Efficiënte PAM-loze basisbewerking voor zebravismodellering van menselijke genetische ziekten met zSpRY-ABE8e

Dit protocol stelt onderzoekers in staat om een aantal voorheen niet-beschikbare zebravismodellen van ziekterelevante single-nucleotidevarianten te bouwen. PAM-beperkingen zijn een groot obstakel voor het maken van nauwkeurige diermodellen en zSpRY-ABE8e maakt efficiënte adenine naar guanine-basisconversie mogelijk met lage intermutatie en ontspannen PAN-beperking. Deze tool kan worden gebruikt om nauwkeurige zebravismodellen te construeren voor het bestuderen van de pathogene kenmerken ziektemechanismen gerelateerd aan single-nucleotide mariniers, evenals medicijnscreening voor deze ziekte.

Stel om te beginnen het micropipette-trekkersysteem in en verwarm het minstens 30 minuten voor. Om aan de glazen haarvaten te trekken, selecteert u een programma, stelt u de ramptestwaarde in als warmte, 50 als trekkracht, de snelheid op 100, tijd als 50 en druk als 30. Installeer vervolgens de capillaire buis en zorg ervoor dat deze zich in de groef bevindt.

Druk op pull start/stop"om het programma uit te voeren. Om de getrokken haarvaten te behouden, steekt u ze in schuim met openingen die de naald hangend houden. Gebruik voor experimenten zSpRY-ABE8e mRNA beschreven in het manuscript en bewerk eenvoudig sgRNA gemodificeerd met 2'O-methylfosforothioaat aan beide uiteinden.

Selecteer voor het gRNA-ontwerp bij voorkeur NRN als PAM-sequentie, omdat zSpRY-ABE8e een hogere voorkeur voor NRN PAM vertoont dan NYN PAM. Voer het doel in adeninenucleotide bevindt zich in het zeer actieve bewerkingsvenster van het derde tot het negende nucleotide langs de protospacer. Zet de nacht voor de injectie kweektanks op.

Plaats een scheidingswand en plaats twee vrouwelijke en een mannelijke zebravis in elke tank. Plaats een deksel over elke tank. De volgende ochtend meng je met behulp van RNase-vrije tips, buisjes en handschoenen het ontdooide mRNA en EEgRNA op ijs tot een eindconcentratie van respectievelijk 400 en 200 nanogram per microliter.

Om de pneumatische micro-injector te configureren, sluit u eerst het partiële drukventiel van de luchtpomp. Open vervolgens de hoofdklep, schroef de gasfles los en stel de druk van de partiële drukklep in op 0,2 Megapascal. Schakel nu de micro-injector in en stel de modus in op timer.

Stel de parameterdrukklep in op 20 pond per vierkante inch en de timerwaarde op 0,040 seconden. Breek met een fijne tang hoekig de naalden van de getrokken glazen haarvaten onder een stereomicroscoop. Voeg met behulp van een pipetpunt van een microloader het mRNA/gRNA-mengsel toe aan de punt van een glazen capillair en bevestig de naald aan de micromanipulator.

Configureer de druk- en timerwaarde om twee nanolitermengsel per injectie te produceren met behulp van een microcap. Na het kweken van de vis gedurende 10 tot 15 minuten, verzamel je de eieren in een zeef. Onderzoek het celstadium en de eikwaliteit onder de stereomicroscoop.

Selecteer eencellige eieren voor injectie om de bewerkingsefficiëntie te verbeteren. Lijn de eieren op een 1,5% agarose-injectieplaat en injecteer twee nanoliter van het RNA-mengsel in de cel van de embryo's met behulp van een microscoop. Verzamel de eieren in petrischaaltjes met E3 Buffer en broed ze uit bij 28 graden Celsius.

Verwijder de dode eieren en vervang de kweekbuffer elke 12 uur gedurende 48 uur na de bevruchting. Verzamel na 48 uur na de bevruchting drie pools van zes willekeurig geselecteerde geïnjecteerde embryo's in een PCR-buis. Zodra zes willekeurig geselecteerde controle-embryo's zijn verzameld, gebruikt u een pipet om de resterende E3-buffer op te zuigen.

Voeg 40 microliter 50 millimolair natriumhydroxide toe aan de embryo's. Plaats de buizen gedurende 20 minuten in een metalen bad op 95 graden Celsius en vervolgens gedurende 15 seconden vortex. Voeg vier microliter van één kies Tris-hydrochloride bij pH acht toe aan elke buis.

Centrifugeer de buizen op 2000g gedurende 10 seconden bij kamertemperatuur. Breng het supernatant over in een nieuwe PCR-buis. Verwijder een microliter van het supernatant uit de PCR-buis en gebruik het voor Sanger-sequencing.

Bewaar vervolgens het resterende supernatant bij 20 graden Celsius. Om de Sanger-sequencinggegevens te analyseren, begint u met het uploaden van het sequencingbestand naar het uploadvak ab1 File". Voer de 20-basenpaar gRNA-sequentie in de 5'tot 3'-oriëntatie in het vak gRNA"-sequentie invoeren.

Voer de overeenkomstige basispositie in de vakken 5'start en 3'ends in. Verkrijg de basisbewerkingsefficiëntie door op voorspellende bewerking te klikken "en de kwaliteit van de sequencinggegevens te controleren. Een diamantzwarte anemie zebravismodel werd geconstrueerd door de adenine van het startcodon van Tsr2 om te zetten in guanine.

De EditR-analyse van sequentiegegevens toonde een AG-overlap aan op de adeninebasis van het Tsr2-startcodon. Het fenotype van de twee dagen oude Tsr2-embryo's toonde kleinere ogen in vergelijking met de controle-embryo's. Een gezwollen pericardium werd ook waargenomen in de gemuteerde embryo's.

Om een efficiënte basisbewerking te bereiken, dient u het eerder genoemde ontwerpprincipe van de richtlijn strikt te volgen, wat een voorwaarde is voor het succes van het experiment. Nauwkeurige modellen zijn essentieel voor de studie van single-nucleotide variant-gerelateerde ziekten. De ontwikkeling van de SprY-ABE8e biedt een effectief hulpmiddel voor nauwkeurige modellering, wat helpt om het onderzoek naar ziektemechanismen en behandelingen te bevorderen.