

Bereken de SEM en plot de gemiddelde delta F over F nul over T-posities. Kies de resultatenmap die door de extractiefunctie is gemaakt door op bladeren door bestanden te klikken. Vul het aantal T-posities in met het grootste aantal T-posities.

Klik op samenvoegen om een samengevoegde gegevensmap te maken, inclusief een samengevoegd CSV-bestand met onderstreepte gegevens en een PNG-plot met een gemiddeld onderstrepingsteken DF met nul punt. Het CSV-bestand bevat de gemiddelde en SEM-delta F over F nulinformatie op elke T-positie. De plot is een lijndiagram van de gemiddelde delta F over F nul over T posities.

Calciumbeeldvorming van koelcellen van vliegenlarven die GCaMP zes M tot expressie brengen, toont nauwelijks fluorescentie in de inactieve toestand bij 27 graden Celsius. De intracellulaire calciumspiegels namen echter snel toe bij 10 graden Celsius. De calciumspiegels daalden snel wanneer de temperatuur werd verhoogd.

Calciumbeeldvorming van vliegenhersenneuronen die GCaMP zes F tot expressie brachten op tijdstip 0,1 toonde fluorescentie in vier van de zeven neuronen en de intensiteit van deze neuronen nam in de loop van de tijd af. In aanwezigheid van octinal werden meerdere neuronen helderder. De fluorescentie van 10 neuronen nam gelijktijdig toe op tijdstip 92, wat suggereert dat deze paddenstoelneuronen reageren op octinale geur.

TACI kan overlappende cellen scheiden. In dit maximale projectiebeeld werden twee overlappende neuronen geïdentificeerd. Deze neuronen werden gescheiden in de orthro-weergave, wat aangeeft dat deze neuronen in verschillende Z-posities verschenen.

De oranje cel vertoonde het sterkste signaal op Z zeven terwijl de blauwe cel het sterkste signaal had op Z 10. De verandering in fluorescentie deze twee cellen en onthulde de vertraagde maar sterke activering van de oranje cel. Tijdens extractie wordt de maximale fluorescentiewaarde van alle Z-posities waarin een neuron verschijnt, gebruikt om de intensiteit van het neuron bij de overeenkomstige afzetting weer te geven.

Als TACI wordt gebruikt om een groot aantal neuronen te analyseren, moet enige registratie over Z-posities worden opgenomen in een nieuwe functie die moet worden ontwikkeld, georganiseerd met fluorescentie-informatie. TACI biedt een gebruiksvriendelijke, open source computationele benadering voor 3D-capsulebeeldvormingsanalyse om de celbeweging op de Z-as te controleren wanneer individuele cellen in meerdere Z-posities verschijnen.