Real-time meting van het mitochondriale bio-energetische profiel van neutrofielen

Dit protocol richt zich op het kwantificeren van mitochondriale ademhaling van muis en menselijke neutrofielen, evenals neutrofielachtige HL60-cellen met behulp van de metabole extracellulaire fluxanalysator. Deze methode stelt ons in staat om de mitochondriale functie in neutrofielen onder normale en ziekteomstandigheden te kwantificeren. Dit is een eenvoudige techniek die inzicht kan geven in de mitochondriale functie van de cellen als reactie op medicijnen of een ziekteaandoening.

Omdat verschillende cellen verschillende mitochondriale ademhalingsefficiëntie hebben, moet de optimalisatie van de celzaaidichtheid en de reagensconcentratie nauwkeurig worden uitgevoerd om resultaten van hoge kwaliteit te krijgen. Om de metabole extracellulaire fluxtest te starten, neemt u een sensorpatroon verpakt over een speciaal ontworpen 96-putplaat en brengt u 200 microliter kalibratiemedium over in elk putje van de onderliggende plaat. Til de patroon en de plaat voorzichtig op met calibrant en plaats deze 's nachts in een niet-kooldioxide bevochtigde 37 graden Celsius incubator voor hydratatie.

Vervolgens bekleedt u op basis van het celtype de 96-well-plaat met een specifieke coating om de celhechting te garanderen. Was daarna de borden twee keer met 200 microliter steriele PBS. Bereid het testmedium in DMEM met één millimolair pyruvaat, 10 millimolar glucose en twee millimolaire glutamine.

Verkrijg de muis- en menselijke neutrofielencellen zoals beschreven in het tekstmanuscript. Voor de neutrofielen verkregen uit de muis, past u de celdichtheid aan tot 1,1 maal 10 tot de zesde cellen per milliliter door testmedium toe te voegen. Zaai vervolgens 180 microliter van de neutrofiele suspensie van de muis per put in de voorbereide 96-putplaat.

Pas op dezelfde manier de menselijke neutrofiele celdichtheid aan tot 2,2 keer 10 tot de zesde cellen per milliliter met behulp van het testmedium. Tel op de dag van de test de neutrofielachtige HL60-cellen handmatig met behulp van de hemocytometer. Centrifugeer vervolgens de gedifferentieerde of ongedifferentieerde HL60-cellen bij 300 G bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten.

Was de cellen eenmaal met DMEM en suspensie ze opnieuw in het testmedium om een celdichtheid van 1,39 maal 10 tot de zesde cel per milliliter te bereiken. Zaai vervolgens 180 microliter gedifferentieerde of ongedifferentieerde HL60-cellen in de vooraf voorbereide 96-putplaat met de muizen- en menselijke neutrofielenmonsters. Voeg ten slotte volledig medium toe aan de hoekputten van de celkweekplaat zonder cellen voor achtergrondcorrectie tijdens het zaaien.

Centrifugeer de plaat op 300 G bij kamertemperatuur gedurende drie minuten zonder onderbreking om een goede hechting van de cellen aan de onderkant van de plaat te garanderen. Incubeer ten slotte de plaat gedurende een uur om de cellen vooraf in evenwicht te brengen met het testmedium. Open de mitochondriale stresstestkit en bereid de reagentia voor volgens de instructies van de fabrikant.

Laad vervolgens de patroon met reagentia, te beginnen met het bereide oligomycine in poort A, FCCP in poort B en rotenon / antimycine A-mengsel in poort C voor injecties. Vul de ongebruikte poorten met 20 microliter testmedium. Breng het testsysteem ten minste vijf uur voor de test in evenwicht bij 37 graden Celsius door de Wave-software te openen en op het tabblad Heater On te klikken.

Na het bereiken van de temperatuur toont de linkerbenedenhoek van de Wave-software gereed. Open een sjabloon voor de mitochondriale stresstestkit in de software. Selecteer injectiestrategieën aan de linkerkant, klik vervolgens op Toevoegen en geef de injectieconditie een naam als menselijke neutrofielen of muisneutrofielen of HL60.

Selecteer poort A tot D door op elk te klikken en klik op Verbinding toevoegen en voer oligomycine of FCCP of rotenon / antimycine A in met de respectieve concentraties. Selecteer Voorbehandeling aan de linkerkant, klik vervolgens op Toevoegen en geef ze cd18 en cell tak afzonderlijk een naam. Selecteer het celtype aan de linkerkant.

Klik vervolgens op Toevoegen en noem ze menselijke neutrofielen, muisneutrofielen en HL60 of DHL60 met een voedingsdichtheid indien van toepassing. Definieer de groepen door op Groep toevoegen te klikken. Klik vervolgens op de onderstreepte definitie.

Klik op Plaatkaart in het bovenste menu om alle groepen met definities aan de linkerkant en de plaatkaart aan de rechterkant te observeren. Sleep en zet neer om elk putje aan de groep toe te voegen met behoud van de vier hoekputten als achtergrond. Als u het protocol wilt instellen, selecteert u het tabblad Protocol in het bovenste menu en definieert u drie cycli van baseline, oligomycine, FCCP, rotenon en antimycine A-mengsel, door de tijd in te stellen om te mengen als drie minuten, rust als nul minuten en meting als zeven minuten.

Ga naar de pagina Test uitvoeren, geef de informatie over het projectoverzicht op ter referentie en klik op Uitvoeren starten. Geef de locatie op om de bestanden op te slaan, zodat alle resultaten worden opgeslagen na voltooiing van de test. Klik vervolgens opnieuw op Start Run.

Wacht na het automatisch laden van de test tot de lade is geopend om de sensorcartridge en -plaat met 200 microliter kalibrant te plaatsen. Stel de richting van de streepjescode van de cartridge naar rechts in. Voer de kalibratie uit door op Ik ben klaar te klikken, wat ongeveer 20 minuten duurt.

Klik na de kalibratie op Open Tray, vervang de plaat door de celzaadplaat en klik op I'm Ready om door te gaan met de test. Na het voltooien van de test worden de gegevens automatisch opgeslagen. Exporteer de resultaten naar een spreadsheet of ander analysesoftwarebestand.

Plot de grafiek en analyseer de gegevens. De representatieve dynamiek van zuurstofverbruikssnelheid of OCR duidde op veranderingen in de mitochondriale ademhaling bij muizen en menselijke neutrofielen, evenals ongedifferentieerde en gedifferentieerde HL60-cellen als reactie op oligomycine, FCCP en het mengsel van rotenon en antimycine A.De OCR-waarden daalden in alle cellen na behandeling met oligomycine als gevolg van de remming van het protonkanaal van ATP-synthase. FCCP-behandeling verhoogde de stroom van elektronen en zuurstofverbruik om de OCR-waarde te herstellen en maximale ademhaling te bereiken.

Een mengsel van rotenon en antimycine A blokkeerde complexen 1 en 3 van de elektronentransportketen, wat leidt tot de eliminatie van mitochondriale ademhaling. Verminderde mitochondriale ademhaling werd waargenomen in HL60-cellen na neutrofielgerichte differentiatie. Gedifferentieerde HL60-cellen bleken significant lagere basale mitochondriale ademhaling, protonlekgekoppelde ademhaling, ATP-gekoppelde ademhaling en niet-mitochondriale ademhaling te hebben.

De toename van de maximale ademhaling van gedifferentieerde HL60-cellen was niet substantieel, terwijl de reserve ademhalingscapaciteit aanzienlijk was toegenomen. Zorg ervoor dat de cellen zich aan de onderkant van de plaat bevinden, omdat de sensorcartridge geen obstakels mag hebben vanwege de zwevende cellen tijdens het lezen van de OCR-waarde. Deze techniek zou onderzoekers helpen om het effect van geneesmiddelen of mitochondriale disfunctie in neutrofiel-geassocieerde studies te bestuderen.