Name: Hypothalamische kisspeptine-neuronen als doelwit voor patchklem-opnames met hele cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T14:25:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Leer de hele-cel patch-klem techniek toe te passen op hersenschijven met kisspeptine-neuronen. Deze elektrofysiologische methode biedt inzicht in neuronale activiteit en draagt bij aan vooruitgang in de neuroendocrinologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door de São Paulo Research Foundation [FAPESP-subsidienummers: 2021/11551-4 (JNS), 2015/20198-5 (TTZ), 2019/21707/1 (RF); en door de Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Finance Code 001" (HRV).

Alle dierprocedures werden goedgekeurd door het Instituut voor Biomedische Wetenschappen Dierenethiekcommissie aan de Universiteit van São Paulo en werden uitgevoerd volgens de ethische richtlijnen van het Braziliaanse College voor Dierproeven.
1. Bereiding van oplossingen
<ol><li>Bereiding van interne oplossing OPMERKING: De interne oplossing vult de patchklemmicropipette en maakt contact met het binnenste van de cel (zie een voorbeeld in figuur 2). Interne oplossingen kunnen variëren afhankelijk van het type activiteit dat moet worden gemeten33.<ol><li>Kies de interne oplossing rekening houdend met het experimentele doel en het juiste recordtype. Om de membraanpotentiaal in de stroomklemmodus te registreren, gebruikt u de interne oplossing bestaande uit 120 mM K-gluconaat, 1 mM NaCl, 5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl 2, 1 mM CaCl2, 3 mM KOH, 10 mM KCl en 4 mM (Mg)-ATP. Weeg alle zouten af volgens het gewenste eindvolume, zoals aangegeven in tabel 1.</li>
		<li>Gebruik voldoende gedeïoniseerd water om 90% van het uiteindelijke volume van de oplossing te bereiken. Dit volume zorgt voor voldoende ruimte om de pH en osmolariteit aan te passen.</li>
		<li>Nadat u alle ingrediënten grondig hebt toegevoegd en gemengd, stelt u de pH in op 7,2-7,3 met 5 M KOH met behulp van een pH-meter. Gebruik een osmometer om de osmolariteit te controleren, die ongeveer 275-280 mOsm moet zijn (indien nodig alleen naar beneden aanpassen).</li>
		<li>Bereid de interne oplossing van tevoren en bewaar bij 8 °C. Voeg de ATP toe op de dag van het experiment. Bewaar de ATP-bevattende interne oplossing bij -20 °C (1 ml aliquots) gedurende 3-4 maanden.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van snijoplossing<ol><li>Bereid een snijoplossing die 238 mM sucrose, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,0 mM NaH 2 PO4, 10 mM glucose, 1,0 mM CaCl 2 en 5,0 mM MgCl2 bevat. Weeg alle zouten af volgens het gewenste eindvolume, zoals weergegeven in tabel 2. Het exacte volume van deze te bereiden oplossing hangt af van de grootte van de snijkamer.</li>
		<li>Terwijl u alle zouten in gedeïoniseerd water mengt, verzadigt u voortdurend met carbogen (95% O 2 en 5% CO2). Bevestig polyethyleen buizen (1,57 mm buitendiameter [OD] x 1,14 mm binnendiameter [ID]) aan een carbogencilinder om carbogen aan de snijoplossing te leveren. Houd het open uiteinde van de buis in het bekerglas met de snijoplossing.</li>
		<li>Nadat je alle ingrediënten goed hebt gemengd, stel je de pH in op 7,3 met 10% salpeterzuur met behulp van een pH-meter. Gebruik een osmometer om de osmolariteit te controleren, die 290-295 mOsm moet zijn (indien nodig alleen naar beneden aanpassen). Laat de oplossing daarna afkoelen tot 0-2 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>ACSF-oplossing voorbereiden voor opnames<ol><li>Bereid kunstmatige cerebrospinale spinale vloeistof (aCSF) oplossing voor opnames met 124 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO4, 5 mM glucose en 2,5 mM CaCl2. Weeg alle zouten af volgens het gewenste eindvolume in tabel 3.</li>
		<li>Tijdens het mengen van alle zouten in gedeïoniseerd water, constant verzadigen met carbogen (95% O 2 en 5% CO 2), zoals beschreven in stap 1.2.2.</li>
		<li>Nadat u alle ingrediënten hebt toegevoegd en gemengd, stelt u de pH in op 7,3 (10% salpeterzuur kan worden gebruikt) met behulp van een pH-meter. Gebruik een osmometer om de osmolariteit te controleren, die 290-300 mOsm moet zijn. Giet daarna de aCSF in een bekerglas en onderhoud in een waterbad op 30 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Hersendissectie en slicing
OPMERKING: Aangezien verschillende hersenstructuren mogelijk in verschillende vlakken moeten worden gesneden (coronale, sagittale of horizontale plakjes), hangt de exacte aanpak voor het verkrijgen van de plakjes af van het hersengebied van belang. Typisch, om de Kiss1-tot expressie brengende cellen in de AVPV / PeN en ARH te bestuderen (hier aangeduid als AVPV / PeN Kisspeptine-neuronen en ARHkisspeptine-neuronen; Figuur 2A,B), coronale hersenschijfjes (200-300 μm) worden meestalgemaakt 17,19,20,21,34. De AVPV/PeNKisspeptin neuronen bevinden zich op ongeveer 0,5 tot -0,22 mm van de bregma, terwijl ARHkisspeptin neuronen zich op -1,22 tot -2,70 mm bevinden. De locatie van de kernen kan worden bepaald met behulp van een stereotaxische muizenhersenatlas35 of de Allen Mouse Brain Reference Atlas (http://mouse.brain-map.org/). Volwassen Kiss1-Cre/GFP vrouwelijke (diestrus-stadium) en mannelijke muizen36 werden gebruikt in deze studie.
<ol><li>Hersenverwijdering<ol><li>Bereid de dissectieplaats voor en de hulpmiddelen die nodig zijn om de hersenen te extraheren: onthoofdingsschaar, irisschaar, Castroviejo gebogen schaar, osteotoom, pincet, spatel, filterpapier, petrischaal, scheermesje en cyanoacrylaatlijm.</li>
		<li>Voordat u de plakjes maakt, bereidt u de bank voor waarop de dissectie zal worden uitgevoerd, omdat alle volgende procedures snel moeten worden uitgevoerd. Zorg ervoor dat je toegang hebt tot een snijapparaat zoals een vibratome.</li>
		<li>Bereid een opnamekamer voor om de hersenplakken te onderhouden voordat u het weefsel snijdt. Koop een opnamekamer, badafmetingen van 24 mm x 15 mm x 2 mm (L x B x H), van een commercieel merk (Table of Materials) of maak er een in eigen huis. OPMERKING: Een interne herstelkamer kan als volgt worden vervaardigd: snijd een plaat met 24 putten zodat er negen putten beschikbaar zijn. Lijm een nylon scherm aan de basis van de negen putjes. Maak met de rest van de putplaat een basis zodat het onderste deel van het nylon vrij is. Deze aangepaste basis kan in een bekerglas van 500 ml met de aCSF worden geplaatst (aanvullende figuur 1).</li>
		<li>Na het bereiden van alles, verdoof het dier met geïnhaleerde verdoving met behulp van 4% -5% isofluraan. De anesthesie moet in overeenstemming zijn met een protocol dat is goedgekeurd door de ethische commissie. Kort nadat het dier onbeweeglijk is, voert u staart- en pootknijptests uit om ervoor te zorgen dat het dier diep verdoofd is.</li>
		<li>Onthoofd de muizen snel terwijl het hart nog actief is om de levensvatbaarheid van de cel te vergroten. Oogst de hersenen snel na onthoofding.</li>
		<li>Maak met een chirurgische schaar een incisie in de huid aan de bovenkant van de schedel van het dier, van caudaal tot rostral, en verwijder de hoofdhuid van het hoofd van het dier. Knip vervolgens de interpariëtale plaat langs de sagittale hechting met de irisschaar en verwijder het achterhoofdsbeen. Schuif het osteotoom onder het pariëtale bot en trek het voorzichtig uit totdat de hersenen worden blootgesteld.</li>
		<li>Nadat je de hersenen hebt blootgesteld, draai je het hoofd ondersteboven, laat je de hersenen zachtjes zakken om de nervus trigeminus aan elke kant te visualiseren en knip je vervolgens de nervus trigeminus door met een gebogen schaar van Castroviejo. Na het visualiseren van de hypothalamus, identificeert u de oogzenuw en snijdt u deze voorzichtig door. OPMERKING: Wees voorzichtig bij het snijden van de oogzenuw, omdat het trekken ervan het aangrenzende hypothalamische gebied met de AVPV / PeN-kern zal scheuren.</li>
		<li>Snijd het meest voorste deel van de frontale kwab en verwijder de hersenen volledig. Dompel de hersenen onmiddellijk onder in de snijoplossing totdat de plakjes zijn verkregen.</li>
	</ol></li>
	<li>Hersenmonsters snijden<ol><li>Plaats de hersenen op filterpapier (ondersteund op een petrischaaltje) om de overtollige oplossing te drogen. Voer vervolgens met een scherp snijdend scheermesje een coronale snede uit die de hersenstam met het cerebellum scheidt van de rest van het weefsel.</li>
		<li>Lijm vervolgens het caudale deel van de hersenen op de basis van het vibratoom en vul de kamer van het snijapparaat met de snij-/aCSF-oplossing gekoeld tot 0-2 °C. Verpak tijdens de procedure droogijs rond de vibratomenkamer om de snijoplossing koud te houden.</li>
		<li>Steek het scheermesje in het vibratoom en stel de juiste snijparameters van het apparaat in: snelheid = 3, frequentie = 9 en voeding = 250 μm. Gebruik een acryl transfer pipet (omgekeerde Pasteur glazen pipet bevestigd aan een siliconen speen) om de plakjes over te brengen naar de herstelkamer (beschreven in stap 2.1.3) tijdens de weefselsnijprocedure. Wacht 60 minuten op weefselherstel na het verkrijgen van een plak.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Celafdichting voor opname
<ol><li>Zorg ervoor dat alle apparaten (microscoop, versterker, digitizer, micromanipulator en andere) zijn ingeschakeld voordat u de opname start.</li>
	<li>Vul de opnamekamer, van een commercieel merk (Table of Materials), bevestigd aan de microscoop met de aCSF-oplossing voor opnames. Gebruik een perfusiepomp om de aCSF constant te doordrenken met een snelheid van 2 ml / min.</li>
	<li>Breng een hersenschijfje van belang (één voor één) over naar de opnamekamer. Gebruik een acryl transfer pipet (omgekeerde Pasteur glazen pipet bevestigd aan een siliconen speen) om de hypothalamische plakjes over te brengen naar de kamer. Gebruik een segmentanker (materiaaltabel) om het segment vast te houden zodat het niet beweegt tijdens de aCSF-perfusie.</li>
	<li>Plaats een plakje in het midden van de opnamekamer die aan de microscoop is bevestigd. De snijpositie is van cruciaal belang voor een goed zicht op het gewenste gebied onder de microscoop en voor een perfect bereik van de opnamemicropipette.</li>
	<li>Gebruik de low-power objectieflens van een dompelmicroscoop (10x of 20x) om te helpen bij het positioneren van het segment en het lokaliseren van het interessegebied.</li>
	<li>Na het lokaliseren van het interessegebied, schakelt u de objectieflens over naar de krachtige lens (63x) en concentreert u zich op het weefselniveau, waarbij u het endogene fluorescerende eiwit en de vormen van de cellen in het doelgebied observeert om de kisspeptine-cellen op het oppervlak van de hersenschijf20 te lokaliseren.</li>
	<li>Wanneer een mogelijke doelcel zich bevindt, markeert u deze op het computerscherm met de muiscursor of door een indeling, zoals een vierkant, over het interessegebied te tekenen. De markering van het computerscherm helpt de positie van de opnamemicropipet naar de cel te leiden.</li>
	<li>Nadat u de exacte locatie van de doelcel hebt bepaald, tilt u het doel op en introduceert u de opnamemicropipette gevuld met de interne oplossing. Wanneer u de micropipet in de elektrodehouder plaatst, moet u ervoor zorgen dat de interne oplossing in contact is met de zilveren elektrode. OPMERKING: Voor de voorbereiding, plaatsing en positionering van micropipetten op de elektrodehouder raadpleegt u33.</li>
	<li>Oefen positieve druk uit voordat u de micropipette onderdompelt in de aCSF-oplossing, om te voorkomen dat vuil de micropipette binnendringt, met behulp van een met lucht gevulde spuit van 1-3 ml die via een polyethyleenslang (≈130 cm langer) op de micropipettehouder is aangesloten; Breng bijna 100-200 μL lucht aan.</li>
	<li>Gebruik de micromanipulator om de micropipet onder het midden van het objectief te leiden. Beweeg de knoppen op de micromanipulator om de micropipette op de X-Y-Z-as naar de cel van belang te leiden.</li>
	<li>Pas de scherpstelling aan om de punt van de micropipette te zien en breng de focus dichterbij, maar niet te dicht, bij het segment. Verlaag de snelheid van de micromanipulator en laat de micropipette langzaam zakken tot het scherpstelvlak. Zorg ervoor dat de punt van de micropipet niet abrupt in de plak doordringt, maar langzaam afdaalt totdat deze het oppervlak van de cel / het doelgebied raakt.</li>
	<li>Breng lichte positieve druk (≈100 μL) aan met de 1-3 ml luchtgevulde spuit die aan de micropipethouder is bevestigd om vuil van de aanvliegroute te verwijderen.</li>
	<li>Focus op de doelcel en beweeg de micromanipulator langzaam op de X-Y-Z-as om de micropipette dichter bij de doelcel te brengen. Bij het aanraken van de micropipette op de cel zal een kuiltje worden waargenomen dat wordt veroorzaakt door de druk die door de punt van de micropipet wordt uitgeoefend (figuur 2C).</li>
	<li>Na het vormen van het kuiltje, vanwege de nabijheid van de micropipette tot de cel, brengt u zwakke, korte zuigkracht via de mond (1-2 s) aan door de buis die is aangesloten op de micropipettehouder om de afdichting tussen de micropipette en de cel te genereren (gigaohm-afdichting of gigaseal >1 GΩ; Figuur 2D). Om de afdichting te vormen, gebruikt u de spanningsklemmodus op de software. Voor details over de samenstelling van de afdichting, zie33.</li>
	<li>Als de afdichting stabiel blijft (de gigaohm-afdichting moet mechanisch stabiel zijn en zonder ruisinterferentie, bepaald door observatie gedurende ongeveer 1 min), stelt u de houdspanning in op de dichtstbijzijnde fysiologische rustpotentiaal van de cel van belang. Voor kisspeptin hypothalamische neuronen wordt -50 mV aanbevolen.</li>
	<li>Breng een korte zuiging via de mond (negatieve druk) aan met de micropipette die aan de cel is afgedicht om het plasmamembraan te breken (figuur 2E). Adequate configuratie van de hele cel wordt bereikt wanneer de zuigkracht met voldoende kracht wordt uitgevoerd, zodat het gescheurde membraan de micropipette niet verstopt en geen aanzienlijk deel van het membraan of zelfs de cel aantrekt.</li>
	<li>Raadpleeg de gebruikte handleiding voor systeeminstellingen. Gebruik de software (zie Materiaaltabel) om de serieweerstand (SR) en de whole-cell capacitance (wcc) digitaal te controleren en te berekenen.</li>
	<li>In de spanningsklemmodus, na het breken van het celmembraan, schakelt u de optie voor de hele cel in en klikt u op de opdracht Auto die verwijst naar het tabblad hele cel. De SR en wcc van de cel worden automatisch berekend en direct weergegeven door de software. Deze parameters kunnen ook worden gecontroleerd door de membraantest uit te voeren met de versterker die wordt vermeld in de materiaaltabel33.</li>
	<li>Zorg ervoor dat u de parameters voor de levensvatbaarheid van cellen controleert. Controleer voor kisspeptineneuronen of de elektrofysiologische metingen zijn: SR < 25 mΩ, ingangsweerstand > 0,3 GΩ en met de huidige absolute waarde < 30 pA (persoonlijke waarnemingen en referentie21). De gemiddelde waarde van de wcc van AVPV/PeNKisspeptin of ARHkisspeptin neuronen is ≈ 10-12 pF bij gonade-intacte muizen20.</li>
	<li>Bewaak de SR en de steady-state capaciteit van de cel tijdens de experimenten. Zorg ervoor dat de SR niet meer dan 20% verandert tijdens een opname en dat de membraancapaciteit stabiel is.</li>
	<li>Controleer de software-instellingen. Maak specifieke protocollen voor de opnames op basis van het type experiment. Om de membraanpotentiaal in de stroomklemmodus vast te leggen, met apparatuur die in de materiaaltabel wordt genoemd, filtert u de elektrofysiologische signalen op 2-4 kHz en analyseert u de resultaten offline in een software (zie de materiaaltabel voor software-informatie).</li>
	<li>Zodra de configuratie van de hele cel correct is bereikt, meet u synaptische stromen in de spanningsklemmodus (figuur 2G). Registreer veranderingen in rustmembraanpotentiaal (RMP) en geïnduceerde RMP-variaties in de stroomklemmodus (figuur 2H). Veranderingen in RMP, zoals depolarisatie van het celmembraan, kunnen worden geïnduceerd door toediening van een bekend geneesmiddel/neurotransmitter aan het bad (beschreven in stap 3.2), zoals geïllustreerd in figuur 1. OPMERKING: In de stroomklemmodus kan positieve of negatieve stroom worden geïnjecteerd om de membraanspanning op een gewenste spanning te houden. Voor kisspeptine-neuronen stellen we meestal nulstroominjectie (I = 0) in om de spontane variatie van de membraanpotentiaal te registreren.</li>
</ol>

Er mogen geen belangenconflicten worden aangegeven.

De ontwikkeling van de whole-cell patch-clamp techniek had een aanzienlijke impact op de wetenschappelijke gemeenschap en werd van het grootste belang geacht voor de ontwikkeling van wetenschappelijk onderzoek en het mogelijk maken van verschillende ontdekkingen. De impact ervan op de wetenschap was voldoende om te culmineren in de Nobelprijs voor de Geneeskunde in 1991, omdat deze ontdekking de deur opende naar een beter begrip van hoe ionkanalen functioneren onder fysiologische en pathologische omstandigheden, evenals ...

Hodgkin en Huxley maakten het eerste intracellulaire record van een actiepotentiaal beschreven in verschillende wetenschappelijke studies. Deze opname werd uitgevoerd op het inktvis-axon, dat een grote diameter heeft (~ 500 μm), waardoor een micro-elektrode in het axon kan worden geplaatst. Dit werk bood grote mogelijkheden voor wetenschappelijk onderzoek, later culminerend in de creatie van de spanningsklemmodus, die werd gebruikt om de ionische basis van actiepotentiaalgeneratie 1,2,3,4,5,6,7,8 te bestuderen. In de loop der jaren is de techniek verbeterd en op grote schaal toegepast in wetenschappelijk onderzoek 6,9. De uitvinding van de patch-clamp-techniek, die plaatsvond in de late jaren 1970 door studies geïnitieerd door Erwin Neher en Bert Sakmann, stelde onderzoekers in staat om enkele ionkanalen en intracellulaire membraanpotentialen of -stromen in vrijwel elk type cel vast te leggen met behulp van slechts een enkele elektrode 9,10,11,12 . Patch-clamp-opnamen kunnen worden gemaakt op verschillende weefselpreparaten, zoals gekweekte cellen of weefselplakken, in spanningsklemmodus (waarbij het celmembraan op een ingestelde spanning wordt gehouden waardoor bijvoorbeeld spanningsafhankelijke stromen en synaptische stromen kunnen worden geregistreerd) of stroomklemmodus (waardoor bijvoorbeeld veranderingen in rustmembraanpotentiaal geïnduceerd door ionenstromen kunnen worden geregistreerd, actiepotentialen en postsynaptische potentiaalfrequentie).
Het gebruik van de patch-clamp techniek maakte verschillende opmerkelijke ontdekkingen mogelijk. Inderdaad, de baanbrekende bevindingen over de elektrofysiologische eigenschappen van hypothalamische kisspeptine-neuronen gelegen op de anteroventrale periventriculaire en rostrale periventriculaire kernen (AVPV / PeN Kisspeptin), ook bekend als het rostrale periventriculaire gebied van de derde ventrikel (RP3V), en de boogvormige kern van de hypothalamus (ARHkisspeptin)13,14,15 zijn van bijzonder belang. In 2010 voerden Ducret et al. de eerste opnames uit van AVPV / PeNKisspeptine-neuronenin muizen met behulp van een ander elektrofysiologisch hulpmiddel, de lose-cell patch-clamp-techniek. Deze studies gaven een elektrische beschrijving van AVPV / PeNKisspeptine-neuronen en toonden aan dat hun vuurpatronen afhankelijk zijn van de oestruscyclus-afhankelijke16. In 2011 gebruikten Qiu et al. de hele cel patch-clamp-techniek om aan te tonen dat ARHkisspeptin neuronen endogene pacemakerstromen tot expressie brengen17. Vervolgens toonden Gottsch et al. aan dat kisspeptine-neuronen spontane activiteit vertonen en zowel h-type (pacemaker) als T-type calciumstromen tot expressie brengen, wat suggereert dat ARHkisspeptine-neuronen elektrofysiologische eigenschappen delen met andere pacemakerneuronen van het centrale zenuwstelsel18. Bovendien is aangetoond dat ARHkisspeptine-neuronen seksueel dimorfe vuursnelheden vertonen en dat AVPV / PeNKisspeptine-neuronen een bimodaal rustmembraanpotentiaal (RMP) vertonen dat wordt beïnvloed door ATP-gevoelige kaliumkanalen (KATP)19,20. Bovendien werd vastgesteld dat gonadale steroïden de spontane elektrische activiteit van de kisspeptine-neuronen bij muizen positief beïnvloeden 19,20,21. De eerste werken die de elektrofysiologische eigenschappen van kisspeptine-neuronen bestuderen, worden genoemd 16,17,18,19,20. Sindsdien hebben veel studies de whole-cell patch-clamp techniek gebruikt om aan te tonen welke factoren/neuromodulatoren voldoende zijn om de elektrische activiteit van kisspeptin neuronen te moduleren (Figuur 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32.
Gezien het belang van deze techniek voor de studie van neuronen die nodig zijn voor reproductie, naast andere celtypen die hier niet worden behandeld, beschrijft dit artikel de basisstappen voor de ontwikkeling van de patch-clamp-techniek van de hele cel, zoals het voorbereiden van de oplossingen, het ontleden en snijden van de hersenen en het uitvoeren van de afdichting van het celmembraan voor opnames. Bovendien worden relevante kwesties over de techniek besproken, zoals de voordelen, technische beperkingen en belangrijke variabelen die moeten worden gecontroleerd voor optimale experimentele prestaties.

<table><tbody><tr><td>Verbindingen voor aCSF, interne en snijvloeistoffen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>O3777</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>KCL</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>K-gluconaat</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>salpeterzuur</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>225711</td><td>VOORZICHTIG</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td>Apparaten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luchttafel</td><td>TMC</td><td>63-534</td><td></td></tr><tr><td>Versterker</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td>various</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>DIGIDATA 1440 LAAG-GERUIS DATA-ACQUISITIE-SYSTEEM</td><td>Molecular Devices</td><td>DD1440</td><td></td></tr><tr><td>Digitale peristaltiekpomp</td><td>Ismatec</td><td>ISM833C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Faradaykooi</td><td>TMC</td><td>81-333-03</td><td></td></tr><tr><td>Beeldcamera</td><td>Leica</td><td>DFC 365 FX</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>Roe-200</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetpuller</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Leica</td><td>DM6000 FS</td><td></td></tr><tr><td>Osteotome</td><td>Bonther equipamentos &amp; Tecnologia/various</td><td>128</td><td></td></tr><tr><td>Herstelkamer</td><td>Warner Instruments/Harvard apparatus</td><td>-</td><td>kan in eigen beheer worden gemaakt</td></tr><tr><td>Opnamekamer</td><td>Warner Instruments</td><td>640277</td><td></td></tr><tr><td>Spatel</td><td>Fisher Scientific /various</td><td>FISH-14-375-10; FISH-21-401-20</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome&nbsp;</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Waterbad&nbsp;</td><td>Fisher Scientific /various</td><td>Isotemp</td><td></td></tr><tr><td>Software en systemen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxoScope 10 software</td><td>Molecular Devices</td><td>-</td><td>Commander Software</td></tr><tr><td>LAS X breedveldsysteem</td><td>Leica</td><td>-</td><td>Beeldverwerving en -analyse</td></tr><tr><td>MultiClamp 700B</td><td>Molecular Devices</td><td>MULTICLAMP 700B</td><td>Commander Software</td></tr><tr><td>PCLAMP 10 SOFTWARE VOOR WINDOWS</td><td>Molecular Devices</td><td>Pclamp 10 Standard</td><td></td></tr><tr><td>Gereedschappen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl-elektrode, pellet, 1,0 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1309</td><td></td></tr><tr><td>Gebogen hemostatisch forceps</td><td>various</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>cyanoacrylaatlijm</td><td>LOCTITE/various</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Onthoofdkaarschaar</td><td>various</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>various</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Glazen capillairen (micropipet)</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>TW150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Iris schaar</td><td>Bonther equipamentos &amp; Tecnologia/various</td><td>65-66</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur glaspipet&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>CLS7095B9-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>various</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleen buisje&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0756</td><td></td></tr><tr><td>Vleesmes voor hersendissectie</td><td>TED PELLA</td><td>TEDP-121-1</td><td></td></tr><tr><td>Vleesmes voor de vibratome</td><td>TED PELLA</td><td>TEDP-121-9</td><td></td></tr><tr><td>Schaar</td><td>Bonther equipamentos &amp; Tecnologia/various</td><td>71-72, 48,49;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Siliconen speen</td><td>various</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Slice Anchor&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0246</td><td></td></tr><tr><td>Spuitfilters</td><td>Merck Millipore Ltda</td><td>SLGVR13SL</td><td>Millex-GV 0,22 &mu;m</td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Bonther equipamentos &amp; Tecnologia/various</td><td>131, 1518</td><td></td></tr></tbody></table>

hypothalamische kisspeptine-neuronen als doelwit voor patchklem-opnames met hele cellen

Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings

Kisspeptinen zijn essentieel voor de rijping van de hypothalamus-hypofyse-gonadale (HPG) as en vruchtbaarheid. Hypothalamische kisspeptine-neuronen in de anteroventrale periventriculaire kern en rostrale periventriculaire kern, evenals de boogvormige kern van de hypothalamus, projecteren op gonadotrofine-releasing hormoon (GnRH) neuronen, naast andere cellen. Eerdere studies hebben aangetoond dat kisspeptine-signalering plaatsvindt via de Kiss1-receptor (Kiss1r), uiteindelijk opwindende GnRH-neuronactiviteit. In menselijke en experimentele diermodellen zijn kisspeptinen voldoende voor het induceren van GnRH-secretie en bijgevolg luteïniserend hormoon (LH) en follikelstimulerend hormoon (FSH) afgifte. Omdat kisspeptinen een essentiële rol spelen in reproductieve functies, werken onderzoekers eraan om te beoordelen hoe de intrinsieke activiteit van hypothalamische kisspeptine-neuronen bijdraagt aan reproductiegerelateerde acties en de primaire neurotransmitters / neuromodulatoren te identificeren die in staat zijn om deze eigenschappen te veranderen. De whole-cell patch-clamp techniek is een waardevol hulpmiddel geworden voor het onderzoeken van kisspeptin neuron activiteit in knaagdiercellen. Deze experimentele techniek stelt onderzoekers in staat om spontane exciterende en remmende ionische stromen, rustmembraanpotentiaal, actiepotentiaal en andere elektrofysiologische eigenschappen van celmembranen vast te leggen en te meten. In de huidige studie worden cruciale aspecten van de whole-cell patch-clamp-techniek, bekend als elektrofysiologische metingen die hypothalamische kisspeptine-neuronen definiëren, en een bespreking van relevante kwesties over de techniek, besproken.

Om de mogelijke effecten van humaan recombinant groeihormoon (hGH) op de activiteit van hypothalamische kisspeptine-neuronen te bestuderen, voerden we hele cel patch-clamp-opnames uit in hersenplakken en beoordeelden we of dit hormoon acute veranderingen veroorzaakt in de activiteit van AVPV / PeN Kisspeptin en ARHkisspeptin neuronen. Volwassen Kiss1-Cre/GFP vrouwelijke (diestrus-stadium) en mannelijke muizen36 werden gebruikt in deze studie. Gonad-intacte dieren werden gesel...

Hier presenteren we een protocol om een pleisterklem van hele cellen uit te voeren op hersenplakken die kisspeptine-neuronen bevatten, de primaire modulator van gonadotrofine-releasing hormoon (GnRH) -cellen. Door kennis toe te voegen over de activiteit van kisspeptine-neuronen, heeft dit elektrofysiologische hulpmiddel de afgelopen 20 jaar als basis gediend voor aanzienlijke vooruitgang op het gebied van neuro-endocrinologie.

Hypothalamische kisspeptine-neuronen als doelwit voor patchklem-opnames met hele cellen

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in ...

Door de elektrofysiologische eigenschappen van celmembranen te meten, bewijst de vraag van de belangrijkste dat moduleren van de elektrische activiteit van een cel kan worden opgelost. Whole-cell patch clamp recording is een perifere techniek om ionische stromen in individuele cellen te bestuderen en de cellulaire reactie op verschillende stimuli te onderzoeken. De beste prestaties op whole-cell patch clamp pre-opnames worden bereikt na veel oefenen en studeren.Om hersendissectie te beginnen, maakt u een incisie met behulp van een chirurgische schaar in de huid aan de bovenkant van de schedel van het onthoofde dier van caudaal tot rostral en verwijdert u de hoofdhuid. Knip vervolgens de interpariëtale plaat langs de sagittale hechting met de irisschaar en verwijder het achterhoofdsbeen. Schuif het osteotoom onder het pariëtale bot en trek het voorzichtig uit totdat de hersenen worden blootgesteld.Nadat je de hersenen hebt blootgesteld, draai je het hoofd ondersteboven. Laat de hersenen voorzichtig zakken om de nervus trigeminus aan elke kant te visualiseren. Knip vervolgens de nervus trigeminus door met een gebogen schaar van Castroviejo.Na het visualiseren van de hypothalamus identificeert u de oogzenuw en snijdt u deze voorzichtig door. Snijd vervolgens het verre voorste deel van de frontale kwab af. Verwijder de hersenen en dompel deze onmiddellijk onder in de snijoplossing totdat de plakjes zijn verkregen.Om de hersenmonsters te snijden, plaatst u de hersenen op een filterpapier om de overtollige oplossing te drogen. Voer vervolgens met een scherp snijdend scheermesje een coronale snede uit die de hersenstam met het cerebellum scheidt van de rest van het weefsel. Lijm vervolgens het caudellgedeelte van de hersenen op de basis van een vibratoom en vul de snijapparaatkamer met de snijoplossing of aCSF-oplossing gekoeld tot nul tot twee graden Celsius.Verpak droogijs rond de vibratomenkamer om de snijoplossing koud te houden tijdens de procedure. Steek het scheermesje in het vibratoom en stel de snijparameters van het apparaat in, zoals snelheid op drie, frequentie op negen en voeding tot 250 micrometer. Breng tijdens de weefselsnijprocedure de plakjes met behulp van een acryltransferpipet over naar de herstelkamer en wacht 60 minuten op weefselherstel na het verkrijgen van de plak.Voordat u begint met het afdichten en opnemen van cellen, schakelt u de microscoop, versterker, digitizer en micromanipulator in. Bouw de opnamekamer die aan de microscoop is bevestigd met de aCSF-oplossing. Gebruik een perfusiepomp om de aCSF constant te doordrenken met twee milliliter per minuut.Controleer de software-instellingen en maak specifieke protocollen voor de opnames op basis van het type experiment. Breng een hersenschijfje van belang één voor één over naar de opnamekamer met behulp van een acryltransferpipet. Houd het segment vast met een segmentanker zodat het niet beweegt tijdens de aCSF-perfusie.Plaats het segment in het midden van de opnamekamer met behulp van de low-power objectieflens van de immersiemicroscoop, 10X of 20X. De snijpositie is van cruciaal belang voor een goed zicht op het gewenste gebied onder de microscoop en voor een perfect bereik voor de opnamemicropipette. Na het lokaliseren van het interessegebied schakelt u de objectieflens over naar de krachtige lens, 63X en focust u op het weefselniveau en observeert u het endogene fluorescerende eiwit en de vormen van de cellen in het doelgebied om de kisspeptine-cellen op het oppervlak van de hersenschijf te lokaliseren.Wanneer een mogelijke doelcel zich bevindt, markeert u deze op het computerscherm met de muiscursor of door een indeling als een vierkant over het interessegebied te tekenen. De markering van het computerscherm helpt de positie van de opnamepipet naar de cel te leiden. Na het bepalen van de exacte locatie van de doelcel, tilt u het objectief op en introduceert u de opnamemicropipette gevuld met de interne oplossing in de elektrodehouder, zodat de interne oplossing in contact komt met de zilveren elektrode.Oefen een overdruk uit voordat u de micropipette onderdompelt in de aCSF-oplossing met behulp van een met lucht gevulde spuit van één tot drie milliliter die via een polyethyleenslang op de micropipettehouder is aangesloten om te voorkomen dat vuil de micropipette binnendringt. Gebruik de micromanipulator om de micropipette onder het midden van het objectief te geleiden. Beweeg de micromanipulatorknoppen om de XYZ-as van de micropipette naar de cel van interesse te leiden.Pas de scherpstelling aan om de punt van de micropipet te zien en breng de focus dichterbij, maar niet te dicht bij het plakje. Verlaag de snelheid van de micromanipulator en laat de micropipette langzaam zakken tot de vlakte van focus, zodat de punt van de micropipette niet abrupt de plak binnendringt, maar langzaam daalt totdat deze het oppervlak van de cel of het doelgebied raakt. Lichte positieve druk toepassen met een met lucht gevulde spuit van één tot drie milliliter om vuil van de aanvliegroute te verwijderen.Beweeg de micromanipulator langzaam op de XYZ-as om de punt van de micropipet dichterbij te brengen en raak de doelcel aan die een kuiltje veroorzaakt door de uitgeoefende druk. Na het vaststellen van het kuiltje met behulp van de spanningsklemmodus op de software, past u gedurende één tot twee seconden een zwakke korte zuigkracht via de mond toe door de buis die is aangesloten op de micropipettehouder om de afdichting tussen de micropipette en de cel te genereren. Als de afdichting gedurende ongeveer een minuut mechanisch stabiel blijft zonder ruisinterferentie, stelt u de houdspanning in op de dichtstbijzijnde fysiologische rustpotentiaal van de cel van belang.Voor kisspeptin worden hypothalamische neuronen minus 50 millivolt aanbevolen. Breng vervolgens een korte zuiging via de mond aan om het plasmamembraan te breken bij de micropipetpunt die aan de cel is bevestigd, zodat het gescheurde membraan de micropipette niet verstopt of een aanzienlijk membraangedeelte of de cel aantrekt. Een adequate configuratie van de hele cel kan worden bereikt door zuigkracht met voldoende kracht uit te voeren.Raadpleeg de gebruikte handleiding voor systeeminstellingen. Nadat u het celmembraan hebt gebroken, schakelt u de optie voor de hele cel in de spanningsklemmodus in en klikt u op het automatische commando dat verwijst naar het tabblad van de hele cel. De serieweerstand van de cel en de capaciteit van de hele cel worden automatisch berekend en direct weergegeven door de software.Controleer vervolgens de parameters voor de levensvatbaarheid van de cel in de software zoals beschreven in het tekstmanuscript. Bewaak de serieweerstand en de steady state-capaciteit van de cel tijdens de experimenten. Zodra de hele celconfiguratie correct is bereikt, meet u synaptische stromen in de spanningsklemmodus.Noteer de veranderingen in rustmembraanpotentiaal en geïnduceerde rustmembraanpotentiaalvariaties in de huidige klemmodus. De mogelijke effecten van humaan recombinant groeihormoon op de activiteit van hypothalamische kisspeptine neuronen werden bestudeerd met behulp van hele-cel patch klem opnames. De toediening van menselijk recombinant groeihormoon, HGH bij 20 microgram per gram veroorzaakte een significante hyperpolarisatie van het rustmembraanpotentiaal in 5 van de 12 AVPV / PeN kisspeptine-neuronen en 9 van de 14 geregistreerde ARH-kisspeptine-neuronen.De AVPV/PeN kisspeptin en ARH kisspeptin hyperpolarized neuronen veranderden significant het rustmembraanpotentiaal in vergelijking met de niet-reagerende cellen. De effecten op rustmembraanpotentiaal tijdens HGH-toepassing volgden op een significante vermindering van de inputweerstand van de hele cel van ongeveer 0,9 tot 0,7 gigaohms op AVPV / PeN kisspeptine-neuronen en 1,7 tot 1,0 gigaohms op ARH-kisspeptine-neuronen. Tijdens de perfecte hersenlijnen uitgevoerd via zorgvuldige gigaseal en het gebied ding op de cel via strand parameters zijn nodig om de beste hele cel opnames te bereiken.De micropipetoplossing van de opgenomen cel kan worden verzameld en gebruikt voor eencellige RTPCR, waardoor de moleculaire karakterisering van een geïsoleerde cel mogelijk is. Whole-cell patch camp-techniek in combinatie met het gebruik van genetisch gemodificeerde dieren vertegenwoordigt een doorbraak in het begrip van reproductie waardoor de definitie van kisspeptine-neuronen verhoogde eigenschappen mogelijk maakt, en ze zijn belangrijke modulatoren.

hypothalamic-kisspeptin-neurons-as-target-for-whole-cell-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit protocol beschrijft een techniek genaamd whole-cell patch clamp electrophysiology, een methode om elektrische eigenschappen van Mauthner neuronen en andere reticulospinale cellen in zebravisembryo's te bestuderen.

Whole-Cell Patch Clamp Electrophysiology: een methode om elektrische eigenschappen van neuronen te bestuderen

The video demonstrates a method to study the excitability of neuronal cells expressing fluorescent protein using a whole-cell patch current clamp. In the current-clamp mode, action potentials indicative of neuronal excitability are generated.

Studying the Excitability of Fluorescent Neurons using a Whole-Cell Patch Clamp

The video demonstrates a protocol to study synaptic interactions and neuronal responses in a transfected mouse hippocampal brain slice. It involves illuminating long-range sensory neurons to trigger action potentials and recording the resulting excitatory post-synaptic potentials in the recorded neuron using the whole-cell patch-clamp technique.

Photostimulation and Whole-Cell Patch Clamp Recordings of Neurons in Mouse Hippocampal Slices

This video demonstrates the use of the whole-cell patch-clamp technique to measure responses in kisspeptin neurons from transfected mouse hypothalamic slices. The process involves achieving whole-cell configuration and recording membrane potential changes induced by the test hormone using current-clamp mode.

Determining a Test Growth Hormone Effect on Kisspeptin Neurons using a Whole-Cell Patch Clamp

This video demonstrates the procedure for performing electrophysiological recordings in substantia gelatinosa (SG) neurons of spinal cord slices, using whole-cell patch-clamp techniques to analyze neuron firing patterns. This method allows the study of neural responses to stimuli in SG neurons of the spinal cord.

Whole-Cell Patch Clamp Recording in a Substantia Gelatinosa Neuron of a Spinal Cord Slice

The protocol video describes establishing a whole-cell patch clamp for electrophysiological recording from the sensory neurons of the vomeronasal organ (VNO) in mice. A coronal VNO slice with fluorescently labeled sensory neurons is placed in a recording setup. A labeled neuron is patched with a recording pipette in a whole-cell configuration for electrophysiological recording in response to chemical stimuli.

Establishing a Whole-Cell Patch Clamp for Electrophysiological Recording from Vomeronasal Sensory Neurons

Corticale netwerken worden gecontroleerd door een kleine, maar gevarieerde set van remmende interneuronen. Functioneel onderzoek van interneuronen vereist daarom gerichte opname en strenge identificatie. Hier beschreven is een gecombineerde aanpak met whole-cell opnames van enkele of synaptically gekoppelde paren van neuronen met intracellulaire etikettering, post-hoc-morfologische en immunocytochemische analyse.

Whole-cell patch-clamp opnamen van Morphologically- en neurochemisch-geïdentificeerde hippocampus Interneurons

Dit protocol beschrijft elementaire procedurele stappen voor het uitvoeren van whole-cell patch-clamp opnames. Deze techniek maakt het onderzoek mogelijk van het elektrisch gedrag van neuronen, en wanneer uitgevoerd in hersencoupes, kan worden nagegaan of verschillende neuronale functies van neuronen die nog geïntegreerd in goed behouden hersenen circuits.

Whole-cell patch-clamp opnamen in Brain Slices

Hier presenteren we een protocol voor de beoordeling van de functionele synaptic multipliciteit geheel-cel patch klem electrofysiologie met acute hersenen segmenten.

Evaluatie van Synaptic multipliciteit met behulp van geheel-cel Patch-clamp electrofysiologie

Hier beschrijven we een procedure voor het genereren van donker aangepaste plakjes van de muis netvlies voor elektrofysiologische opnames.

Patch Clamp Opnamen van Mouse Retinal Neuronen in een donker aangepaste Slice Voorbereiding

Leer de hele-cel patch-klem techniek toe te passen op hersenschijven met kisspeptine-neuronen. Deze elektrofysiologische methode biedt inzicht in neuronale activiteit en draagt bij aan vooruitgang in de neuroendocrinologie.

Hypothalamische kisspeptine-neuronen als doelwit voor patchklem-opnames met hele cellen

Meer video's verkennen