Schaalbare transfectie van maïs mesophyl protoplasten
23 juni 2023
Hier presenteren we een high-throughput protocol om miljoenen maïsprotoplasten tijdelijk te transfecteren voor het testen van grote bibliotheken van plasmiden in maïsmesofylcellen.
Hello.Today laten we je een protocol zien dat miljoenen maïsmesofylcellen protoplasteert en ze met hoge efficiëntie transformeert. De belangrijkste stappen van het protocol zijn eerst het verteren en verwijderen van de celwand van de plant, het vrijgeven van de protoplasten en vervolgens het transformeren van de protoplast met behulp van PEG. Het grote verschil tussen dit protocol en andere is de schaal van transformatie.
De meeste protocollen eindigen met tussen de 1.000 en 10.000 getransformeerde protoplasten. Ons protocol geeft echter miljoenen getransformeerde maïsprotoplasten. Hier hebben we maïszaailingen die negen tot 11 dagen na het ontkiemen in het donker worden gekweekt.
Knip de zaailingen net boven het grondniveau en plaats ze in water. Houd de planten in het donker wanneer ze niet in gebruik zijn. Selecteer de tweede en derde bladeren van elke zaailing en zorg ervoor dat bladeren met bruine of beschadigde gebieden worden uitgesloten.
Selecteer 12 tot 16 bladeren en snijd een centimeter van de uiteinden af. Snijd vervolgens een sectie van 10 centimeter van elk blad. Stapel bladsecties op elkaar met de basale uiteinden tegen elkaar.
Klem de bundel aan het basale uiteinde aan elkaar met behulp van een bindclip. Leg de bundel bladeren op een stuk wit papier. Snijd bladplakken die 0,5 tot een millimeter breed zijn.
Het is belangrijk om dunne consistente plakjes te snijden. Nadat u een deel van de bladbundel hebt gesneden, brengt u de plakjes over in de enzymoplossing. Laat het materiaal niet uitdrogen.
Draai de enzymoplossing voorzichtig rond om het materiaal nat te maken. Plaats folie over het bekerglas om licht te blokkeren. Herhaal dit proces totdat de hele bundel dicht bij de binderclip is gesneden.
Na het snijden moet de oplossing er als volgt uitzien. Breng het bekerglas enzymoplossing over in een stolp. Vacuüm infiltreer gedurende drie minuten bij kamertemperatuur.
Incubeer op een tafelblad shaker bij 40 RPM bij kamertemperatuur gedurende twee en een half uur. Geef de oplossing na incubatie een werveling. Het moet er melkachtig uitzien, wat wijst op een succesvolle spijsvertering.
Incubeer op de tafelblad shaker bij 80 RPM bij kamertemperatuur voor nog eens 10 minuten. Plaats het bekerglas met enzymoplossing op ijs. Stop de spijsvertering door één volume ijskoude MMG toe te voegen.
Filtreer door een celzeef van 40 micron in een centrifugebuis van 50 milliliter. Splits de oplossing in aliquots van niet meer dan 10 milliliter per stuk. Giet in gekoelde glazen buizen met ronde bodem.
Centrifugeer de buisjes gedurende vier minuten op 100 G. Verwijder het supernatant en zorg ervoor dat de pellet niet wordt verstoord. Opnieuw suspenderen en vervolgens monsters poolen voor volgende wasbeurten.
Was protoplasten twee keer met vijf milliliter MMG. Draai elke keer drie minuten op 100 G. De pellet moet een mooie, felgele groene kleur hebben.
Je kunt de pellet resuspenderen door de buis voorzichtig rond te draaien. Resuspendie in één milliliter MMG en verdun een kleine aliquot 10 tot 20x voor het tellen. Het is belangrijk om goed te resuspenderen voordat je gaat aliqouten, omdat de protoplasten snel zullen bezinken.
Laad de verdunde protoplasten in de hemocytometer. Tel de protoplasten onder een lichtmicroscoop. Een goede voorbereiding zal niet veel overtollig vuil hebben dat ronddrijft na het wassen.
Goede protoplasten zijn cirkelvormig met zichtbare plastiden. Gebruik het aantal cellen om het totale aantal te berekenen. Deze voorbereiding resulteerde in iets meer dan 10 miljoen protoplasten.
We raden aan om de levensvatbaarheid te controleren met fluoresceïnediacetaatkleurstof. Succesvolle protoplastisolaties leveren de levensvatbaarheid tussen 70 en 90% Meng de protoplasten met uw plasmide van belang. Dit voorbeeld gebruikt 1 miljoen protoplasten en 15 microgram DNA.
Incubeer gedurende 30 minuten op ijs. Resuspendeer door op de zijkant van de buis te tikken. Voeg PEG-oplossing toe om een eindconcentratie van 12% PEG te bereiken.
Meng voorzichtig door meerdere keren om te keren. Protoplasten en PEG-oplossing zijn kwetsbaar, dus schud de buis niet. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
Verdun met vijf volumes incubatieoplossing en meng voorzichtig door inversie. Centrifugeer de buisjes gedurende vier minuten op 100 G. Was één keer met één milliliter incubatiebuffer.
Pas op dat u de pellet niet verstoort. Draai drie minuten op 100 G. Resuspendie in incubatiebuffer tot een concentratie van 500 tot 1000 cellen per microliter.
Incubeer in het donker een nacht bij kamertemperatuur. Draai de volgende dag vier minuten op 100 G. Was twee keer met gekoelde incubatieoplossing.
Draai elke keer drie minuten op 100 G bij kamertemperatuur. Resuspenseer opnieuw en laad vervolgens een kleine aliquot op de hemocytometer voor de laatste controle. Tel eerst het totale aantal protoplasten onder brightfield.
Observeer nu de fractie van protoplasten die fluoresceren onder UV om transfectie te verifiëren. De protoplasten drukken onze GFP-verslaggever uit. Laten we nu enkele statistieken krijgen over transfectie-efficiëntie.
In deze voorbereiding verkregen we in totaal 10 miljoen protoplasten, waarvan we er 1 miljoen transfecteerden. De volgende dag hebben we er 335.000 teruggevonden. Daarvan hadden we een transformatiesnelheid van 30,3% Dit laat ons achter met ons totaal van ongeveer 100.000 protoplasten die GFP uitdrukken.
De transfectie-efficiëntie kan variëren. Zoals u in de grafiek kunt zien, zien we routinematig efficiënties tussen 20 en 50% bij herhaalde voorbereidingen. Dit protocol maakt het mogelijk om miljoenen maïs mesophyll protoplasten te verzamelen en te verwerken.
Een van de beste onderdelen van het protocol is de mogelijkheid om op te schalen. Door zowel de hoeveelheid volume als het aantal protoplasten dat bij transformatie wordt gebruikt te schalen, kunt u uw transformatie met meer dan een orde van grootte verhogen ten opzichte van wat we vandaag hebben laten zien. Tot op heden begon ons grootste experiment met één buis met 20 miljoen protoplasten en 200 microgram DNA en eindigde de volgende dag met 3,1 miljoen getransformeerde protoplasten.
Dit protocol met hoge doorvoer is vooral handig wanneer u veel verschillende plasmideconstructies moet testen, maar medewerkers hebben dit protocol gebruikt voor doeleinden waarvoor niet de mogelijkheid nodig is om op te schalen, zoals het ontwerpen van synthetische gencircuits en maïs. Bedankt voor het bekijken van onze video. We hopen dat het heeft geholpen.
Overzicht
Deze studie presenteert een hoog-doorvoer protocol voor het tijdelijk transfecteren van miljoenen maïs mesofyl protoplasten, wat de uitdaging aangaat van het testen van grote plasmidebibliotheken in plantencellen. De methode verbetert de transformatie-efficiëntie aanzienlijk in vergelijking met traditionele protocollen, waardoor schaalbare toepassingen in moleculaire biologie mogelijk worden.
Belangrijke studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Plantenbiotechnologie
- Celbiologie
- Genetische transformatie
Achtergrond
- Maïs protoplasten dienen als model voor het bestuderen van genetische transformatie in planten.
- Traditionele methoden leveren slechts duizenden getransformeerde cellen op, wat de schaalbaarheid van experimenten beperkt.
- Dit protocol biedt een oplossing om het aantal succesvol getransformeerde protoplasten te verhogen.
Gebruikte methoden
- Hoog-doorvoer transformatie met behulp van polyethyleenglycol (PEG).
- Maïs mesofyl protoplasten worden gegenereerd door enzymatische vertering van celwanden.
- Cellevensvatbaarheid en transformatie-efficiëntiemetingen beoordeeld met behulp van microscopie.
Belangrijkste resultaten
- Transformatie van meer dan 3,1 miljoen protoplasten bereikt in geschaalde experimenten.
- Transfectiepercentages tussen 20% en 50% gedemonstreerd in meerdere proeven.
- Mogelijkheid tot testen van meerdere plasmideconstructies voor geavanceerd genetisch onderzoek.
Conclusies
- Dit protocol toont een robuuste methode voor het verbeteren van genetische transformatie in maïs.
- De schaalbaarheid is van aanzienlijk belang voor verschillende toepassingen in plantenonderzoek en synthetische biologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Scalable transfection of maize mesophyll protoplasts enables high-throughput functional genomics and synthetic biology in a key crop species. This protocol supports genome-scale screening and rapid construct validation, directly impacting early discovery and target validation in plant biotechnology pipelines. The ability to process millions of protoplasts per experiment enhances predictive confidence and accelerates portfolio triage for trait engineering and pathway elucidation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene function and regulatory elements at scale in maize cells.
- Supports biological de-risking by allowing rapid assessment of construct activity and viability.
- Facilitates functional target validation through transient expression and reporter assays.
- Improves predictive confidence for downstream trait development decisions.
Screening & Assay Development
- Prepares large, uniform populations of protoplasts for quantitative screening workflows.
- Standardizes transfection efficiency and viability metrics for reproducible assay development.
- Enables high-throughput testing of plasmid libraries and synthetic gene circuits.
- Supports scalable, platform-ready workflows for compound or construct evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker discovery by enabling multiplexed reporter assays.
- Provides continuity from early construct validation to preclinical trait assessment in maize.
- Reduces biological risk by supporting robust, quantitative functional genomics in a crop-relevant system.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery, lead identification, and preclinical trait validation in plant R&D pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through scalable, quantitative transfection.
- Screening: Delivers reproducible, high-throughput assay readiness for construct and library evaluation.
- Analytics: Provides quantitative readouts of transfection efficiency and gene expression for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by enabling functional testing in a disease-relevant crop system.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, scalable platform for diverse genetic and synthetic biology applications in maize.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene function studies.
- Operational Value: Standardizes and scales protoplast transfection for reproducible, high-throughput workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency in trait and construct development.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of genetic targets and synthetic circuits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant cell biology and protoplast handling.
- Needs access to enzymatic digestion, PEG transfection reagents, and fluorescence microscopy.
- Demands cross-team standardization of viability and transfection efficiency metrics.
- Adaptation to other plant species may require protocol optimization.
- Protoplast viability and transformation rates can vary between preparations and must be monitored.
