Name: Real-time meting van het mitochondriale bio-energetische profiel van neutrofielen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Leer de mitochondriale ademhaling van muizen- en menselijke neutrofielen en HL60-cellen te meten met behulp van een metabole extracellulaire flux-analyzer. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van mitochondriale functie onder normale en ziekteomstandigheden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We erkennen Dr. Anthony T. Vella en Dr. Federica Aglianoin van de afdeling Immunologie van UConn Health voor hun training in het gebruik van de metabole extracellulaire fluxanalysator, en Dr. Lynn Puddington van de afdeling Immunologie van UConn Health voor haar ondersteuning van de instrumenten. We erkennen Dr. Geneva Hargis van UConn School of Medicine voor haar hulp bij het wetenschappelijk schrijven en redigeren van dit manuscript. Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health, National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (R35GM147713 and P20GM139763), een startup-fonds van UConn Health en een Career re-entry fellowship van de American Association of Immunologists.

De auteurs verklaren geen concurrerend financieel belang te hebben.

De standaardprocedure die de mitochondriale ademhaling van neutrofielen meet met behulp van de metabole extracellulaire fluxanalysator wordt beperkt door vele factoren, waaronder celaantal, celgroei en levensvatbaarheid. Elke concentratie van de verbinding varieert tussen het type en de bron van de cellen in deze test. Oligomycine en rotenon/antimycine A worden meestal gebruikt in een vergelijkbare concentratie bij de meeste celtypen. Omdat de door FCCP geïnduceerde maximale ademhalingsfrequentie echter varieert tussen v...

Mitochondriën spelen een belangrijke rol in celbio-energetica, die adenosinetrifosfaat (ATP) genereert door oxidatieve fosforylering (OXPHOS). Daarnaast strekt de rol van mitochondriën zich uit tot de generatie en ontgifting van reactieve zuurstofsoorten, cytoplasmatische en mitochondriale matrixcalciumregulatie, cellulaire synthese, katabolisme en het transport van metabolieten in de cel1. Mitochondriale ademhaling is essentieel in alle cellen, omdat hun disfunctie kan leiden tot metabole problemen 2, waaronder hart- en vaatziekten3 en een breed scala aan neurodegeneratieve ziekten, zoals leeftijdsgebonden maculaire degeneratie4, de ziekte van Parkinson en Alzheimer5 en de ziekte van Charcot-Marie-Tooth2 A (CMT2A)6.
Elektronenmicroscopische studies op neutrofielen onthulden dat er relatief weinig mitochondriën7 zijn en dat ze sterk afhankelijk zijn van glycolyse voor hun energieproductie, omdat mitochondriale ademhalingssnelheden erg laag zijn8. Mitochondriën zijn echter cruciaal voor neutrofiele functies, zoals chemotaxis9 en apoptose10,11,12. Een eerdere studie onthulde een complex mitochondriaal netwerk in menselijke neutrofielen met een hoog membraanpotentiaal. Het mitochondriale membraanpotentiaalverlies is een vroege indicator van neutrofiele apoptose10. Behandeling met mitochondriale uncoupler carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP) toonde significante remming in chemotaxis, samen met een verandering in mitochondriale morfologie 9,10.
Hoewel de primaire energiebron voor neutrofielen glycolyse is, leveren mitochondriën de ATP die neutrofiele activering initieert door de eerste fase van purinerge signalering te voeden, die Ca2 + -signalering verhoogt, mitochondriale ATP-productie versterkt en neutrofiele functionele responsen initieert13. Disfunctie van de mitochondriale ademhalingsketen resulteert in overmatige productie van toxische reactieve zuurstofsoorten (ROS) en leidt tot pathogene schade14,15,16. NETosis, het proces van het vormen van neutrofiele extracellulaire vallen (NET's), is een kritieke eigenschap van neutrofielen die hen helpt te vechten tegen pathogenen17 en bijdraagt aan vele pathologische aandoeningen, waaronder kanker, trombose en auto-immuunziekten18. Mitochondriaal afgeleide ROS dragen bij aan NETosis19, mitochondriaal DNA kan een onderdeel zijn van NETs18, en veranderde mitochondriale homeostase schaadt NETosis 20,21,22,23,24. Bovendien wordt tijdens normale differentiatie of rijping de metabole herprogrammering van neutrofielen omgekeerd door de glycolytische activiteit te beperken, en ze houden zich bezig met mitochondriale ademhaling en mobiliseren intracellulaire lipiden25,26.
De metabole extracellulaire fluxanalysator kan continu de mitochondriale ademhaling en glycolyse van levende cellen controleren en kwantificeren. De analyzer maakt gebruik van een 96-well plaatformaat sensorpatroon en twee fluoroforen om zuurstof (O2) concentratie en pH-veranderingen te kwantificeren. De sensorcartridge bevindt zich tijdens de test boven de celmonolaag en vormt een ~200 nm hoge microkamer. De optische vezelbundels in de analyzer worden gebruikt om de fluoroforen te prikkelen en de fluorescerende intensiteitsveranderingen te detecteren. Real-time veranderingen in O2-concentratie en pH worden automatisch berekend en weergegeven als zuurstofverbruikssnelheid (OCR) en extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR). Er zijn vier poorten op de sensorcartridge waarmee tijdens de testmetingen maximaal vier verbindingen in elke put kunnen worden geladen. Dit protocol richt zich op het kwantificeren van de mitochondriale ademhaling van muis- en menselijke neutrofielen, evenals de neutrofielachtige HL60-cellen, met behulp van de metabole extracellulaire fluxanalysator.

<table><tbody><tr><td>37 &deg;C non-CO2&nbsp;incubator</td><td>Precisie</td><td>Economy Model 2EG</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Biorender</td><td></td><td></td><td>Software-applicatie</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5810R</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Corning&nbsp;Cell-Tak Cel- en weefselkleefmiddel</td><td>Corning</td><td>102416-100</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>STEMCELL</td><td>18000</td><td>Magneet</td></tr><tr><td>EasySepMouse Neutrophil Verrijkingskit</td><td>STEMCELL</td><td>19762A</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Graphpad Prism 9</td><td></td><td></td><td>Software-applicatie</td></tr><tr><td>Human Serum Albumine Oplossing (25%)</td><td>GeminiBio</td><td>800-120</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Ketamine (VetaKet)</td><td>DAILYMED</td><td>NDC 59399-114-10</td><td>Anestheticum</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cytiva</td><td>SH30256.01</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Plate emmers</td><td>Eppendorf</td><td>UL155</td><td>Accessoire</td></tr><tr><td>PolymorphPrep</td><td>PROGEN</td><td>1895 (voorheen 1114683)</td><td>polysaccharide-oplossing</td></tr><tr><td>Gezuiverd muis anti-mens CD18 antilichaam</td><td>Biolegend</td><td>302102</td><td>Kloon TS1/18</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>11-875-093</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Seahorse metabole extracellulaire flux analyzer</td><td>Agilent</td><td>XFe96</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Seahorse XF Cel Mito Stress Test Kit</td><td>Agilent</td><td>103015-100</td><td>mitochondrial stress test Kit</td></tr><tr><td>Swing-bucket rotor</td><td>Eppendorf</td><td>A-4-62</td><td>Rotor</td></tr><tr><td>Vactrap 2 Vacum Trap</td><td>Fox Lifesciences</td><td>3052101-FLS</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Wave</td><td></td><td></td><td>Software-applicatie</td></tr><tr><td>XF 1.0 M Glucose Oplossing</td><td>Agilent</td><td>103577-100</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>XF 100 mM Pyruvaat Oplossing</td><td>Agilent</td><td>103578-100</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>XF 200 mM Glutamine Oplossing</td><td>Agilent</td><td>103579-100</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>XF DMEM medium</td><td>Agilent</td><td>103575-100</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>XFe96 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102601-100</td><td>Materiaal</td></tr><tr><td>Xylazine (AnaSed Injectie)</td><td>DAILYMED</td><td>NDC 59399-110-20</td><td>Anestheticum</td></tr></tbody></table>

real-time meting van het mitochondriale bio-energetische profiel van neutrofielen

Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils

Neutrofielen zijn de eerste verdedigingslinie en de meest voorkomende leukocyten bij de mens. Deze effectorcellen voeren functies uit zoals fagocytose en oxidatieve burst en creëren neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) voor microbiële klaring. Nieuwe inzichten in de metabole activiteiten van neutrofielen dagen het vroege concept uit dat ze voornamelijk afhankelijk zijn van glycolyse. Nauwkeurige meting van metabole activiteiten kan verschillende metabole behoeften van neutrofielen ontvouwen, waaronder de tricarbonzuur (TCA) cyclus (ook bekend als de Krebs-cyclus), oxidatieve fosforylering (OXPHOS), pentosefosfaatroute (PPP) en vetzuuroxidatie (FAO) onder fysiologische omstandigheden en in ziektetoestanden. Dit artikel beschrijft een stapsgewijs protocol en vereisten om de zuurstofverbruikssnelheid (OCR) te meten als een indicator van mitochondriale ademhaling op van het beenmerg afgeleide neutrofielen van muizen, van menselijk bloed afgeleide neutrofielen en de neutrofielachtige HL60-cellijn, met behulp van metabole fluxanalyse op een metabole extracellulaire fluxanalysator. Deze methode kan worden gebruikt voor het kwantificeren van de mitochondriale functies van neutrofielen onder normale en ziekteomstandigheden.

Representatieve OCR-dynamiek wordt getoond met de mitochondriale ademhalingsveranderingen in reactie op oligomycine, FCCP en rotenon / antimycine Een mengsel van muisneutrofielen (figuur 3A), menselijke neutrofielen (figuur 3B) en ongedifferentieerde en gedifferentieerde HL60-cellen (figuur 3C). In alle cellen verlaagt oligomycinebehandeling de OCR-waarde door het protonkanaal van ATP-synthase te remmen; FCCP-behandeling herstelt de...

We beschrijven stapsgewijze protocollen die de mitochondriale ademhaling van muis en menselijke neutrofielen en HL60-cellen meten met behulp van de metabole extracellulaire fluxanalysator.

Real-time meting van het mitochondriale bio-energetische profiel van neutrofielen

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and ...

Dit protocol richt zich op het kwantificeren van mitochondriale ademhaling van muis en menselijke neutrofielen, evenals neutrofielachtige HL60-cellen met behulp van de metabole extracellulaire fluxanalysator. Deze methode stelt ons in staat om de mitochondriale functie in neutrofielen onder normale en ziekteomstandigheden te kwantificeren. Dit is een eenvoudige techniek die inzicht kan geven in de mitochondriale functie van de cellen als reactie op medicijnen of een ziekteaandoening.Omdat verschillende cellen verschillende mitochondriale ademhalingsefficiëntie hebben, moet de optimalisatie van de celzaaidichtheid en de reagensconcentratie nauwkeurig worden uitgevoerd om resultaten van hoge kwaliteit te krijgen. Om de metabole extracellulaire fluxtest te starten, neemt u een sensorpatroon verpakt over een speciaal ontworpen 96-putplaat en brengt u 200 microliter kalibratiemedium over in elk putje van de onderliggende plaat. Til de patroon en de plaat voorzichtig op met calibrant en plaats deze 's nachts in een niet-kooldioxide bevochtigde 37 graden Celsius incubator voor hydratatie.Vervolgens bekleedt u op basis van het celtype de 96-well-plaat met een specifieke coating om de celhechting te garanderen. Was daarna de borden twee keer met 200 microliter steriele PBS. Bereid het testmedium in DMEM met één millimolair pyruvaat, 10 millimolar glucose en twee millimolaire glutamine.Verkrijg de muis- en menselijke neutrofielencellen zoals beschreven in het tekstmanuscript. Voor de neutrofielen verkregen uit de muis, past u de celdichtheid aan tot 1,1 maal 10 tot de zesde cellen per milliliter door testmedium toe te voegen. Zaai vervolgens 180 microliter van de neutrofiele suspensie van de muis per put in de voorbereide 96-putplaat.Pas op dezelfde manier de menselijke neutrofiele celdichtheid aan tot 2,2 keer 10 tot de zesde cellen per milliliter met behulp van het testmedium. Tel op de dag van de test de neutrofielachtige HL60-cellen handmatig met behulp van de hemocytometer. Centrifugeer vervolgens de gedifferentieerde of ongedifferentieerde HL60-cellen bij 300 G bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten.Was de cellen eenmaal met DMEM en suspensie ze opnieuw in het testmedium om een celdichtheid van 1,39 maal 10 tot de zesde cel per milliliter te bereiken. Zaai vervolgens 180 microliter gedifferentieerde of ongedifferentieerde HL60-cellen in de vooraf voorbereide 96-putplaat met de muizen- en menselijke neutrofielenmonsters. Voeg ten slotte volledig medium toe aan de hoekputten van de celkweekplaat zonder cellen voor achtergrondcorrectie tijdens het zaaien.Centrifugeer de plaat op 300 G bij kamertemperatuur gedurende drie minuten zonder onderbreking om een goede hechting van de cellen aan de onderkant van de plaat te garanderen. Incubeer ten slotte de plaat gedurende een uur om de cellen vooraf in evenwicht te brengen met het testmedium. Open de mitochondriale stresstestkit en bereid de reagentia voor volgens de instructies van de fabrikant.Laad vervolgens de patroon met reagentia, te beginnen met het bereide oligomycine in poort A, FCCP in poort B en rotenon / antimycine A-mengsel in poort C voor injecties. Vul de ongebruikte poorten met 20 microliter testmedium. Breng het testsysteem ten minste vijf uur voor de test in evenwicht bij 37 graden Celsius door de Wave-software te openen en op het tabblad Heater On te klikken.Na het bereiken van de temperatuur toont de linkerbenedenhoek van de Wave-software gereed. Open een sjabloon voor de mitochondriale stresstestkit in de software. Selecteer injectiestrategieën aan de linkerkant, klik vervolgens op Toevoegen en geef de injectieconditie een naam als menselijke neutrofielen of muisneutrofielen of HL60.Selecteer poort A tot D door op elk te klikken en klik op Verbinding toevoegen en voer oligomycine of FCCP of rotenon / antimycine A in met de respectieve concentraties. Selecteer Voorbehandeling aan de linkerkant, klik vervolgens op Toevoegen en geef ze cd18 en cell tak afzonderlijk een naam. Selecteer het celtype aan de linkerkant.Klik vervolgens op Toevoegen en noem ze menselijke neutrofielen, muisneutrofielen en HL60 of DHL60 met een voedingsdichtheid indien van toepassing. Definieer de groepen door op Groep toevoegen te klikken. Klik vervolgens op de onderstreepte definitie.Klik op Plaatkaart in het bovenste menu om alle groepen met definities aan de linkerkant en de plaatkaart aan de rechterkant te observeren. Sleep en zet neer om elk putje aan de groep toe te voegen met behoud van de vier hoekputten als achtergrond. Als u het protocol wilt instellen, selecteert u het tabblad Protocol in het bovenste menu en definieert u drie cycli van baseline, oligomycine, FCCP, rotenon en antimycine A-mengsel, door de tijd in te stellen om te mengen als drie minuten, rust als nul minuten en meting als zeven minuten.Ga naar de pagina Test uitvoeren, geef de informatie over het projectoverzicht op ter referentie en klik op Uitvoeren starten. Geef de locatie op om de bestanden op te slaan, zodat alle resultaten worden opgeslagen na voltooiing van de test. Klik vervolgens opnieuw op Start Run.Wacht na het automatisch laden van de test tot de lade is geopend om de sensorcartridge en -plaat met 200 microliter kalibrant te plaatsen. Stel de richting van de streepjescode van de cartridge naar rechts in. Voer de kalibratie uit door op Ik ben klaar te klikken, wat ongeveer 20 minuten duurt.Klik na de kalibratie op Open Tray, vervang de plaat door de celzaadplaat en klik op I'm Ready om door te gaan met de test. Na het voltooien van de test worden de gegevens automatisch opgeslagen. Exporteer de resultaten naar een spreadsheet of ander analysesoftwarebestand.Plot de grafiek en analyseer de gegevens. De representatieve dynamiek van zuurstofverbruikssnelheid of OCR duidde op veranderingen in de mitochondriale ademhaling bij muizen en menselijke neutrofielen, evenals ongedifferentieerde en gedifferentieerde HL60-cellen als reactie op oligomycine, FCCP en het mengsel van rotenon en antimycine A.De OCR-waarden daalden in alle cellen na behandeling met oligomycine als gevolg van de remming van het protonkanaal van ATP-synthase. FCCP-behandeling verhoogde de stroom van elektronen en zuurstofverbruik om de OCR-waarde te herstellen en maximale ademhaling te bereiken.Een mengsel van rotenon en antimycine A blokkeerde complexen 1 en 3 van de elektronentransportketen, wat leidt tot de eliminatie van mitochondriale ademhaling. Verminderde mitochondriale ademhaling werd waargenomen in HL60-cellen na neutrofielgerichte differentiatie. Gedifferentieerde HL60-cellen bleken significant lagere basale mitochondriale ademhaling, protonlekgekoppelde ademhaling, ATP-gekoppelde ademhaling en niet-mitochondriale ademhaling te hebben.De toename van de maximale ademhaling van gedifferentieerde HL60-cellen was niet substantieel, terwijl de reserve ademhalingscapaciteit aanzienlijk was toegenomen. Zorg ervoor dat de cellen zich aan de onderkant van de plaat bevinden, omdat de sensorcartridge geen obstakels mag hebben vanwege de zwevende cellen tijdens het lezen van de OCR-waarde. Deze techniek zou onderzoekers helpen om het effect van geneesmiddelen of mitochondriale disfunctie in neutrofiel-geassocieerde studies te bestuderen.

real-time-measurement-mitochondrial-bioenergetic-profile

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een beschrijving van een methode voor het profileren van mitochondriale functie in cellen wordt verzorgd. De gegenereerde mitochondriale profiel biedt vier parameters van mitochondriële functie die kan worden gemeten in een experiment: basale ademhaling, ATP-linked ademhaling, proton lek, en reservecapaciteit.

Bio-energetische Profiel Experiment met behulp van C2C12 myoblast Cellen

This video demonstrates the method to analyze energy metabolism in activated human NK cells using an extracellular flux analyzer. Different inhibitors of the electron transport chain complexes impact ATP synthesis, which is measured through the oxygen consumption rate or OCR, providing insights into cellular metabolism and bioenergetics.

Real-Time Monitoring of Energy Metabolism in Human NK Cells Using an Extracellular Flux Analyzer

Bloed leukocyten en bloedplaatjes kunnen worden gebruikt als een marker van algemene bio-energetische gezondheid van een individu en dus de potentie om pathologische processen en het effect van behandeling te controleren. Hier beschrijven we een werkwijze voor het isoleren en meten mitochondriale functie en de oxidatieve uitbarsting in deze cellen.

Bio-energetica en de oxidatieve Burst: Protocollen voor de Isolatie en evaluatie van menselijke leukocyten en bloedplaatjes

Ons doel was het ontwikkelen van een praktische protocol om te evalueren van de mitochondriale dysfunctie vermoeidheid bij kankerpatiënten is gekoppeld. Dit innovatieve protocol is geoptimaliseerd voor klinisch gebruik waarbij alleen standaard phlebotomy en basic Labor procedures.

Evaluatie van de rol van mitochondriale functie in moeheid in verband met kanker

Escherichia coli is de belangrijkste oorzaak van neonatale gramnegatieve bacteriële meningitis. Tijdens de bacteriële infectie spelen reactieve zuurstofsoorten geproduceerd door neutrofielen een belangrijke bacteriedodende rol. Hier introduceren we een methode om de reactieve zuurstofsoorten bij neutrofielen te detecteren als reactie op meningitis E. coli.

Real-time kwantificering van reactieve zuurstofsoorten bij neutrofielen besmet met meningitische Escherichia Coli

Metabole aanpassing is fundamenteel voor T-cellen omdat het differentiatie, persistentie en cytotoxiciteit dicteert. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd voor het monitoren van mitochondriale ademhaling in ex vivo cytokine-gedifferentieerde menselijke primaire T-cellen.

Real-time monitoring van mitochondriale ademhaling in cytokine-gedifferentieerde menselijke primaire T-cellen

Real-time cel metabole flux assay meet het zuurstofverbruik en de extracellulaire verzuringssnelheid, die overeenkomt met mitochondriale en glycolytische adenosinetrifosfaatproductie, met behulp van pH- en zuurstofsensoren. Het manuscript legt een methode uit om de energiestatus van osteoblasten en de karakterisering en interpretatie van de cellulaire bio-energetische status te begrijpen.

Real-time cell metabolic flux analyzer gebruiken om osteoblast bio-energetica te monitoren

Het mitochondriale netwerk is uiterst complex, waardoor het zeer uitdagend is om te analyseren. Een nieuwe MATLAB-tool analyseert live confocale mitochondriën in timelapse-beelden, maar resulteert in een groot uitvoervolume dat individuele handmatige aandacht vereist. Om dit probleem aan te pakken, werd een routinematige optimalisatie ontwikkeld, waardoor een snelle bestandsanalyse mogelijk is.

Geoptimaliseerde geautomatiseerde analyse van homeostasemodulatie van levende neuronale mitochondriën door isovormspecifieke retinoïnezuurreceptoren

We presenteren een geautomatiseerde high-throughput methode om neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) te kwantificeren met behulp van het live cell analysesysteem, gekoppeld aan een membraanpermeabiliteit-afhankelijke dual-dye benadering.

Real-time High Throughput-techniek om de vorming van extracellulaire neutrofielen in menselijke neutrofielen te kwantificeren

Methoden voor het bestuderen van mitochondriale bio-energetica onder fysiologisch relevante substraatconcentraties in immuuncellen zijn beperkt. We bieden een gedetailleerd protocol dat gebruik maakt van fluorespirometrie met hoge resolutie om veranderingen in de reactie van het mitochondriale membraanpotentieel op de energievraag in menselijke T-cellen, monocyten en perifere mononucleaire cellen te beoordelen.

Fluorespirometrie met hoge resolutie om dynamische veranderingen in het mitochondriale membraanpotentiaal in menselijke immuuncellen te beoordelen

Leer de mitochondriale ademhaling van muizen- en menselijke neutrofielen en HL60-cellen te meten met behulp van een metabole extracellulaire flux-analyzer. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van mitochondriale functie onder normale en ziekteomstandigheden.

Real-time meting van het mitochondriale bio-energetische profiel van neutrofielen

Meer video's verkennen