Name: Evaluatie van autofagieniveaus in twee verschillende pancreascelmodellen met behulp van LC3-immunofluorescentie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-28T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Leer LC3-immunofluorescentie om autofagieniveaus in pancreascellen te meten met behulp van koude methanolfixatie. Deze methode kwantificeert LC3-puncta en toont verhoogde autofagische activiteit onder gemcitabinebehandeling aan.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Universiteit van Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), de Nationale Raad voor Wetenschappelijk Onderzoek en Technologie (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; en PUE 22920170100033) en het Nationaal Agentschap voor Wetenschappelijke en Technologische Promotie (PICT 2019-01664).

1. Celvoorbereiding
<ol><li>Week 12 mm ronde coverslips in absolute ethanol en plaats ze verticaal in de putjes van een plaat met 24 putten.</li>
	<li>Verwijder het deksel en stel de multi-well plaat gedurende 15 minuten bloot aan ultraviolette straling.</li>
	<li>Plaats de coverslips horizontaal en was ze met Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).</li>
	<li>Zaai een laag doorgangsaantal pancreascellen. Het bedrag moet worden aangepast om 50% -75% confluentie te verkrijgen op de dag van fixatie16. OPMERKING: Het wordt aanbevolen om 2,5 × 10 4 PANC-1 of 4 × 104 AR42J-cellen per put te zaaien om de cellen na 3 dagen te fixeren.</li>
	<li>Kweek de cellen in DMEM met 10% foetaal runderserum, 100 U/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine in een couveuse bij 37 °C onder een bevochtigde atmosfeer met 5% koolstofdioxide (CO2). OPMERKING: Voor PANC-1-cellen wordt aanbevolen om de cellen gedurende 2 dagen tussen het zaaien van de cel en de volgende stappen te incuberen. Na deze tijd kunnen de cellen worden getransfecteerd, behandeld of gefixeerd. Dit protocol illustreert de behandeling met gemcitabine in niet-getransfecteerde PANC-1-cellen en de differentiatie- en PP242-behandeling voor niet-getransfecteerde AR42J-cellen.</li>
</ol>2. Behandeling van de cellen
<ol><li>Gemcitabine behandeling voor PANC-1 cellen<ol><li>Bereid een oplossing van 1 μg/μL gemcitabine in DMEM 2 dagen na het zaaien. Behandel elk putje met 2,6 μL van de 1 μg/μL gemcitabine oplossing om een uiteindelijke verdunning van 20 μM te verkrijgen.</li>
		<li>Incubeer de cellen gedurende 24 uur in de incubator.</li>
	</ol></li>
	<li>AR42J-differentiatie en PP242-behandeling<ol><li>Bereid een oplossing van 4 μg/ml dexamethason in DMEM.</li>
		<li>Behandel elk putje met 4,9 μL 4 μg/ml dexamethasonoplossing om een uiteindelijke verdunning van 100 nM te verkrijgen.</li>
		<li>Incubeer de cellen gedurende 48 uur in de incubator.</li>
		<li>Verwijder het medium en behandel elk putje met 0,5 μL van 1 mM PP242 om een uiteindelijke verdunning van 1 μM te verkrijgen.</li>
		<li>Incubeer de cellen gedurende 2 uur in de incubator.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Fixeren en permeabiliseren van de cellen
<ol><li>Bereid een 24-well plaat met koude methanol en een 6-well plaat met koude fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4, 2mM KH2PO4). Houd ze op ijs.</li>
	<li>Neem elke coverslip met een pincet, was deze twee keer in PBS en incubeer gedurende 6 minuten in methanol.</li>
</ol>4. De cellen blokkeren
<ol><li>Was elke coverslip tweemaal in PBS en incubeer gedurende 1 uur in 10% foetaal runderserum in PBS (blokkeringsoplossing). OPMERKING: In deze stap wordt het protocol mogelijk gepauzeerd. De coverslips kunnen 's nachts in de koelkast in de blokkeeroplossing worden bewaard en het protocol kan de volgende dag worden voortgezet.</li>
</ol>5. De coverslips incuberen met het primaire antilichaam
<ol><li>Bereid een 1:1.000 oplossing van anti-LC3 in de blokkerende oplossing en houd deze op ijs.</li>
	<li>Plaats een stuk laboratoriumafdichtingsfolie over het deksel met meerdere putten.</li>
	<li>Plaats één druppel (25 μL) per afdekplaat anti-LC3-oplossing over de afdichtingsfilm.</li>
	<li>Neem elke coverslip met een pincet en plaats deze over de primaire antilichaamdruppel, zorg ervoor dat de celzijde in contact is met de oplossing.</li>
	<li>Bereid een vochtige kamer voor door een vochtig stuk papier in een plastic doos met platte bodem te plaatsen.</li>
	<li>Plaats de multi-well plaat in de vochtigheidskamer, bedek deze met folie en incubeer een nacht in de koelkast.</li>
</ol>6. De coverslips incuberen met het secundaire antilichaam
<ol><li>Verwijder de multi-well plaat uit de vochtigheidskamer en plaats de coverslips terug in de multi-well plaat.</li>
	<li>Voer drie wasbeurten uit met PBS.</li>
	<li>Bereid een oplossing van fluorescerend gelabeld anti-konijn met een verdunning van 1:800 in de blokkerende oplossing en houd deze op ijs beschermd tegen licht.</li>
	<li>Plaats een afdichtfoliestuk over het meerpotige deksel.</li>
	<li>Plaats een druppel (25 μL) per dekslip van anti-konijnenoplossing over de afdichtingsfolie.</li>
	<li>Neem elke coverslip met een pincet en plaats deze over de primaire antilichaamdruppel, zorg ervoor dat de celzijde in contact is met de oplossing.</li>
	<li>Incubeer de multi-well plaat in de vochtigheidskamer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (RT) beschermd tegen licht.</li>
</ol>7. Kleuring van de cellen met 4′, 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI)
<ol><li>Verwijder de multi-well plaat uit de vochtigheidskamer en plaats de coverslips terug in de multi-well plaat.</li>
	<li>Voer drie wasbeurten uit met PBS.</li>
	<li>Bereid een 300 nM-oplossing van DAPI in PBS (beschermd tegen licht).</li>
	<li>Incubeer elke coverslip met de DAPI-oplossing gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Voer drie wasbeurten uit met PBS. Behoud de multi-well plaat beschermd tegen licht.</li>
</ol>8. Montage
<ol><li>Maak twee bekers klaar met water en een stuk papier.</li>
	<li>Plaats één druppel (10 μL) per coverslip van een polyvinylalcohol-Bis(trimethylaluminum)-1,4-diazabicyclo[2.2.2]octaanadductoplossing (PVA-DABCO) op een dia. OPMERKING: PVA-DABCO wordt bereid door 0,25 M DABCO, 10% W/V PVA, 20% glycerol en 50% Tris HCl (1,5 M, pH 8,8) te combineren in ultrapuur water.</li>
	<li>Neem elke dekslip met een pincet, was het in elk waterbekerglas, droog het af in het papier en plaats het over de PVA-DABCO-druppel (met de cellen in contact met de oplossing).</li>
	<li>Laat het een nacht drogen, beschermd tegen licht.</li>
</ol>9. Confocale microscopie bekijken en beelden vastleggen
<ol><li>Visualiseer de coverslips in een omgekeerde confocale microscoop met een objectief van ongeveer 63x17.</li>
	<li>Leg representatieve afbeeldingen van de gelabelde cellen vast.</li>
</ol>10. Kwantificeren van de LC3-stippen
<ol><li>Sleep elk afbeeldingsbestand met de vastgelegde kanalen, zoals ".czi", naar het ImageJ (FIJI) -scherm om te openen. Klik op OK in het dialoogvenster en sluit het consolevenster.</li>
	<li>Selecteer op het tabblad Afbeelding de optie Kleur > Gesplitste kanalen.</li>
	<li>Sluit de afbeeldingen die overeenkomen met de andere kanalen dan de LC3-afbeelding.</li>
	<li>Selecteer op het tabblad Afbeelding de optie > kleurbalans aanpassen</li>
	<li>Verplaats de schuifregelaar Maximum naar links totdat de afbeelding verzadigd is om de celcontouren te visualiseren.</li>
	<li>Teken de celomtrek met het gereedschap Selectie uit de vrije hand .</li>
	<li>Klik op de knop Reset om de kleuraanpassing opnieuw in te stellen.</li>
	<li>Selecteer op het tabblad Bewerken de optie Knippen om het geselecteerde item te knippen.</li>
	<li>Sluit de afbeelding zonder deze op te slaan.</li>
	<li>Selecteer op het tabblad Bewerken de optie Plakken.</li>
	<li>Kies in het menu Analyseren het gereedschap 3D-objectenteller.</li>
	<li>Stel de drempel in. In het voorbeeld van deze studie is de drempel vastgesteld op 2.000.</li>
	<li>Stel het groottefilter in. In deze studie ligt het tussen de 50 en 500.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de vakken Objecten en Samenvatting zijn gemarkeerd.</li>
	<li>Klik op Ok. Het aantal punten wordt beschreven als objecten gedetecteerd in de samenvatting.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65005/65005fig01.jpg"> Figuur 1: Schematisch diagram van het LC3 immunofluorescentieprotocol. Schematisch diagram dat het algemene protocol voor LC3-immunofluorescentie weergeeft. Figuur gemaakt met BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65005/65005fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<ol><li>Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+steps+in+mammalian+autophagosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146(2018).</li>
<li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+definitions+of+autophagy+and+related+processes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular definitions of autophagy and related processes.</a> EMBO Journal. 36 (13), 1811-1836 (2017).</li>
<li>Kitada, M., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+metabolic+disease+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Autophagy in metabolic disease and ageing.</a> Nature Reviews Endocrinology. 17 (11), 647-661 (2021).</li>
<li>Ktistakis, N. T., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digesting+the+expanding+mechanisms+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Digesting the expanding mechanisms of autophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (8), 624-635 (2016).</li>
<li>Tanida, I., Ueno, T., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC3+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">LC3 and autophagy.</a> Methods in Molecular Biology. 445, 77-88 (2008).</li>
<li>Kabeya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC3%2C+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p%2C+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).</li>
<li>Mizushima, N., Yoshimori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+interpret+LC3+immunoblotting%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">How to interpret LC3 immunoblotting.</a> Autophagy. 3 (6), 542-545 (2007).</li>
<li>Vanasco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+and+VMP1-related+selective+mitophagy+in+experimental+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics and VMP1-related selective mitophagy in experimental acute pancreatitis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 640094(2021).</li>
<li>Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+mechanisms+in+pancreas+and+salivary+acini%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Regulatory mechanisms in pancreas and salivary acini.</a> Annual Review of Physiology. 46, 361-375 (1984).</li>
<li>Mizrahi, J. D., Surana, R., Valle, J. W., Shroff, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cancer.</a> Lancet. 395 (10242), 2008-2020 (2020).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+function+of+autophagy+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Regulation and function of autophagy in pancreatic cancer.</a> Autophagy. 17 (11), 3275-3296 (2021).</li>
<li>Ropolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+E2F1-EP300-VMP1+pathway+mediates+gemcitabine-induced+autophagy+in+pancreatic+cancer+cells+carrying+oncogenic+KRAS%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">A novel E2F1-EP300-VMP1 pathway mediates gemcitabine-induced autophagy in pancreatic cancer cells carrying oncogenic KRAS.</a> Frontiers in Endocrinology. 11, 411(2020).</li>
<li>Pardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gemcitabine+induces+the+VMP1-mediated+autophagy+pathway+to+promote+apoptotic+death+in+human+pancreatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreatology%22%5BJournal%5D)">Gemcitabine induces the VMP1-mediated autophagy pathway to promote apoptotic death in human pancreatic cancer cells.</a> Pancreatology. 10 (1), 19-26 (2010).</li>
<li>Logsdon, C. D., Moessner, J., Williams, J. A., Goldfine, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+increase+amylase+mRNA+levels%2C+secretory+organelles%2C+and+secretion+in+pancreatic+acinar+AR42J+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids increase amylase mRNA levels, secretory organelles, and secretion in pancreatic acinar AR42J cells.</a> Journal of Cell Biology. 100 (4), 1200-1208 (1985).</li>
<li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+%284th+edition%29%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition).</a> Autophagy. 17 (1), 1(2021).</li>
<li>Segeritz, C. -P., Vallier, L. Chapter 9 - Cell culture: Growing cells as model systems in vitro. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSegeritz%2C+C-P+%22Basic+Science+Methods+for+Clinical+Researchers%22">Basic Science Methods for Clinical Researchers</a>. Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. , Academic Press. Cambridge, MA. 151-172 (2017).</li>
<li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy%3A+Principles+and+modern+practices%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68(2020).</li>
<li>Grasso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+novel+selective+autophagy+pathway+mediated+by+VMP1-USP9x-p62%2C+prevents+pancreatic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 8308-8324 (2011).</li>
<li>Ropolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pancreatitis-induced+vacuole+membrane+protein+1+triggers+autophagy+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (51), 37124-37133 (2007).</li>
<li>Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+early+autophagy+events%3A+Omegasomes+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of early autophagy events: Omegasomes and beyond.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50484(2013).</li>
<li>Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC3%2C+an+autophagosome+marker%2C+can+be+incorporated+into+protein+aggregates+independent+of+autophagy%3A+caution+in+the+interpretation+of+LC3+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization.</a> Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).</li>
<li>Zhang, Z., Singh, R., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+detection+of+autophagy+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Methods for the detection of autophagy in mammalian cells.</a> Current Protocols in Toxicology. 69, 1-26 (2016).</li>
<li>Yoshii, S. R., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+and+measuring+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Monitoring and measuring autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1865(2017).</li>
<li>Betriu, N., Andreeva, A., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erlotinib+promotes+ligand-induced+EGFR+degradation+in+3D+but+not+2D+cultures+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Erlotinib promotes ligand-induced EGFR degradation in 3D but not 2D cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma cells.</a> Cancers. 13 (18), 4504(2021).</li>
<li>Wang, W., Dong, L., Zhao, B., Lu, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+is+downregulated+by+microenvironmental+changes+in+pancreatic+cancer+and+induces+EMT%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">E-cadherin is downregulated by microenvironmental changes in pancreatic cancer and induces EMT.</a> Oncology Reports. 40 (3), 1641-1649 (2018).</li>
<li>Kim, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity+and+plasticity+of+cancer+cell+migration+in+a+pancreatic+tumor+three-dimensional+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model.</a> Cancers. 12 (5), 1305(2020).</li>
<li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+EpCAM+over-expression+is+associated+with+favorable+clinical+outcomes+in+pancreatic+cancer+patients+with+Hepatitis+B+virus+negative+infection%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic EpCAM over-expression is associated with favorable clinical outcomes in pancreatic cancer patients with Hepatitis B virus negative infection.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (12), 22204-22216 (2015).</li>
<li>Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fixation+protocols+for+adherent+cultured+cells+applied+to+a+GFP+fusion+protein+of+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor.</a> Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).</li>
</ol>

Er werden geen belangenconflicten verklaard.

De methode die in dit protocol wordt beschreven, maakt het mogelijk om de endogene LC3-verdeling in de cel te visualiseren en de autofagische niveaus onder verschillende omstandigheden te kwantificeren. Een andere vergelijkbare methode die wordt gebruikt om de LC3-verdeling te analyseren en autofagie-activering te bepalen, omvat fluorescentie-gelabelde LC3-transfectie (zoals RFP-LC3)19. RFP-LC3-transfectie heeft de voordelen dat er geen fixatie nodig is (waardoor deze methode kan worden toegepast ...

Macroautofagie (gewoonlijk autofagie genoemd) is een gespecialiseerd katabolisch proces dat selectief cytoplasmatische componenten afbreekt, waaronder eiwitten en beschadigde organellen 1,2. Autofagie stelt cellen in staat om fysiologisch te reageren op stressprikkels en zo cellulaire homeostase3 te behouden. Tijdens autofagie wordt een dubbel membraanblaasje gevormd: het autofagosoom. Het autofagosoom bevat de ladingmoleculen en drijft ze naar het lysosoom voor afbraak 1,4.
Autofagosomen worden versierd door het autofagische eiwit microtubule-geassocieerde eiwit lichtketen 3 (LC3)5. Wanneer autofagie niet wordt geïnduceerd, wordt LC3 diffuus in het cytoplasma en de kern in de LC3-I-conformatie. Aan de andere kant, wanneer autofagie wordt geïnduceerd, wordt LC3 geconjugeerd met een fosfatidylethanolamine in het membraan van de autofagische structuren6. Deze nieuwe LC3-conformatie staat bekend als LC3-II1. De LC3-conformatieverschuiving veroorzaakt veranderingen in de cellulaire lokalisatie en de migratie van dodecylnatriumsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE), die kan worden gedetecteerd door technieken zoals immunofluorescentie en western blot 5,7. Op deze manier is LC3-conjugatie een belangrijke gebeurtenis in het autofagische proces die kan worden gebruikt om autofagische activiteit te meten.
De pancreasacinaire cel is een sterk gedifferentieerde cel die, onder gezonde omstandigheden, een lage mate van autofagie heeft. In verschillende fysiologische omstandigheden of onder farmacologische stimulatie kunnen ze echter autofagie activeren. Daarom is de bepaling van autofagische niveaus in deze cellijn nuttig voor het bestuderen van de potentiële directe of indirecte effecten van verschillende farmacologische of biologische agentia op autofagie 8,9.
Ductaal adenocarcinoom van de alvleesklier is een van de dodelijkste vormen van kanker, gezien de late diagnose en de hoge chemotherapieresistentie10. Alvleesklierkankercellen hebben een hoge autofagie-activiteit als gevolg van de transcriptionele upregulatie en posttranslationele activering van autofagie-gerelateerde eiwitten11. Alvleesklierkankercellen kunnen hun autofagieniveaus aanpassen als reactie op ongunstige omstandigheden zoals hypoxie, tekort aan voedingsstoffen of door chemotherapie veroorzaakte schade11. Daarom kan het analyseren van de autofagieniveaus in alvleesklierkankercellen helpen begrijpen hoe ze zich aanpassen aan verschillende omgevingen en de effectiviteit van autofagiemodulerende behandelingen evalueren.
Deze studie toont een methode om LC3-immunofluorescentie uit te voeren in twee verschillende pancreascellulaire modellen. Het eerste model, PANC-1-cellen, diende als model voor ductaal adenocarcinoom van de alvleesklier. Deze cellen werden behandeld met gemcitabine, een chemotherapeuticum waarvan eerder is aangetoond dat het autofagie induceert, met name in alvleesklierkankercellen die het oncogene Kirsten rat sarcoma virus-gen (KRAS)12,13 dragen. Het tweede model, AR42J-cellen, diende als een meer fysiologisch model van exocriene pancreascellen. Deze cellen werden gedifferentieerd met dexamethason om meer op acinaire pancreascellen te gaan lijken14. In deze cellen werd autofagie farmacologisch geïnduceerd door het gebruik van PP242, een krachtige mTOR-remmer15. In deze studie tonen we de toepasbaarheid aan van het protocol beschreven met twee verschillende pancreasmodellen en het vermogen om onderscheid te maken tussen toestanden van lage en hoge autofagie.

<table><tbody><tr><td>10x Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>12 mm ronde dekglasjes</td><td>HDA</td><td>CBR_OBJ_6467</td><td></td></tr><tr><td>24 Wel- Cel Cultuur Plaat</td><td>Sorfa</td><td>220300</td><td></td></tr><tr><td>Absoluut ethanol</td><td>Biopack</td><td>2207.10.00</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Ezel anti-konijn IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>R37119</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Laser Scanning Microscoop</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>DMEN</td><td>Sartorius</td><td>01-052-1A</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal Runderserum</td><td>NATOCOR </td><td>Lintc-634</td><td></td></tr><tr><td>Gemcitabina</td><td>Eli Lilly</td><td>VL7502</td><td></td></tr><tr><td>LC3B (D11) XP Konijn mAb</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3868S</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Anedra</td><td>6197</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm "M" (Laboratorium Afdichtingsfolie)</td><td>Bemis/Curwood</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep Oplossing</td><td>Sartorius</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>PP242</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-301606</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine EDTA</td><td>Gibco</td><td>11570626</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluatie van autofagieniveaus in twee verschillende pancreascelmodellen met behulp van lc3-immunofluorescentie

Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence

Autofagie is een gespecialiseerd katabolisch proces dat selectief cytoplasmatische componenten afbreekt, waaronder eiwitten en beschadigde organellen. Autofagie stelt cellen in staat om fysiologisch te reageren op stressprikkels en zo cellulaire homeostase te behouden. Kankercellen kunnen hun autofagieniveaus moduleren om zich aan te passen aan ongunstige omstandigheden zoals hypoxie, tekort aan voedingsstoffen of schade veroorzaakt door chemotherapie. Ductaal adenocarcinoom van de alvleesklier is een van de dodelijkste vormen van kanker. Alvleesklierkankercellen hebben een hoge autofagie-activiteit als gevolg van de transcriptionele upregulatie en posttranslationele activering van autofagie-eiwitten.
Hier werd de PANC-1-cellijn gebruikt als een model van menselijke kankercellen van de alvleesklier en de AR42J pancreas-acinaire cellijn werd gebruikt als een fysiologisch model van sterk gedifferentieerde zoogdiercellen. Deze studie gebruikte de immunofluorescentie van microtubule-geassocieerde eiwit lichtketen 3 (LC3) als een indicator van de status van autofagie-activering. LC3 is een autofagie-eiwit dat in basale omstandigheden een diffuus distributiepatroon vertoont in het cytoplasma (bekend als LC3-I in deze aandoening). Autofagie-inductie activeert de conjugatie van LC3 tot fosfatidylethanolamine op het oppervlak van nieuw gevormde autofagosomen om LC3-II te vormen, een membraangebonden eiwit dat helpt bij de vorming en uitbreiding van autofagosomen. Om het aantal gelabelde autofagische structuren te kwantificeren, werd de open-source software FIJI gebruikt met behulp van de "3D Objects Counter" -tool.
De meting van de autofagische niveaus, zowel in fysiologische omstandigheden als in kankercellen, stelt ons in staat om de modulatie van autofagie te bestuderen onder verschillende omstandigheden zoals hypoxie, chemotherapiebehandeling of de knockdown van bepaalde eiwitten.

Dit protocol voert immunofluorescentie van LC3 uit in pancreascellijnen om de autofagieniveaus in verschillende omstandigheden te bepalen. Het resultaat van dit experiment was de obtentie van cellulaire beelden van de rode en blauwe kanalen, overeenkomend met LC3 en DAPI. De LC3-beelden geven de cellulaire verdeling van dit eiwit aan, terwijl de DAPI de nucleaire lokalisatie toont. Figuur 2A toont een representatief beeld van de immunofluorescentie van LC3 en de samensmelting met DAPI-kleuri...

Het doel van dit protocol is om autofagische niveaus in alvleesklierkanker en pancreasacinaire cellen te bepalen door middel van LC3-immunofluorescentie en LC3-puntkwantificering.

Evaluatie van autofagieniveaus in twee verschillende pancreascelmodellen met behulp van LC3-immunofluorescentie

Autophagy is a specialized catabolic process that selectively degrades cytoplasmic components, including proteins and damaged organelles. Autophagy allows ...

De LC3-immunofluorescentie maakt de bepaling van autofagieniveaus in pancreascellen mogelijk. Het maakt de studie mogelijk van de potentiële effecten van verschillende middelen op pancreascelautofagie. Immunofluorescentie is een techniek die wordt gebruikt om endogene LC3-eiwitten te detecteren, die problemen vermijdt die worden veroorzaakt door overexpressie van LC3, zoals het vormen van eiwitaggregaten die geen verband houden met autofagie.Felipe Renna, promovendus, en Malena Herrera Lopez, promovendus uit het laboratorium van Maria Ines Vaccaro, zullen de procedure demonstreren. Om de celvoorbereiding te starten, weekt u 12 millimeter ronde afdekslips in absolute ethanol. Nadat u de hoes hebt verwijderd, plaatst u de doorweekte afdekplaat verticaal in de 24-putplaat.Stel de multi-well plaat gedurende 15 minuten bloot aan ultraviolette straling. Plaats vervolgens de afdekslip horizontaal en was deze met DMEM. Zie nu het lage doorgangsaantal pancreascellen, opnieuw gesuspendeerd in DMEM, met 10% FBS, penicilline en streptomycine, en incuber de cellen gedurende twee dagen.Bereid twee dagen na het zaaien van de cel gemcitabine-oplossing in DMEM met één microgram per microliterconcentratie. Zuig vervolgens de helft van het volume van elke put in een aparte buis en voeg de juiste hoeveelheid gemcitabine-oplossing toe. Breng het halve volume dat overeenkomt met elke put terug in de behandelde putten en incuber de cellen gedurende 24 uur.Voeg voor het fixeren en permeabiliseren van de cellen koude methanol toe aan een 24-putplaat met cellen. Maak ook een bord met zes putten met koude PBS. Neem met behulp van een spuitnaald en een pincet elke dekstrook en was deze twee keer in PBS.Incubeer vervolgens gedurende zes minuten in methanol. Na twee keer wassen met PBS, incubeer je de afdekslip gedurende een uur in een blokkerende oplossing. Voeg een anti LC3 toe in de blokkerende oplossing in een verhouding van één tot 1000 en onderhoud op ijs.Plaats een stuk laboratoriumafdichtingsfolie over het deksel met meerdere putten en voeg 25 microliter anti-LC3-oplossing per afdeklaag over de afdichtingsfolie toe. Plaats met behulp van een spuitnaald en een pincet elke afdekslip over de primaire antilichaamdruppel en zorg ervoor dat de celzijde in contact is met de oplossing. Plaats de multi-well plaat in de vochtigheidskamer.Bedek het met folie en incubeer een nacht in de koelkast. Verwijder de volgende dag de multi-well plaat uit de vochtigheidskamer. Plaats de afdekplaten terug op de multi-well plaat en was ze drie keer met PBS.Verdun fluorescerend gelabeld anti-konijn in een blokkerende oplossing in een verhouding van één tot 800 en blijf op ijs in het donker. Voeg na het afdichten van het meerputtige deksel 25 microliter anti-konijnoplossing per afdeklaag toe aan de afdichtingsfolie. En behandel de dekslip met een secundair antilichaam zoals eerder aangetoond.Incubeer de plaat vervolgens gedurende twee uur in de vochtigheidskamer bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie met antilichaam, was de afdekslip op de multi-well plaat met PBS drie keer. Incubeer elke afdekplaat met de voorbereide DAPI-oplossing gedurende 10 minuten.Eenmaal gewassen met PBS, onderhoudt u de multi-well plaat in het donker. Bereid voor celmontage twee bekers voor met water en een stuk papier. Voeg 10 microliter PVA-DABCO-oplossing per afdeklaag toe aan een dia.Was de afdeklaag in water en droog deze vervolgens op papier. Plaats het ten slotte over de PVA-DABCO-druppel. En 's nachts droog in het donker.De volgende dag visualiseert u met behulp van een omgekeerde confocale microscoop de gelabelde cellen en legt u de beelden vast. Nadat u afbeeldingen hebt vastgelegd, sleept u elk afbeeldingsbestand met de vastgelegde kanalen in het Fiji-scherm. Klik in het dialoogvenster op OK om de afbeelding te openen.Sluit vervolgens het geopende consolevenster. Selecteer op het tabblad Afbeelding de optie Kleur en vervolgens Kanalen splitsen. Sluit de afbeelding die overeenkomt met de andere kanalen dan de LC3-afbeelding.Selecteer vervolgens op het tabblad Afbeelding de optie Aanpassen, gevolgd door Kleurbalans. Verplaats de maximale schuifregelaar naar links totdat de afbeelding verzadigd is om de celcontouren te visualiseren. Gebruik het selectiegereedschap uit de vrije hand om de celomtrek te tekenen en klik op Opnieuw instellen om de kleuren aan te passen.Als u het geselecteerde item van het tabblad Bewerken wilt knippen, selecteert u Knippen en sluit u de afbeelding zonder deze op te slaan. En selecteer op het tabblad Bewerken de optie plakken. Kies in het menu Analyseren het gereedschap 3D-objectenteller.Stel de drempel in op 2000 en het groottefilter op 50 tot 500. Zorg ervoor dat de objecten en samenvattingsvakken zijn gemarkeerd en klik op OK.In het logboekvenster, het aantal stippen wordt beschreven als gedetecteerde objecten. De immunofluorescentie gaf de cellulaire verdeling van LC3-eiwit aan, terwijl de DAPI nucleaire lokalisatie in pancreascellen vertoonde.De LC3-stippen namen significant toe onder behandeling met gemcitabine, wat wijst op autofagische activiteit. Onder een overmatige samenvloeiing hebben de exocriene alvleeskliercellen de neiging zich op te stapelen en op elkaar te groeien. De paraformaldehydecelfixatiemethode was niet effectief voor het behoud van LC3-eiwitten, omdat deze geen nauwkeurige verdeling weerspiegelde.Wanneer fixatie of behandeling werd uitgevoerd zonder twee dagen na het zaaien te wachten, hadden de PANC1-cellen een ronde vorm. Deze morfologie verminderde de relatie tussen het cytoplasma en de kern, waardoor het moeilijk werd om de intracellulaire verdeling van LC3 te begrijpen. Onvolledige methanolfixatie kan de juiste LC3-immunolabeling verstoren, wat leidt tot onduidelijke beelden en suboptimale kwantificering.Het belangrijkste om te onthouden tijdens deze procedure is dat de cellen gedurende zes minuten in koude methanol moeten worden gefixeerd, in plaats van paraformaldehyde. Volgens deze procedure kan colokalisatie tussen LC3 en andere eiwitten worden geanalyseerd, waardoor de studie van verschillende moleculaire routes gerelateerd aan LC3-functies mogelijk is.

evaluating-autophagy-levels-two-different-pancreatic-cell-models

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Autofagie is een alomtegenwoordige proces waarmee cellen om eiwitten en organellen degraderen en te recyclen. We passen geavanceerde fluorescentie microscopie te visualiseren en kwantificeren van de kleine, maar essentiële, fysieke veranderingen geassocieerd met de inductie van autofagie, waaronder de vorming en verspreiding van autofagosomen en lysosomen, en hun fusie in autolysosomes.

Kwantitatieve analyse van Autophagy met Advanced 3D Fluorescentiemicroscopie

Time-lapse microscopie van fluorescent gelabelde autofagie markers zorgt voor de opvolging van de dynamische autofagie respons met een hoge temporele resolutie. Met specifieke autofagie en organel markers in een combinatie van 3 verschillende kleuren, kunnen we de bijdrage van een eiwit autophagosome vorming in een robuuste ruimtelijke en temporele context volgen.

Live cell imaging van Vroege Autophagy Evenementen: Omegasomes en Beyond

Hier, multispectrale beeldvormende flowcytometrie met een analytische functie die heldere detailafbeeldingen van 3 autofagie markers vergelijkt en kwantificeert hun co-lokalisatie, samen met LC3 spot counting, werd gebruikt om autofagie op objectieve, kwantitatieve en statistisch robuuste wijze te meten.

Autofagische Flux beoordelen door LC3-, P62- en LAMP1-co-lokalisatie met behulp van Multispectrale Imaging Flow Cytometry

Gepresenteerd hier zijn twee antilichaam gebaseerde eiwit-eiwit interactie onderzoekstechnieken: immunofluorescentie en immunoprecipitation. Deze technieken zijn geschikt voor de studie van de fysieke interacties tussen eiwitten voor de ontdekking van nieuwe onderdelen van cellulaire signaalroutes en begrip eiwit dynamiek.<br...

Studie van eiwit-eiwitinteractie in Autophagy onderzoek

Actieve autofagie is geassocieerd met productieve spierregeneratie, die essentieel is voor het activeren van spierstamcellen (MuSC). Hier bieden we een protocol voor de in situ detectie van LC3, een autofagie marker in MyoD-positieve MuSCs van spierweefsel secties van controle en gewonde muizen.

In situ Immunofluorescente Staining of Autophagy in Spier Stamcellen

Mitophagy, het proces van clearing beschadigd de mitochondriën, is noodzakelijk voor mitochondriale homeostase en gezondheid onderhoud. Dit artikel presenteert een aantal van de meest recente mitophagy detectiemethoden in menselijke cellen, Caenorhabditis elegansen muizen.

In Vitro en In Vivo opsporing van Mitophagy in menselijke cellen, C. Elegansen muizen

Hier presenteren we een protocol voor geoptimaliseerde on-section correlatieve licht-elektronenmicroscopie op basis van endogene, fluorescerende labeling als een hulpmiddel om de lokalisatie van zeldzame eiwitten in relatie tot cellulaire ultrastructuur te onderzoeken. De kracht van deze aanpak wordt aangetoond door ultrastructurele lokalisatie van endogene LC3 in uitgehongerde cellen zonder behandeling met Bafilomycine.

Ultrastructurele lokalisatie van endogene LC3 door middel van on-section correlatieve licht-elektronenmicroscopie

Dit protocol schetst twee methoden voor de kwantitatieve analyse van mitofagie in pancreas-β-cellen: ten eerste een combinatie van celdoorlatende mitochondriën-specifieke kleurstoffen en ten tweede een genetisch gecodeerde mitofagie-reporter. Deze twee technieken vullen elkaar aan en kunnen worden ingezet op basis van specifieke behoeften, waardoor flexibiliteit en precisie mogelijk zijn bij het kwantitatief aanpakken van mitochondriale kwaliteitscontrole.

Complementaire benaderingen om mitofagieflux in pancreas-β-cellen te ondervragen

Hier presenteren we de methodologie voor het beknopt beoordelen van autofagosoommarker LC3-II-niveaus in extracellulaire vesikels (EV's) door middel van immunoblotting. Analyse voor LC3-II-niveaus in EV's, autolysosoomvorming en omegasoomvorming suggereert de nieuwe rol van STX6 bij de afgifte van LC3-II-positieve EV's wanneer autofagosoom-lysosoomfusie wordt geremd.

Evaluatie van LC3-II-afgifte via extracellulaire blaasjes in relatie tot de accumulatie van intracellulaire LC3-positieve blaasjes

Multifoton microscopie maakt de controle van een lage energetische fotonen met diepe penetratie optische en minder fototoxiciteit. We beschrijven het gebruik van deze technologie voor live cell etikettering in zebravis embryo's. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor foto-inductie van diverse licht-responsieve moleculen.

Twee-foton-Based Fotoactivatie in de Live zebravis embryo&#39;s

Leer LC3-immunofluorescentie om autofagieniveaus in pancreascellen te meten met behulp van koude methanolfixatie. Deze methode kwantificeert LC3-puncta en toont verhoogde autofagische activiteit onder gemcitabinebehandeling aan.

Evaluatie van autofagieniveaus in twee verschillende pancreascelmodellen met behulp van LC3-immunofluorescentie

Meer video's verkennen