Single-Molecule Imaging van Laterale Mobiliteit en Ion Channel Activity in Lipid Bilayers met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopie

Ionkanalen zijn niet statisch in biologische membranen. Hier presenteren we een optische benadering met één molecuul om het verband tussen laterale membraandiffusie en ionkanaalfunctie te ontrafelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden is dat fluorescerende etikettering van eiwitten die hun laterale beweging en functie kunnen verstoren, niet vereist is.

De methode kan worden toegepast op elk membraaneiwitkanaal waar vrije of beperkte diffusie belangrijk is voor organisatie en functie. Breng om te beginnen 380 microliter van de DPhPC-stamoplossing over in een glazen injectieflacon en bedek de lipide-stamoplossing met argon of stikstofgas om lipide-oxidatie te voorkomen. Gebruik een zo laag mogelijke gasstroom om verdamping van het organische oplosmiddel waarin de lipiden zijn opgelost of spatten van de oplosmiddelsprays uit de injectieflacon te voorkomen.

Droog het lipidenmonster onder een stikstofstroom en verwijder het resterende organische oplosmiddel onder vacuüm uit het lipidenmonster met behulp van een olievrije vacuümpomp gedurende een nacht. Los de lipidefilm op in een hexadecaan siliconenolie-oplossing door gelijke volumes hexadecaan en siliconenolie toe te voegen met behulp van een pipet van één milliliter tot een uiteindelijke lipideconcentratie van 9,5 milligram per milliliter. Plaats enkele glazen coverslips in een roestvrijstalen coversliphouder en reinig ze in een glazen beker gedurende ongeveer 10 minuten met aceton in een ultrasone reiniger.

Spoel de afdekstroken af met dubbel gedeïoniseerd water en droog ze onder een stroom stikstof. Reinig en hydrofyliseer verder een dekplaat in een plasmareiniger met zuurstof gedurende vijf minuten. Monteer een met plasma behandelde coverslip op een spincoater en bekleed de coverslip met een sub-micrometer dikke film van agarose door langzaam 140 microliter verwarmde 0,75% laagsmeltende agarose toe te voegen met een pipet van 200 microliter bij 3.000 RPM gedurende 30 seconden.

Bevestig de met spincoating bedekte coverslip met de dunne laag van de agarose hydrogel onmiddellijk aan de onderkant van de PMMA-kamer. Zorg ervoor dat de agarose hydrogel naar boven wijst. Bevestig de randen van de coverslip met transparant plakband aan het PMMA micro-machinaal apparaat en plaats het apparaat op een hete plaat die is verwarmd tot 35 graden Celsius.

Giet voorzichtig 200 microliter 2,5% agarose-oplossing in de inlaat van de kamer zonder luchtbellen te creëren. Bedek onmiddellijk de putten van de PMMA-kamer met ongeveer 60 microliter van de lipideolie-oplossing om de vorming van lipidemonolaag op het agarose-olie-grensvlak te initiëren om uitdroging van de met spin gecoate agarose in de putten van de PMMA-kamer te voorkomen. Plaats het apparaat ongeveer twee uur op een hete plaat bij 35 graden Celsius.

Plaats ongeveer 20 microliter lipide hexadecane siliconenolie-oplossing in elk van de verschillende micro-gefabriceerde putten in een druppelincubatiekamer. Bereid een microcapillaire glazen naald met een tipopeningsdiameter van ongeveer 20 micrometer met behulp van een verticale of horizontale micropipettrekker. Vul de naald met ongeveer vijf microliter waterige injectieoplossing met 8,8 millimolaire HEPES, zeven micromolaire van een fluorescerende kleurstof, Fluo-8, 400 micromolaire EDTA, 1,32 molaire kaliumchloride en 30 nanomolaire TOM-kerncomplex of als alternatief 20 nanomolaire OMPF.

Monteer de naald met de waterige injectieoplossing op een piëzo-aangedreven nano-injector en injecteer 100 tot 200 nanoliter waterige druppels in de putjes in de druppelincubatiekamer gevuld met lipide hexadecane siliconenolie-oplossing met behulp van de nanoinjector. Laat de vorming van een lipide monolaag op het druppelolie-interface gedurende ongeveer twee uur door de PMMA- en druppelincubatiekamers op een hete plaat te houden die wordt verwarmd tot 35 graden Celsius. Breng handmatig individuele waterige druppels over van de putten van de druppelincubatiekamer in de putten van de PMMA-kamer met behulp van een eenkanaals microliterpipet met een polypropyleen wegwerptip van 10 microliter.

Laat de druppels op de lipide monolagen op de hydrogel-olie interfaces zakken om een lipide bilayer te vormen tussen de druppels en de agarose hydrogel. Monteer de PMMA-kamer met de druppelinterface dubbellaagse of DIB-membranen op de monsterhouder van een omgekeerd lichtmicroscoop en beoordeel de membraanvorming met behulp van een 10x Hoffman-modulatiecontrastobjectief. Als DIB-membranen zijn gevormd, monteer dan de PMMA-kamer op de monsterhouder van een TIRF-microscoop uitgerust met een conventionele lichtbron voor epifluorescentieverlichting, een 488 nanometer laser en een terugverlichte elektronenvermenigvuldigende CCD-camera om een pixelgrootte van ongeveer 0,16 micrometer te bereiken.

Focus de rand van een DIB-membraan met een 10x vergrotingsobjectief onder epifluorescentieverlichting met een lichtbron met hoge intensiteit met behulp van een GFP-filterset. Fijnfocus op dezelfde rand van het DIB-membraan bij hoge vergroting met een 100x NA 1.49 apochromatische olie TIRF-objectief, opnieuw onder epifluorescentieverlichting met een lichtbron met hoge intensiteit met behulp van een GFP-filterset. Wijzig de filterinstelling van GFP naar de quad-band TIRF-filterset, schakel de 488 nanometer laser in en stel de intensiteit van de laser in op de objectieflens.

Om afzonderlijke ionkanalen te visualiseren, past u de TIRF-hoek en EM CCD-cameraversterking aan, zodat de open ionkanalen in het DIB-membraan verschijnen als fluorescerende vlekken met hoog contrast op een donkere achtergrond en de signaal-achtergrondverhouding een maximum bereikt. Zorg ervoor dat de vlekken die overeenkomen met de calciumionenflux door enkele ionkanalen scherp blijven en een ronde vorm hebben met een hoge intensiteit in het midden en geleidelijk afnemend naar de periferie. Controleer of de fluorescerende vlekken scherp zijn om ervoor te zorgen dat de ionkanalen zich in de DIB-membranen hebben gereconstitueerd en zijdelings in het membraanvlak bewegen.

Neem ten slotte een reeks membraanbeelden op waarmee de positie en bewaking van de open gesloten toestand van de afzonderlijke ionkanalen goed kunnen worden gevolgd. Om het type laterale mobiliteit en de toestand van kanaalactiviteit te bepalen, moet u voldoende lange en goed bemonsterde trajecten verwerven. Cryo EM structuur van Neurospora crassa TOM-CC wordt hier getoond.

Mitochondriën van een N.crassa-vlek met een TOM 22 met een 6-His-tag werden opgelost in DDM en onderworpen aan nikkel-NTA-affiniteitschromatografie en anionenuitwisselingschromatografie. SDS-PAGE van geïsoleerde TOM-CC kristalstructuur en SDS-PAGE van gezuiverde E.coli OMPF gebruikt voor vergelijking worden hier getoond. Het fluorescerende amplitudespoor in het overeenkomstige traject van TOM-CC geeft aan dat de open-gesloten kanaalactiviteit van TOM-CC correleert met de laterale membraanmobiliteit van het complex.

Het amplitudespoor geeft drie permeabiliteitstoestanden weer: volledig open toestand die overeenkomt met bewegende kanalen, tussenliggende permeabiliteitstoestand en gesloten kanaaltoestand die overeenkomt met niet-bewegende kanalen. TOM-CC in de tussenliggende toestand wiebelt rond zijn gemiddelde positie met ongeveer plus / min 60 nanometer. Het fluorescerende amplitudespoor in het overeenkomstige traject van OMPF wordt hier weergegeven.

OMPF onthult slechts één intensiteitsniveau in vergelijking met TOM-CC, ongeacht of het in beweging is of vastzit. De trajectsegmenten die overeenkomen met de tijdsperioden van gevangen moleculen zijn grijs gemarkeerd. Een belangrijk ding om op te merken is dat deze methode enkelvoudige membraaneiwitten analyseert in een intacte membraanomgeving.

De dynamiek van membraaneiwitten zal in de nabije toekomst een horizon blijven voor wetenschappelijke studies. We verwachten dat onze methode een belangrijke bijdrage levert aan dit veld.