Evaluatie van autofagieniveaus in twee verschillende pancreascelmodellen met behulp van LC3-immunofluorescentie

De LC3-immunofluorescentie maakt de bepaling van autofagieniveaus in pancreascellen mogelijk. Het maakt de studie mogelijk van de potentiële effecten van verschillende middelen op pancreascelautofagie. Immunofluorescentie is een techniek die wordt gebruikt om endogene LC3-eiwitten te detecteren, die problemen vermijdt die worden veroorzaakt door overexpressie van LC3, zoals het vormen van eiwitaggregaten die geen verband houden met autofagie.

Felipe Renna, promovendus, en Malena Herrera Lopez, promovendus uit het laboratorium van Maria Ines Vaccaro, zullen de procedure demonstreren. Om de celvoorbereiding te starten, weekt u 12 millimeter ronde afdekslips in absolute ethanol. Nadat u de hoes hebt verwijderd, plaatst u de doorweekte afdekplaat verticaal in de 24-putplaat.

Stel de multi-well plaat gedurende 15 minuten bloot aan ultraviolette straling. Plaats vervolgens de afdekslip horizontaal en was deze met DMEM. Zie nu het lage doorgangsaantal pancreascellen, opnieuw gesuspendeerd in DMEM, met 10% FBS, penicilline en streptomycine, en incuber de cellen gedurende twee dagen.

Bereid twee dagen na het zaaien van de cel gemcitabine-oplossing in DMEM met één microgram per microliterconcentratie. Zuig vervolgens de helft van het volume van elke put in een aparte buis en voeg de juiste hoeveelheid gemcitabine-oplossing toe. Breng het halve volume dat overeenkomt met elke put terug in de behandelde putten en incuber de cellen gedurende 24 uur.

Voeg voor het fixeren en permeabiliseren van de cellen koude methanol toe aan een 24-putplaat met cellen. Maak ook een bord met zes putten met koude PBS. Neem met behulp van een spuitnaald en een pincet elke dekstrook en was deze twee keer in PBS.

Incubeer vervolgens gedurende zes minuten in methanol. Na twee keer wassen met PBS, incubeer je de afdekslip gedurende een uur in een blokkerende oplossing. Voeg een anti LC3 toe in de blokkerende oplossing in een verhouding van één tot 1000 en onderhoud op ijs.

Plaats een stuk laboratoriumafdichtingsfolie over het deksel met meerdere putten en voeg 25 microliter anti-LC3-oplossing per afdeklaag over de afdichtingsfolie toe. Plaats met behulp van een spuitnaald en een pincet elke afdekslip over de primaire antilichaamdruppel en zorg ervoor dat de celzijde in contact is met de oplossing. Plaats de multi-well plaat in de vochtigheidskamer.

Bedek het met folie en incubeer een nacht in de koelkast. Verwijder de volgende dag de multi-well plaat uit de vochtigheidskamer. Plaats de afdekplaten terug op de multi-well plaat en was ze drie keer met PBS.

Verdun fluorescerend gelabeld anti-konijn in een blokkerende oplossing in een verhouding van één tot 800 en blijf op ijs in het donker. Voeg na het afdichten van het meerputtige deksel 25 microliter anti-konijnoplossing per afdeklaag toe aan de afdichtingsfolie. En behandel de dekslip met een secundair antilichaam zoals eerder aangetoond.

Incubeer de plaat vervolgens gedurende twee uur in de vochtigheidskamer bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie met antilichaam, was de afdekslip op de multi-well plaat met PBS drie keer. Incubeer elke afdekplaat met de voorbereide DAPI-oplossing gedurende 10 minuten.

Eenmaal gewassen met PBS, onderhoudt u de multi-well plaat in het donker. Bereid voor celmontage twee bekers voor met water en een stuk papier. Voeg 10 microliter PVA-DABCO-oplossing per afdeklaag toe aan een dia.

Was de afdeklaag in water en droog deze vervolgens op papier. Plaats het ten slotte over de PVA-DABCO-druppel. En 's nachts droog in het donker.

De volgende dag visualiseert u met behulp van een omgekeerde confocale microscoop de gelabelde cellen en legt u de beelden vast. Nadat u afbeeldingen hebt vastgelegd, sleept u elk afbeeldingsbestand met de vastgelegde kanalen in het Fiji-scherm. Klik in het dialoogvenster op OK om de afbeelding te openen.

Sluit vervolgens het geopende consolevenster. Selecteer op het tabblad Afbeelding de optie Kleur en vervolgens Kanalen splitsen. Sluit de afbeelding die overeenkomt met de andere kanalen dan de LC3-afbeelding.

Selecteer vervolgens op het tabblad Afbeelding de optie Aanpassen, gevolgd door Kleurbalans. Verplaats de maximale schuifregelaar naar links totdat de afbeelding verzadigd is om de celcontouren te visualiseren. Gebruik het selectiegereedschap uit de vrije hand om de celomtrek te tekenen en klik op Opnieuw instellen om de kleuren aan te passen.

Als u het geselecteerde item van het tabblad Bewerken wilt knippen, selecteert u Knippen en sluit u de afbeelding zonder deze op te slaan. En selecteer op het tabblad Bewerken de optie plakken. Kies in het menu Analyseren het gereedschap 3D-objectenteller.

Stel de drempel in op 2000 en het groottefilter op 50 tot 500. Zorg ervoor dat de objecten en samenvattingsvakken zijn gemarkeerd en klik op OK.In het logboekvenster, het aantal stippen wordt beschreven als gedetecteerde objecten. De immunofluorescentie gaf de cellulaire verdeling van LC3-eiwit aan, terwijl de DAPI nucleaire lokalisatie in pancreascellen vertoonde.

De LC3-stippen namen significant toe onder behandeling met gemcitabine, wat wijst op autofagische activiteit. Onder een overmatige samenvloeiing hebben de exocriene alvleeskliercellen de neiging zich op te stapelen en op elkaar te groeien. De paraformaldehydecelfixatiemethode was niet effectief voor het behoud van LC3-eiwitten, omdat deze geen nauwkeurige verdeling weerspiegelde.

Wanneer fixatie of behandeling werd uitgevoerd zonder twee dagen na het zaaien te wachten, hadden de PANC1-cellen een ronde vorm. Deze morfologie verminderde de relatie tussen het cytoplasma en de kern, waardoor het moeilijk werd om de intracellulaire verdeling van LC3 te begrijpen. Onvolledige methanolfixatie kan de juiste LC3-immunolabeling verstoren, wat leidt tot onduidelijke beelden en suboptimale kwantificering.

Het belangrijkste om te onthouden tijdens deze procedure is dat de cellen gedurende zes minuten in koude methanol moeten worden gefixeerd, in plaats van paraformaldehyde. Volgens deze procedure kan colokalisatie tussen LC3 en andere eiwitten worden geanalyseerd, waardoor de studie van verschillende moleculaire routes gerelateerd aan LC3-functies mogelijk is.