Name: Efficiënte PAM-loze basisbewerking voor zebravismodellering van menselijke genetische ziekten met zSpRY-ABE8e (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T13:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Ontdek PAM-loze basisbewerking met zSpRY-ABE8e voor het modelleren van menselijke genetische ziekten in zebravis. Deze methode maakt efficiënte adenine-conversie mogelijk voor nauwkeurige ziekteanalyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Barbara Garbers, PhD, van Liwen Bianji (Edanz) voor het bewerken van de Engelse tekst van een concept van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door het Key-Area Research and Development Program van de provincie Guangdong (2019B030335001), het National Key R&D Program of China (2019YFE0106700), de National Natural Science Foundation of China (32070819, 31970782) en het Research Fund Program of Guangdong Provincial Key Lab of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals (PBEA2020YB05).

Deze studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de richtlijnen van de Care and Use Committee van de South China Normal University.
1. Synthetisch gemodificeerd gRNA en zSpRY-ABE8e mRNA bereiden
<ol><li>Ontwerp het gRNA volgens eerdere publicaties37,38.<ol><li>Selecteer bij voorkeur NRN als de PAM-reeks, omdat zSpRY-ABE8e een hogere voorkeur voor NRN PAM vertoont dan NYN PAM (waarbij R A of G is en Y C of T)18. Zorg ervoor dat het doel-adeninenucleotide zich in het zeer actieve bewerkingsvenster bevindt (derde tot negende nucleotide langs de protospacer).</li>
	</ol></li>
	<li>Bestel EasyEdit sgRNA (EE gRNA) gemodificeerd met 2′-O-methyl-3′-fosforothioaat (MS) aan beide uiteinden (figuur 1). OPMERKING: Het EE-gRNA moet worden opgelost in RNase-vrij water en worden opgeslagen bij −80 °C.</li>
	<li>Lineariseer het zSpRY-ABE8e plasmide18.<ol><li>Lineariseer 6 μg van het plasmide met het XbaI-enzym (Table of Materials) in een metalen bad bij 37 °C gedurende 3 uur.</li>
		<li>Zuiver het gelineariseerde plasmide met behulp van de DNA-zuiveringskit (zie materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	</ol></li>
	<li>Transcribeer het mRNA met behulp van de in vitro transcriptiekit (Table of Materials).<ol><li>Transcribeer het zSpRY-ABE8e mRNA met het gelineariseerde plasmide als sjabloon volgens de instructies van de fabrikant. OPMERKING: Alle operaties met mRNA en gRNA vereisen het gebruik van RNase-vrije laboratoriumbenodigdheden.</li>
	</ol></li>
	<li>Gebruik de RNA-zuiveringskit (Table of Materials) om het mRNA te zuiveren volgens de instructies van de fabrikant. OPMERKING: Voor het elueren moet de ethanol worden gedroogd om cytotoxiciteit te voorkomen en moet het mRNA worden opgeslagen bij −80 °C als het niet onmiddellijk wordt gebruikt.</li>
</ol>2. Voorbereiding van micro-injectie glazen haarvaten
<ol><li>Stel het micropipet-trekkersysteem in en verwarm gedurende ten minste 30 minuten voor.</li>
	<li>Voer een hellingtest uit om de warmtewaarde te bepalen die nodig is om de haarvaten van borosilicaatglas (met een buitendiameter van 1 mm en een binnendiameter van 0,58 mm) te smelten volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Selecteer een programma en klik op het nummer op het toetsenbord om de parameterwaarden in te voeren. Stel de volgende parameters in om aan de glazen haarvaten te trekken: warmte = hellingtestwaarde, trekkracht = 50, snelheid = 100, tijd = 50 en druk = 30.</li>
	<li>Installeer de capillaire buis en zorg ervoor dat deze in de groef zit. Druk op PULL START/STOP om het programma uit te voeren.</li>
	<li>Bewaar de getrokken haarvaten door ze in schuim te steken dat openingen bevat, waardoor de naald blijft hangen.</li>
</ol>3. Micro-injectie van het zSpRY-ABE8e mRNA- en EE-gRNA-mengsel in zebravisembryo's
<ol><li>Zet de nacht voor de injectie kweektanks op. Plaats een scheidingswand, plaats twee vrouwtjes en een mannelijke AB-stamzebravis (3-18 maanden oud) in elke tank en dek af met het deksel. Zie eerdere publicaties voor genderonderscheid39. OPMERKING: Om meer embryo's te verkrijgen, selecteert u vissen die minstens 1 week niet hebben gebroed.</li>
	<li>Ontdooi de volgende ochtend voor de injectie het zSpRY-ABE8e mRNA en EE gRNA op ijs. Meng het mRNA en gRNA tot eindconcentraties van respectievelijk 400 ng/μL en 200 ng/μL.<ol><li>Voer de hele procedure uit op ijs met behulp van RNase-vrije tips en buizen en hanteer met handschoenen.</li>
	</ol></li>
	<li>Configureer de pneumatische micro-injector. Sluit de partiële drukklep van de luchtpomp en open eerst de hoofdklep, schroef de gasfles los en stel de druk van het partiële drukventiel in op 0,2 MPa/29 psi.<ol><li>Schakel de pneumatische micro-injector in, stel de modus in op TIMER en pas de initiële parameterdrukwaarde aan op 20,0 psi en de TIMER-waarde op 0,040 s.</li>
	</ol></li>
	<li>Gebruik een fijne tang om de naalden van de getrokken glazen haarvaten voorzichtig onder een stereomicroscoop te breken en zorg ervoor dat de naalden onder een hoek worden gesneden om het doorboren van het chorion en het ei te vergemakkelijken. OPMERKING: Het breekpunt van de naald moet op de juiste plaats zijn en sterk genoeg zijn om het ei te doorboren, maar toch dun genoeg om schade aan het ei te minimaliseren.</li>
	<li>Voeg het mengsel van zSpRY-ABE8e mRNA en gRNA toe aan de punt van een glazen capillair met behulp van een microloaderpipetpunt, waardoor bellen in het capillair worden vermeden. Bevestig de naald aan de micromanipulator en configureer de druk en timerwaarde van de injector om ervoor te zorgen dat 2 nL mengsel per injectie wordt geproduceerd met behulp van een microcap.</li>
	<li>Koppel de verdelers van de kweekbakken los en laat de vis 10-15 minuten broeden. Verzamel de eieren met behulp van een zeef en onderzoek het celstadium en de kwaliteit van de eieren onder een stereomicroscoop. Selecteer de eieren in de eencellige toestand voor injectie om de bewerkingsefficiëntie te verbeteren.</li>
	<li>Bekleed de eieren op een 1,5% agarose-injectieplaat en injecteer 2 ml van het mengsel in de cel, niet de dooier, van de embryo's onder een microscoop om de bewerkingsefficiëntie te verbeteren. Houd ten minste 15 eieren als controlegroep.</li>
	<li>Gebruik 1x E3 buffer om de eieren in petrischalen te verzamelen en plaats ze in een broedmachine bij 28 °C. Verwijder de dode eieren en vervang de kweekbuffer elke 12 uur tot 48 uur na de bevruchting (hpf).</li>
</ol>4. Efficiëntieanalyse van basisbewerking met EditR
<ol><li>Bij 48 hpf verzamelt u drie pools van zes willekeurig geselecteerde geïnjecteerde embryo's en zes willekeurig geselecteerde controle-embryo's in respectievelijk PCR-buizen. Gebruik een pipet om de resterende E3-buffer op te zuigen.</li>
	<li>Voeg 40 μL 50 mM NaOH toe aan de PCR-buizen. Plaats de buizen gedurende 20 minuten in een metalen bad bij 95 °C en vervolgens gedurende 15 s vortex.</li>
	<li>Voeg 4 μL van 1 M Tris toe. HCl (pH 8,0) in elke buis om de NaOH te neutraliseren. Centrifugeer kort op 2.000 x g gedurende 10 s bij kamertemperatuur om druppels van de buiswand te verwijderen. Verzamel het supernatant in nieuwe PCR-buizen en bewaar ze bij −20 °C.</li>
	<li>Ontwerp geschikte primers stroomopwaarts en stroomafwaarts van de gRNA-doellocaties. Gebruik 1 μL van het bovenstaande supernatant als sjabloon voor de PCR-reacties van 50 μL volume. De primers die in dit onderzoek voor de PCR zijn gebruikt, zijn opgenomen in aanvullende tabel 1.</li>
	<li>Voer een DNA-agarosegel-elektroforese uit om correcte en specifieke banden te garanderen, gevolgd door Sanger-sequencing zoals eerder beschreven40.</li>
	<li>Analyseer de Sanger-sequencinggegevens met het EditR-programma (1.0.10)41.<ol><li>Upload het sequencingbestand (ab1-indeling) naar het vak "Upload .ab1-bestand".</li>
		<li>Voer de 20 bp gRNA-sequentie in 5′-3′-oriëntatie in het vak "Enter gRNA sequence" in.</li>
		<li>Open het sequencingbestand (ab1-indeling) en bevestig de basisposities waar de 20 bp gRNA-sequentie begint en eindigt. Voer de overeenkomstige basispositie in de vakken "5′ start" en "3′end" in.</li>
		<li>Klik op Voorspelde bewerking om de basisbewerkingsefficiëntie te verkrijgen. Controleer de kwaliteit van de sequencinggegevens in de buurt van de gRNA-doelsequentie om wanordelijke pieken of indalen te voorkomen. OPMERKING: Over het algemeen kunnen de wanordelijke pieken effectief worden verwijderd door de PCR-gloeitemperatuur aan te passen.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Eichler, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Completing+the+map+of+human+genetic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Completing the map of human genetic variation.</a> Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).</li>
<li>Koukouli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+reverses+hypofrontality+in+animal+models+of+addiction+and+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia.</a> Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).</li>
<li>Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+an+emerging+model+for+studying+complex+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).</li>
<li>Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+CRISPR-Cas+nucleases%2C+base+editors%2C+transposases+and+prime+editors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li>
<li>Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+editing+of+a+target+base+in+genomic+DNA+without+double-stranded+DNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage.</a> Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).</li>
<li>Nishida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+nucleotide+editing+using+hybrid+prokaryotic+and+vertebrate+adaptive+immune+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems.</a> Science. 353 (6305), (2016).</li>
<li>Gaudelli, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+adenine+base+editors+with+increased+activity+and+therapeutic+application%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 892-900 (2020).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+base+editing+in+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided base editing in rabbit.</a> Nature Communications. 9, 2717(2018).</li>
<li>Levy, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosine+and+adenine+base+editing+of+the+brain%2C+liver%2C+retina%2C+heart+and+skeletal+muscle+of+mice+via+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (1), 97-110 (2020).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+mouse+models+of+human+diseases+via+ABE-+and+BE-mediated+base+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing.</a> Nature Communications. 9, 2338(2018).</li>
<li>Landrum, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClinVar%3A+Public+archive+of+interpretations+of+clinically+relevant+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ClinVar: Public archive of interpretations of clinically relevant variants.</a> Nucleic Acids Research. 44, 862-868 (2016).</li>
<li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+A%E2%80%A2T+to+G%E2%80%A2C+base+editing+in+the+zebrafish+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Precise A•T to G•C base editing in the zebrafish genome.</a> BMC Biology. 16 (1), 139(2018).</li>
<li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+targeted+single-nucleotide+editing+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In vivo targeted single-nucleotide editing in zebrafish.</a> Scientific Reports. 8, 11423(2018).</li>
<li>Carrington, B., Weinstein, R. N., Sood, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BE4max+and+AncBE4max+are+efficient+in+germline+conversion+of+C%3AG+to+T%3AA+base+pairs+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">BE4max and AncBE4max are efficient in germline conversion of C:G to T:A base pairs in zebrafish.</a> Cells. 9 (7), 1690(2020).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+base+editing+of+zebrafish+genome+using+a+modified+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Communications. 8, 118(2017).</li>
<li>Rosello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+base+editing+for+the+in+vivo+study+of+developmental+signaling+and+human+pathologies+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Precise base editing for the in vivo study of developmental signaling and human pathologies in zebrafish.</a> eLife. 10, 65552(2021).</li>
<li>Liang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpG+and+SpRY+variants+expand+the+CRISPR+toolbox+for+genome+editing+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">SpG and SpRY variants expand the CRISPR toolbox for genome editing in zebrafish.</a> Nature Communications. 13, 3421(2022).</li>
<li>Qin, W., Lu, X., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+base+editing+in+zebrafish+using+a+modified+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system.</a> Methods. 150, 19-23 (2018).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+CRISPR%2FCas9+genome+editing+capacity+in+zebrafish+using+SaCas9%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Expanding CRISPR/Cas9 genome editing capacity in zebrafish using SaCas9.</a> G3. 6 (8), 2517-2521 (2016).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+zebrafish+by+ScCas9+recognizing+NNG+PAM%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Genome editing in zebrafish by ScCas9 recognizing NNG PAM.</a> Cells. 10 (8), 2099(2021).</li>
<li>Kleinstiver, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+CRISPR-Cas9+nucleases+with+altered+PAM+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities.</a> Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).</li>
<li>Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+CRISPR+toolbox+in+zebrafish+for+studying+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Expanding the CRISPR toolbox in zebrafish for studying development and disease.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 13(2019).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Hu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolved+Cas9+variants+with+broad+PAM+compatibility+and+high+DNA+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity.</a> Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).</li>
<li>Nishimasu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+CRISPR-Cas9+nuclease+with+expanded+targeting+space%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space.</a> Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).</li>
<li>Endo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+plants+by+engineered+CRISPR-Cas9+recognizing+NG+PAM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Genome editing in plants by engineered CRISPR-Cas9 recognizing NG PAM.</a> Nature Plants. 5, 14-17 (2019).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+genome+editing+using+xCas9+with+expanded+PAM+compatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Plant genome editing using xCas9 with expanded PAM compatibility.</a> Journal of Genetics and Genomics. 46 (5), 277-280 (2019).</li>
<li>Ren, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAM-less+plant+genome+editing+using+a+CRISPR-SpRY+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">PAM-less plant genome editing using a CRISPR-SpRY toolbox.</a> Nature Plants. 7, 25-33 (2021).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpRY+greatly+expands+the+genome+editing+scope+in+rice+with+highly+flexible+PAM+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">SpRY greatly expands the genome editing scope in rice with highly flexible PAM recognition.</a> Genome Biology. 22 (1), 6(2021).</li>
<li>Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unconstrained+genome+targeting+with+near-PAMless+engineered+CRISPR-Cas9+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants.</a> Science. 368 (6488), 290-296 (2020).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+mediated+by+SpCas9+variants+with+broad+non-canonical+PAM+compatibility+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Genome editing mediated by SpCas9 variants with broad non-canonical PAM compatibility in plants.</a> Molecular Plant. 14 (2), 352-360 (2021).</li>
<li>Vicencio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+animals+with+minimal+PAM+CRISPR-Cas9+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Genome editing in animals with minimal PAM CRISPR-Cas9 enzymes.</a> Nature Communications. 13, 2601(2022).</li>
<li>Rosello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+by+efficient+genome+editing+using+a+near+PAM-less+base+editor+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Disease modeling by efficient genome editing using a near PAM-less base editor in vivo.</a> Nature Communications. 13, 3435(2022).</li>
<li>Cornean, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+in+vivo+functional+analysis+of+DNA+variants+with+base+editing+using+ACEofBASEs+target+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Precise in vivo functional analysis of DNA variants with base editing using ACEofBASEs target prediction.</a> eLife. 11, 72124(2022).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+silencing+by+adenine+base+editor-mediated+start+codon+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient gene silencing by adenine base editor-mediated start codon mutation.</a> Molecular Therapy. 28 (2), 431-440 (2020).</li>
<li>Hanna, R. E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+analysis+of+CRISPR-Cas+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Design and analysis of CRISPR-Cas experiments.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li>
<li>Kossack, M. E., Draper, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+sex+determination+and+maintenance+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio).</a> Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).</li>
<li>Crossley, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+Sanger+sequencing+and+molecular+assay+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Diagnostic+Investigation%22%5BJournal%5D)">Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).</li>
<li>Kluesner, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EditR%3A+A+method+to+quantify+base+editing+from+Sanger+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22The+CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">EditR: A method to quantify base editing from Sanger sequencing.</a> The CRISPR Journal. 1 (3), 239-250 (2018).</li>
<li>Gripp, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diamond-Blackfan+anemia+with+mandibulofacial+dystostosis+is+heterogeneous%2C+including+the+novel+DBA+genes+TSR2+and+RPS28%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics+Part+A%22%5BJournal%5D)">Diamond-Blackfan anemia with mandibulofacial dystostosis is heterogeneous, including the novel DBA genes TSR2 and RPS28.</a> American Journal of Medical Genetics Part A. 164 (9), 2240-2249 (2014).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
<li>Ramakrishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+disruption+by+cell-penetrating+peptide-mediated+delivery+of+Cas9+protein+and+guide+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA.</a> Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).</li>
<li>Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+in+human+cells+using+CRISPR%2FCas+nucleases+and+truncated+guide+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs.</a> Methods in Enzymology. 546, 21-45 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

Dit protocol beschrijft de constructie van een zebravisziektemodel met behulp van de basiseditor zSpRY-ABE8e. In vergelijking met de traditionele HDR-route voor basisvervanging, kan dit protocol efficiëntere basisbewerking bereiken en het optreden van indelaten verminderen. Tegelijkertijd omvat dit protocol de implementatie van de onlangs voorgestelde i-Silence gen-knock-out strategie in zebravissen. Alles bij elkaar zal zSpRY-ABE8e de toepassing van zebravismodellen in ziekteonderzoek verbeteren.
<p class="jove_cont...

Single-nucleotide varianten (SNV's) die missense of nonsense mutaties veroorzaken zijn de meest voorkomende bron van mutaties in het menselijk genoom1. Om te bepalen of een bepaalde SNV pathogeen is en om licht te werpen op de pathogenese ervan, zijn nauwkeurige diermodellen nodig2. Zebravissen zijn goede menselijke ziektemodellen, vertonen een hoge mate van fysiologische en genetische homologie met mensen, een korte ontwikkelingscyclus en een sterk voortplantingsvermogen, wat gunstig is voor onderzoek naar pathogene kenmerken en mechanismen, evenals geneesmiddelenscreening3.
Het clustered regular interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9-systeem is op grote schaal toegepast in de genoombewerking van verschillende soorten, waaronder zebravis4. Met gRNA-begeleiding kan het CRISPR/Cas9-systeem DNA-dubbelstrengsbreuken (DSB's) genereren op de doellocatie, die vervolgens single-base substitutie mogelijk maakt door recombinatie van de doellocatie met donor-DNA-sjablonen via de homologie-gerichte reparatie (HDR) -route. De efficiëntie van deze basevervangingsmethode is echter vrij laag omdat het cellulaire DNA-reparatieproces voornamelijk wordt uitgevoerd door de niet-homologe end-joining (NHEJ) -route, die meestal gepaard gaat met insertie- en deletiemutaties (indel)5. Gelukkig verlicht CRISPR / Cas9-gebaseerde single-base bewerkingstechnologie dit probleem aanzienlijk door basiseditors te gebruiken, die efficiëntere single-base editing mogelijk maken zonder DSB's te induceren. Twee belangrijke klassen van base editors, adenine base editors (ABE's) en cytosine base editors (CBE's), zijn ontwikkeld om base substitution editing voor A· T tot G· C en C·G t/m T· A, respectievelijk 6,7,8,9,10,11. Deze vier soorten basesubstituties dekken 30% van de humane pathogene varianten12. Van beide klassen van basiseditors, waaronder PmCDA1, BE-systeem, CBE4max, ABE7.10 en ABE8e, is gemeld dat ze werken in zebravissen, waarbij BE4max en ABE8e vooral zijn gemeld om een hoge bewerkingsactiviteit te bereiken 13,14,15,16,17,18,19.
Cas9-eiwitten van verschillende soorten, waaronder Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes en S. canis, zijn geïmplementeerd in zebravisgenbewerking, waarbij de Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) het meest wordt gebruikt20,21,22,23. SpCas9 kan echter alleen doellocaties herkennen met een NGG protospacer adjacent motif (PAM), wat het bewerkbare bereik beperkt en ertoe kan leiden dat er geen geschikte sequentie wordt gevonden in de buurt van de pathogene site van belang24. Om het doelbereik uit te breiden, zijn verschillende SpCas9-varianten ontworpen om verschillende PAM's te herkennen door middel van gerichte evolutie en structuurgestuurd ontwerp. Weinig varianten zijn echter effectief bij dieren, vooral bij zebravissen, wat de toepassing van zebravissen in SNV-gerelateerd ziekteonderzoek beperkt25,26,27,28. Onlangs zijn twee varianten van SpCas9, SpG en SpRY, met minder strenge PAM-beperkingen (NGN voor SpG en NNN voor SpRY met een hogere voorkeur voor NRN dan NYN) gemeld om een hoge bewerkingsactiviteit te vertonen in menselijke cellen en planten 29,30,31,32. Vervolgens is gemeld dat SpG en SpRY, evenals een aantal van hun gemedieerde basisredacteuren, zoals SpRY-gemedieerde CBE's en SpRY-gemedieerde ABE's, ook werken in zebravissen, wat de toepassing van zebravismodellen in de mechanistische studie en medicijnscreening van SNV-gerelateerde ziekten zal verbeteren 18,33,34,35. Bovendien werd i-Silence voorgesteld als een effectieve en nauwkeurige gen-knock-out strategie door ABE-gemedieerde start codon conversie van ATG naar GTG of ACG36. De combinatie van de i-Silence-strategie en de SpRY-gemedieerde basiseditor zSpRY-ABE8e biedt een nieuwe methode voor ziektemodellering18. Dit protocol laat zien hoe genbewerking met zSpRY-ABE8e in zebravissen kan worden uitgevoerd om een tsr2 (M1V) model te construeren met behulp van de i-Silence-strategie. De bewerkingsefficiëntie en fenotypen die voorkomen in zebravismodellen werden beoordeeld en geanalyseerd.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>1.5% Agarose gebruikt om een injectieplaat te maken</td></tr><tr><td>Borosilicaat glas capillaire&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 30-0016</td><td></td></tr><tr><td>Celcultuur schalen&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit</td><td>Vazyme</td><td>C115</td><td>Kit voor Infusion clone&nbsp;</td></tr><tr><td>Codon optimalisatie service</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drummond Microcaps</td><td>Drummond Microcaps</td><td>P1299-1PAK</td><td>Lengte: 32 mm, capaciteit: 0,5 µL</td></tr><tr><td>EasyEdit gRNA service</td><td>GenScript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fijne pincetten</td><td>Fine Scientific Instrument</td><td>11254-20</td><td>Gebruikt om naald te breken</td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette Puller&nbsp;</td><td>Stutter Instrument</td><td>P-97</td><td>Gebruikt om de glazen capillairen te trekken</td></tr><tr><td>HotStart Taq PCR StarMix</td><td>Genstar</td><td>A033-101</td><td>Gebruikt voor PCR-reactie</td></tr><tr><td>Intelligible kunstmatige klimaatbox</td><td>TENLIN</td><td>PRX-1000A</td><td>Gebruikt om zebravisembryo's te kweken</td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td>Gebruikt om zebravis te fixeren bij het fotograferen</td></tr><tr><td>Microloader pipettenpunten&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>mMACHINE kit&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2</td><td>Vazyme</td><td>C214-01</td><td>Kit voor plaatsgerichte mutagenese</td></tr><tr><td>Pneumatische microinjector</td><td>ZGene Biotech</td><td>ZGPCP-1500 PLUS</td><td></td></tr><tr><td>pT3TS-zSpCas9</td><td>Addgene</td><td>46757</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy FFPE kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>73504</td><td>Kit voor RNA-zuivering</td></tr><tr><td>Sanger Sequencing service</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide, korrelig</td><td>Sangon</td><td>A100173-0500</td><td>NaOH gebruikt voor genoomextractie</td></tr><tr><td>Stereo Microscoop</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>SZX10</td><td>Gebruikt voor foto van fenotype</td></tr><tr><td>SZ Series Zoom Stereo Microscoop</td><td>CNOPTEC</td><td>SZ650</td><td></td></tr><tr><td>T3 mMESSAGE</td><td>Ambion</td><td>AM1348</td><td>Kit voor in vitro transcriptie&nbsp;</td></tr><tr><td>TIANprep Mini Plasmid Kit</td><td>TIANGEN</td><td>DP103-03</td><td>Kit voor plasmide extractiekit</td></tr><tr><td>TIANquick Mini Zuiveringskit</td><td>TIANGEN</td><td>DP203-02</td><td>Kit voor zuivering voor gelineairiseerd plasmide</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>Gebruikt om zebravis te anesthetiseren</td></tr><tr><td>Tris (hydroxymethyl) aminomethaan</td><td>Sangon</td><td>A600194-0500</td><td>Onderdeel van Tris&middot;HCl gebruikt voor genoomextractie</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145S</td><td>Restrictieneuklease gebruikt voor plasmide linearisatie</td></tr></tbody></table>

efficiënte pam-loze basisbewerking voor zebravismodellering van menselijke genetische ziekten met zspry-abe8e

Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e

CRISPR / Cas9-technologie heeft de waarde van zebravissen verhoogd voor het modelleren van menselijke genetische ziekten, het bestuderen van ziektepathogenese en medicijnscreening, maar protospacer adjacent motif (PAM) -beperkingen zijn een belangrijk obstakel voor het creëren van nauwkeurige diermodellen van menselijke genetische aandoeningen veroorzaakt door single-nucleotidevarianten (SNV's). Tot nu toe hebben sommige SpCas9-varianten met brede PAM-compatibiliteit efficiëntie getoond in zebravissen. De toepassing van de geoptimaliseerde SpRY-gemedieerde adenine base editor (ABE), zSpRY-ABE8e en synthetisch gemodificeerd gRNA in zebravissen heeft een efficiënte adenine-guanine base conversie mogelijk gemaakt zonder PAM-beperking. Hier wordt een protocol beschreven voor efficiënte adeninebasisbewerking zonder PAM-beperking in zebravissen met behulp van zSpRY-ABE8e. Door een mengsel van zSpRY-ABE8e mRNA en synthetisch gemodificeerd gRNA in zebravisembryo's te injecteren, werd een zebravisziektemodel geconstrueerd met een precieze mutatie die een pathogene plaats van de TSR2-ribosoomrijpingsfactor (tsr2) simuleerde. Deze methode biedt een waardevol hulpmiddel voor het opzetten van nauwkeurige ziektemodellen voor het bestuderen van ziektemechanismen en behandelingen.

Van de mutatie van TSR2 is gemeld dat deze Diamond Blackfan-anemie (DBA)42 veroorzaakt. Hier werd een DBA zebravismodel geconstrueerd met een tsr2 (M1V) mutatie met behulp van de i-Silence strategie. De adenine van het startcodon van de zebravis tsr2 werd met zSpRY-ABE8e succesvol omgezet in guanine (figuur 3).
De EditR-analyse van de Sanger-sequencingresultaten toonde aan dat er een A/G-overlap was op de adenineb...

Dit protocol beschrijft hoe efficiënte adenine-basisbewerking zonder PAM-beperking kan worden uitgevoerd om een nauwkeurig zebravisziektemodel te construeren met behulp van zSpRY-ABE8e.

Efficiënte PAM-loze basisbewerking voor zebravismodellering van menselijke genetische ziekten met zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but ...

Dit protocol stelt onderzoekers in staat om een aantal voorheen niet-beschikbare zebravismodellen van ziekterelevante single-nucleotidevarianten te bouwen. PAM-beperkingen zijn een groot obstakel voor het maken van nauwkeurige diermodellen en zSpRY-ABE8e maakt efficiënte adenine naar guanine-basisconversie mogelijk met lage intermutatie en ontspannen PAN-beperking. Deze tool kan worden gebruikt om nauwkeurige zebravismodellen te construeren voor het bestuderen van de pathogene kenmerken ziektemechanismen gerelateerd aan single-nucleotide mariniers, evenals medicijnscreening voor deze ziekte.Stel om te beginnen het micropipette-trekkersysteem in en verwarm het minstens 30 minuten voor. Om aan de glazen haarvaten te trekken, selecteert u een programma, stelt u de ramptestwaarde in als warmte, 50 als trekkracht, de snelheid op 100, tijd als 50 en druk als 30. Installeer vervolgens de capillaire buis en zorg ervoor dat deze zich in de groef bevindt.Druk op pull start/stop"om het programma uit te voeren. Om de getrokken haarvaten te behouden, steekt u ze in schuim met openingen die de naald hangend houden. Gebruik voor experimenten zSpRY-ABE8e mRNA beschreven in het manuscript en bewerk eenvoudig sgRNA gemodificeerd met 2'O-methylfosforothioaat aan beide uiteinden.Selecteer voor het gRNA-ontwerp bij voorkeur NRN als PAM-sequentie, omdat zSpRY-ABE8e een hogere voorkeur voor NRN PAM vertoont dan NYN PAM. Voer het doel in adeninenucleotide bevindt zich in het zeer actieve bewerkingsvenster van het derde tot het negende nucleotide langs de protospacer. Zet de nacht voor de injectie kweektanks op.Plaats een scheidingswand en plaats twee vrouwelijke en een mannelijke zebravis in elke tank. Plaats een deksel over elke tank. De volgende ochtend meng je met behulp van RNase-vrije tips, buisjes en handschoenen het ontdooide mRNA en EEgRNA op ijs tot een eindconcentratie van respectievelijk 400 en 200 nanogram per microliter.Om de pneumatische micro-injector te configureren, sluit u eerst het partiële drukventiel van de luchtpomp. Open vervolgens de hoofdklep, schroef de gasfles los en stel de druk van de partiële drukklep in op 0,2 Megapascal. Schakel nu de micro-injector in en stel de modus in op timer.Stel de parameterdrukklep in op 20 pond per vierkante inch en de timerwaarde op 0,040 seconden. Breek met een fijne tang hoekig de naalden van de getrokken glazen haarvaten onder een stereomicroscoop. Voeg met behulp van een pipetpunt van een microloader het mRNA/gRNA-mengsel toe aan de punt van een glazen capillair en bevestig de naald aan de micromanipulator.Configureer de druk- en timerwaarde om twee nanolitermengsel per injectie te produceren met behulp van een microcap. Na het kweken van de vis gedurende 10 tot 15 minuten, verzamel je de eieren in een zeef. Onderzoek het celstadium en de eikwaliteit onder de stereomicroscoop.Selecteer eencellige eieren voor injectie om de bewerkingsefficiëntie te verbeteren. Lijn de eieren op een 1,5% agarose-injectieplaat en injecteer twee nanoliter van het RNA-mengsel in de cel van de embryo's met behulp van een microscoop. Verzamel de eieren in petrischaaltjes met E3 Buffer en broed ze uit bij 28 graden Celsius.Verwijder de dode eieren en vervang de kweekbuffer elke 12 uur gedurende 48 uur na de bevruchting. Verzamel na 48 uur na de bevruchting drie pools van zes willekeurig geselecteerde geïnjecteerde embryo's in een PCR-buis. Zodra zes willekeurig geselecteerde controle-embryo's zijn verzameld, gebruikt u een pipet om de resterende E3-buffer op te zuigen.Voeg 40 microliter 50 millimolair natriumhydroxide toe aan de embryo's. Plaats de buizen gedurende 20 minuten in een metalen bad op 95 graden Celsius en vervolgens gedurende 15 seconden vortex. Voeg vier microliter van één kies Tris-hydrochloride bij pH acht toe aan elke buis.Centrifugeer de buizen op 2000g gedurende 10 seconden bij kamertemperatuur. Breng het supernatant over in een nieuwe PCR-buis. Verwijder een microliter van het supernatant uit de PCR-buis en gebruik het voor Sanger-sequencing.Bewaar vervolgens het resterende supernatant bij 20 graden Celsius. Om de Sanger-sequencinggegevens te analyseren, begint u met het uploaden van het sequencingbestand naar het uploadvak ab1 File". Voer de 20-basenpaar gRNA-sequentie in de 5'tot 3'-oriëntatie in het vak gRNA"-sequentie invoeren.Voer de overeenkomstige basispositie in de vakken 5'start en 3'ends in. Verkrijg de basisbewerkingsefficiëntie door op voorspellende bewerking te klikken "en de kwaliteit van de sequencinggegevens te controleren. Een diamantzwarte anemie zebravismodel werd geconstrueerd door de adenine van het startcodon van Tsr2 om te zetten in guanine.De EditR-analyse van sequentiegegevens toonde een AG-overlap aan op de adeninebasis van het Tsr2-startcodon. Het fenotype van de twee dagen oude Tsr2-embryo's toonde kleinere ogen in vergelijking met de controle-embryo's. Een gezwollen pericardium werd ook waargenomen in de gemuteerde embryo's.Om een efficiënte basisbewerking te bereiken, dient u het eerder genoemde ontwerpprincipe van de richtlijn strikt te volgen, wat een voorwaarde is voor het succes van het experiment. Nauwkeurige modellen zijn essentieel voor de studie van single-nucleotide variant-gerelateerde ziekten. De ontwikkeling van de SprY-ABE8e biedt een effectief hulpmiddel voor nauwkeurige modellering, wat helpt om het onderzoek naar ziektemechanismen en behandelingen te bevorderen.

efficient-pam-less-base-editing-for-zebrafish-modeling-human-genetic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier presenteren we een systematische aanpak voor het ontwikkelen van fysiologisch relevante, gevoelige en...

In vivo modellering van de Morbid Human Genome behulp Danio rerio

De zebravis is een uitstekend modelsysteem voor genetische en ontwikkelingsstudies. Het implanteren van kralen is een waardevolle techniek voor weefselmanipulatie die kan worden gebruikt om ontwikkelingsmechanismen te onderzoeken door veranderingen in lokale cellulaire omgevingen te introduceren. Dit protocol beschrijft hoe microkralenimplantatie in de zebravis-embryo moet worden uitgevoerd.

Microkraal Implantatie in de zebravis embryo

Transgene manipulaties en genoom editing zijn van cruciaal belang voor het functioneel testen van de rol van genen en cis van regelgevende elementen. Hier kunt u een gedetailleerde micro-injectie protocol voor het genereren van genomische modificaties (inclusief Tol2-gemedieerde fluorescerende reporter transgene constructen, Talens en CRISPRs) wordt gepresenteerd voor de opkomende model vis, de driedoornige stekelbaars.

Micro-injectie voor Transgenese en Genome Bewerken in Threespine Stekelbaarzen

Mitose is cruciaal voor elk levend organisme en defecten leiden vaak tot kanker en ontwikkelingsstoornissen. Met behulp van dit beeldvormingsprotocol en zebravissen als modelsysteem, kunnen onderzoekers mitose visualiseren in een levend gewerveld organisme en de veelvoud aan defecten die ontstaan wanneer mitotische processen defect zijn.

Observeren mitotische deling en Dynamiek in een live zebravis embryo

Dit protocol biedt een aanpak voor de hele transcriptome analyse van zebravis embryo's, larven, of cellen gesorteerd. Wij omvatten isolatie van RNA, pad analyse van RNASeq gegevens en qRT-PCR-gebaseerde validatie van gen expressie veranderingen.

Bereiding van de monsters en de analyse van de RNASeq gebaseerde gen expressie gegevens uit de zebravis

Zebravis als betrouwbare genetische modelorganismen in biomedisch onderzoek, vooral met de komst van gen-bewerken technologieën zijn gebruikt. Wanneer larvale fenotypen verwachting, kan DNA-extractie en genotype identificatie worden uitdagende. Hier beschrijven we een efficiënte genotypering procedure voor zebrafish larven, door de staart knippen, zo spoedig 72 uur na bevruchting.

High-throughput DNA-extractie en de genotypering van 3dpf Zebrafish larven door Fin knippen

We beschrijven benaderingen voor het manipuleren van genen in het evolutionair modelsysteem Astyanax mexicanus. Drie verschillende technieken worden beschreven: Tol2-gemedieerde Transgenese, gerichte manipulatie van het genoom met behulp van CRISPR/Cas9 en knockdown van meningsuiting met behulp van morpholinos. Deze hulpmiddelen moeten vergemakkelijken het directe onderzoek van genen die ten grondslag liggen aan de variatie tussen oppervlak - en grot-woning vormen.

Manipulatie van de genfunctie in Mexicaanse Cavefish

Dit protocol beschrijft een aanpak om nauwkeurige knock-in bewerkingen in zebravisembryo's te vergemakkelijken met behulp van CRISPR-Cas9-technologie. Een fenotyperingspijplijn wordt gepresenteerd om de toepasbaarheid van deze technieken aan te tonen om een long QT-syndroom-geassocieerde genvariant te modelleren.

CRISPR-Cas9-gemedieerde nauwkeurige knock-in bewerkingen in zebravisharten

CRISPR-Cas-technologieën hebben een revolutie teweeggebracht op het gebied van genoombewerking. Het vinden en isoleren van de gewenste kiembaanbewerking blijft echter een groot knelpunt. Daarom beschrijft dit protocol een robuuste methode voor het snel screenen van F0 CRISPR-geïnjecteerd zebravissperma op kiembaanbewerkingen met behulp van standaard PCR-, restrictieverterings- en gelelektroforesetechnieken.

Screening van sperma op de snelle isolatie van kiembaanbewerkingen bij zebravissen

Hier presenteren we een protocol om eiwitten te labelen met een fluorescentie-eiwitlabel in zebravislarven, een nieuw ontwikkeld en aangepast in vivo systeem dat vooral nuttig is voor het visualiseren van eiwitten met een lage abundantie in zebravissen.

Fluorescentielabeling om eiwitten met een lage expressie in zebravissen te visualiseren

RASopathieën zijn multisysteem-genetische syndromen die worden veroorzaakt door hyperactivering van de RAS-MAPK-route. Potentieel pathogene varianten die wachten op validatie duiken continu op, terwijl slecht preklinisch bewijs de therapie beperkt. Hier beschrijven we ons in vivo protocol voor het testen en kruisvalideren van RASopathie-geassocieerde ERK-activeringsniveaus en de farmacologische modulatie ervan tijdens de embryogenese door middel van live FRET-beeldvorming in Teen-reporter...

Een efficiënt protocol om ERK-activiteitsmodulatie te beoordelen in vroege zebravismodellen van het Noonan-syndroom via live FRET-microscopie en immunofluorescentie

Ontdek PAM-loze basisbewerking met zSpRY-ABE8e voor het modelleren van menselijke genetische ziekten in zebravis. Deze methode maakt efficiënte adenine-conversie mogelijk voor nauwkeurige ziekteanalyse.

Efficiënte PAM-loze basisbewerking voor zebravismodellering van menselijke genetische ziekten met zSpRY-ABE8e

Meer video's verkennen