Monitoring Stub1-gemedieerde Pexofagie
12 mei 2023
Dit protocol geeft instructies voor het activeren en monitoren van Stub1-gemedieerde pexofagie in levende cellen.
Peroxisomen voeren bèta-oxidatie uit en zijn gevoelig voor ROS-schade. Deze methode maakt het mogelijk om te onderzoeken hoe cellen omgaan met ROS-gestresste peroxisomen. Dit protocol wordt niet alleen gebruikt om zich wereldwijd te richten op alle peroxisomen binnen een celpopulatie, maar kan ook de manipulatie van de individuele peroxisomen binnen afzonderlijke cellen mogelijk maken.
Kleurstof-geassisteerde ROS-generatie kan ook worden gebruikt om organellen buiten peroxisomen te richten om te onderzoeken hoe cellen omgaan met organelletsels. Om te beginnen, zaai twee keer 10 tot de vijfde menselijke SHSY5Y-cellen of zes keer 10 tot de vierde muis NIH H3T3-cellen in 840 microliter kweekmedium op 35-millimeter kweekschalen met glazen bodem met een glazen microwell met een diameter van 20 millimeter. Kweek de cellen onder 5% koolstofdioxide bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur.
Transfecteer vervolgens de cellen met de gewenste plasmiden met behulp van een transfectiereagens of SHSY5Y-celtransfectie. Verdun plasmiden in 55 microliter serumvrij DMEM/F-12 en verdun één microliter transfectiereagens in 55 microliter serumvrij DMEM/F-12. Combineer het verdunde DNA met het verdunde reagens.
Meng voorzichtig en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg het complex toe aan de 20 millimeter microwell die eerder is bedekt met 100 microliter kweekmedium dat SHSY5Y-cellen zonder antibiotica bevat. Schud de schaal voorzichtig heen en weer.
Voer NIH 3T3-celtransfectie uit zoals eerder aangetoond, maar vervang gereduceerd serummedium in plaats van serumvrije DMEM / F-12 voor plasmideverdunning en transfectiereagens. Verwijder na twee uur transfectie het transfectiereagensbevattende medium en voeg één milliliter vers kweekmedium toe. Incubeer de NIH 3T3- of SHSY5Y-cellen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 24 uur.
Voor lichtgeactiveerde ROS-productie verwijdert u 24 uur na transfectie het kweekmedium en voegt u 10 microliter 200 nanomolair HaloTag TMR-ligand of 200 nanomolair Janelia Fluor 646 HaloTag-ligand toe aan de 20-millimeter glazen microwell. Breng de schaal over naar een 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide-incubator en laat het een uur staan om de cellen te kleuren. Verwijder na een uur het kleurmedium grondig en voeg een milliliter vers kweekmedium toe.
Plaats een schaal met glazen bodem met de gewenste cellen op een laserscanning confocale microscoop uitgerust met een podiumincubator. Klik in de software op Gereedschapsvenster, kies Oculair en klik op de DIA-knop om het doorgelaten licht in te schakelen. Bekijk de schotel door het microscoopoculair en breng de cellen scherp door aan de scherpstelknop te draaien.
Kies LSM en klik op de knop Dye Detector Select. Dubbelklik op de gewenste kleurstoffen in het pop-upvenster om de juiste laser- en filterinstellingen te selecteren voor het afbeelden van de cellen. Klik op Live4x in het Live-paneel om een snelle laserscanning te starten om te beginnen met het screenen op de fluorescerende signalen van de cellen.
Verplaats het podium met behulp van de joystickcontroller en zoek de medium diKillerRed VKSKL- of SLP-VKSKL-expresserende cellen om ROS-spanning op de peroxisomen toe te passen. Verkrijg een afbeelding van de gewenste cel. Klik op Tool Window en kies LSM Stimulation.
Klik vervolgens op de ellipsknop en gebruik in het Live Image-venster de muis om een ROI van 15 micrometer in diameter te tekenen met de gewenste peroxisomen waarop ROS-spanning zal worden toegepast. Om ROS-stress toe te passen, gebruikt u 561 nanometer voor cellen met de diKillerRed VKSKL of TMR-gelabelde SLP-ligand en gebruikt u 640 nanometer voor cellen gekleurd met de Janelia Fluor 646-gelabelde SLP-ligand. Selecteer de lasergolflengte voor het toepassen van de ROS-spanning.
Voer het gewenste laserpercentage en de duur in. Voor ROS-productie in de peroxisomen klikt u op Acquire en vervolgens op de stimulatieknop om het scannen te starten met 561 of 640 nanometer licht door de ROIs gedurende elk 30 seconden. Deze stimulatie komt overeen met ongeveer 5% laservermogensinstellingen voor 561 en 640 nanometer.
Na 30 seconden laserverlichting verliezen peroxisomen binnen de ROIs hun diKillerRed VKSKL-, TMR- of Janelia Fluor 646-signalen. Dit signaalverlies maakt het mogelijk om de verlichte en niet-verlichte peroxisomen in de cel te onderscheiden. Om de pexofagean levende cellen te controleren, volgt u de translocatie van EGFP-gelabelde Stub1, Hsp70, ubiquitine, p62 of LC3B op de verlichte of ROS-belaste peroxisomen door timelapse-beeldvorming met intervallen van 10 minuten tussen frames.
Focale verlichting leidt tot onmiddellijke en gelokaliseerde ROS-productie binnen individuele peroxisomen zoals aangegeven door de fluorescerende reporter roGFP2-VKSKL. De diKillerRed VKSKL-afbeelding werd genomen nadat alle roGFP2-VKSKL-metingen waren gedaan om de locatie van de beschadigde peroxisomen aan te geven. De gegevens tonen ook aan dat niet-geanolumineerde peroxisomen niet worden beïnvloed, wat wijst op de precisie van de methodologie.
Deze methodologie werd gebruikt om Stub1-gemedieerde pexofagie te monitoren. Tijdens dit proces verschijnen Hsp70, Stub1, ubiquitinated proteins, autofagy adapters p62 en LC3B vervolgens in ROS-gestresste peroxisomen om pexofagie aan te drijven. Met dezelfde strategie was het mogelijk om tegelijkertijd alle peroxisomen op een kweekschaal te beschadigen voor de biochemische karakterisering van Stub1-gemedieerde pexofagie.
Vóór LED-verlichting was EGFP-ubiquitinefluorescentie homogeen in het cytoplasma en colokaliseerde het niet met de peroxisomen. Na negen uur LED-verlichting hoopten de EGFP-ubiquitinesignalen zich op op alle peroxisomen in de cellen die in een confocale schaal werden gekweekt. Met behulp van dit protocol ontdekten we dat ROS-gestresste peroxisomen worden verwijderd via een ubiquitine-afhankelijke afbraakroute.
ROS-gestreste peroxisomen rekruteren het ubiquitine E3-ligase Stub1 om hun verwijdering door pexofagie mogelijk te maken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt het mechanisme van Stub1-gemedieerde pexofagie als reactie op ROS-belastte peroxisomen in levende menselijke SHSY5Y en muis NIH 3T3 cellen. De methodologie benadrukt een nieuwe aanpak om pexofagie en de rol van verschillende eiwitten tijdens dit proces te monitoren, waarbij wordt aangetoond dat ROS-belastte peroxisomen op een ubiquitine-afhankelijke manier worden aangemerkt voor degradatie.
Belangrijkste Onderzoekscomponenten
Onderzoeksgebied
- Pexofagie
- Cellulaire respons op oxidatieve stress
- Eiwitdegradatieroutes
Achtergrond
- Peroxisomen zijn organellen die betrokken zijn bij metabole processen, inclusief bèta-oxidatie.
- Ze kunnen worden beschadigd door reactieve zuurstofsoorten (ROS), wat cellulaire reacties vereist.
- Stub1 is een E3 ubiquitine ligase die bekend is als deelnemer aan pexofagie.
Gebruikte Methoden
- Live beeldvormingstechnieken met confocale microscopie
- Menselijke SHSY5Y en muis NIH 3T3 cellen als modelsystemen
- Transfectie en kleurstof-geassisteerde ROS-generatie protocollen
Belangrijkste Resultaten
- Gelocaliseerde ROS-generatie leidt tot de identificatie van belastte peroxisomen.
- Stub1 en andere eiwitten zoals Hsp70, p62 en LC3B transloceren naar ROS-belastte peroxisomen.
- Ubiquitine-afhankelijke degradatieroutes worden bevestigd in het verwijderen van peroxisomen.
Conclusies
- Deze studie demonstreert een nieuwe methodologie voor het monitoren van pexofagie in levende cellen.
- De bevindingen zijn relevant voor het begrijpen van cellulaire responsen op oxidatieve stress en orgaankwaliteitscontrole.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Stub1-mediated pexophagy monitoring enables precise interrogation of peroxisome quality control mechanisms in mammalian cells, directly informing early discovery and target validation for organelle turnover pathways. The ability to induce and track selective peroxisome degradation at both population and single-organelle levels supports predictive confidence in mechanistic de-risking and portfolio triage for oxidative stress-related targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic dissection of peroxisome turnover in response to ROS stress.
- Supports functional validation of Stub1 and associated autophagy modules as therapeutic targets.
- Facilitates biological de-risking by distinguishing specific organelle responses to injury.
- Provides predictive confidence for advancing organelle quality control targets.
Screening & Assay Development
- Establishes validated live-cell imaging assays for quantifying pexophagy events.
- Enables reproducible, quantitative measurement of protein translocation and ubiquitin accumulation.
- Supports assay standardization for screening modulators of peroxisome degradation.
- Permits scalable manipulation of peroxisomes for robust compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models of oxidative stress and organelle dysfunction.
- Enables continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of autophagy pathways.
- Supports risk-adjusted advancement of candidates targeting peroxisome quality control.
- Provides translational biomarker opportunities via live-cell imaging readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This methodology integrates from early discovery through lead identification, supporting hypothesis testing, pathway clarification, and quantitative analytics for organelle turnover mechanisms.
- Discovery Biology: Enables targeted ROS induction and mechanistic validation of pexophagy regulators.
- Screening: Provides reproducible, quantitative live-cell imaging outputs for assay development.
- Analytics: Delivers time-resolved measurements of protein recruitment and peroxisome degradation.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to disease-relevant oxidative stress models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for interrogating organelle quality control across cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in organelle turnover research.
- Operational Value: Standardizes live-cell imaging and ROS induction protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for autophagy and quality control targets, enhancing capital efficiency.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates modulating peroxisome degradation pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and confocal microscopy.
- Demands access to laser scanning confocal systems and dye-assisted ROS generation reagents.
- Necessitates cross-team standardization of imaging and quantification protocols.
- Adaptable to multiple mammalian cell models with appropriate transfection optimization.
- Precision of ROS induction must be validated to avoid off-target organelle effects.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:51
Preparation of Cells Expressing DiKillerRed or Self‐Labeling Proteins (SLPs) in the Peroxisome Lumen
2:52
Staining Peroxisomes with Dye‐Labeled SLP Ligands
3:39
ROS‐Stressing of Peroxisomes on a Laser‐Scanning Confocal Microscope
6:25
Results: Light‐Activated ROS Production and Stub1‐Mediated Pexophagy
7:50
Conclusion
