Name: Monitoring Stub1-gemedieerde Pexofagie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Leer hoe Stub1-gemedieerde pexofagie wordt gemonitord in menselijke SHSY5Y- en muizen NIH 3T3-cellen met behulp van live imaging en confocale microscopie. Deze methode onthult ubiquitin-afhankelijke degradatie van ROS-gestresseerde peroxisomen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een MOST 111-2311-B-001-019-MY3 onderzoeksbeurs van de National Science and Technology Council in Taiwan.

1. Bereiding van cellen die diKillerRed of zelflabelende eiwitten (SLPs) tot expressie brengen in het peroxisoomlumen
<ol><li>Zaai de gewenste cellen op celkweekschalen met glazen bodem. Voor het experiment hier, zaad 2 x 105 menselijke SHSY5Y-cellen in 840 μL kweekmedium (DMEM / F-12 aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline / streptomycine) of 6 x 104 muis NIH3T3-cellen in 840 μL kweekmedium (DMEM aangevuld met 10% runderserum en 1% penicilline / streptomycine) op een 35 mm kweekschaal met een glazen microwell met een diameter van 20 mm. OPMERKING: Het aantal gezaaide cellen moet proportioneel worden aangepast aan het glazen microwell-gebied bij gebruik van glazen bodemschalen met andere specificaties.</li>
	<li>Kweek de cellen onder 5% CO2/37 °C gedurende 24 uur.</li>
	<li>Transfecteer de cellen met de gewenste plasmiden met behulp van een transfectiereagens.<ol><li>Gebruik PMP34-TagBFP om de peroxisomen in levende cellen te labelen. Gebruik peroxisoom-targeting diKillerRed-VKSKL of SLP-VKSKL (+ kleurstof-gelabelde SLP-liganden) voor ROS-generatie in het peroxisoomlumen (door lichtgeactiveerde ROS-productie). In dit protocol gebruiken we het zelflabelende eiwit HaloTag-VKSKL21. Om de translocatie van Stub1/Hsp70, de accumulatie van ubiquitinated eiwitten en de vorming van autofagosomen op ROS-gestresste peroxisomen te monitoren, transfecteren EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-Ub of EGFP-LC3B, respectievelijk. Om de ROS-generatie in het peroxisomale lumen te controleren, co-transfecteert diKillerRed-VKSKL met de peroxisoom-gelokaliseerde fluorescerende redoxsonde roGFP2-VKSKL22.</li>
		<li>Voor SHSY5Y-celtransfectie verdunt u plasmiden in 55 μl serumvrij DMEM/F-12 en verdunt u 1 μl transfectiereagens in 55 μl serumvrije DMEM/F12. Combineer het verdunde DNA met het verdunde reagens. Meng voorzichtig en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Voeg het complex toe aan de 20 mm microwell die eerder is bekleed met 100 μL kweekmedium voor SHSY5Y zonder antibiotica (DMEM/F-12 met 10% foetaal runderserum). Schud de schaal voorzichtig heen en weer.</li>
		<li>Vervang voor NIH3T3-celtransfectie gereduceerd serummedium voor het serumvrije DMEM/F-12 voor het verdunnen van de plasmiden en het transfectiereagens. Vervang het platingkweekmedium door SHSY5Y door kweekmedium voor NIH3T3-cellen zonder antibiotica (DMEM met 10% runderserum).</li>
	</ol></li>
	<li>Verwijder na 2 uur transfectie het transfectiereagensbevattende medium en voeg 1 ml vers kweekmedium toe. Incubeer de NIH3T3- of SHSY5Y-cellen bij 37°C en 5% CO2 gedurende 24 uur. OPMERKING: Andere cellijnen kunnen ook worden gebruikt om Stub1-gemedieerde pexofagie (bijv. HeLa-cellen) te bestuderen.</li>
</ol>2. Kleuring peroxisomen met kleurstof-gelabelde SLP liganden (voor licht-geactiveerde ROS productie)
<ol><li>Verwijder 24 uur na de transfectie het kweekmedium en voeg 100 μL 200 nM HaloTag TMR-ligand of 200 nM Janelia Fluor 646 HaloTag-ligand toe aan de 20 mm glazen microwell. OPMERKING: De met kleurstof gelabelde SLP-liganden moeten worden verdund met het respectieve kweekmedium voor elke cellijn. Het kiezen van Janelia Fluor 646-gelabelde liganden zal de blauwe, groene en rode kanalen vrijmaken voor downstream fluorescentiebeeldvorming.</li>
	<li>Breng de schaal over in een 37°C, 5% CO2 incubator. Vlek gedurende 1 uur. Verwijder na 1 uur het kleurmedium grondig en voeg 1 ml vers kweekmedium toe.</li>
</ol>3. ROS-spanning van peroxisomen op een laser-scanning confocale microscoop
<ol><li>Plaats een schaal met glazen bodem met de gewenste cellen op een laserscannende confocale microscoop die is uitgerust met een podiumincubator.</li>
	<li>Klik op Gereedschapsvenster, kies Oculair en klik op de DIA-knop (Figuur 2A) om het doorgelaten licht in te schakelen. Bekijk de schotel door het microscoopoculair en breng de cellen scherp door aan de scherpstelknop te draaien.</li>
	<li>Kies LSM en klik op de knop Kleurstof & Detector selecteren (figuur 2B). Dubbelklik op de gewenste kleurstoffen in het pop-upvenster om de juiste laser- en filterinstellingen te selecteren voor het afbeelden van de cellen (figuur 2C). Klik op Livex4 in het Live-paneel om een snelle laserscanning te starten om te beginnen met het screenen op de fluorescentiesignalen van de cellen (figuur 2D).</li>
	<li>Verplaats het podium met behulp van de joystickcontroller en zoek de medium diKillerRed-VKSKL- of SLP-VKSKL-expresserende cellen om ROS-spanning (op de peroxisomen) toe te passen. Verkrijg een afbeelding van de gewenste cel.</li>
	<li>Klik op Gereedschapsvenster en kies LSM-stimulatie (figuur 2E). Klik op de ellipsknop en gebruik in het live beeldvenster de muis om een cirkelvormige ROI van 15 μm in diameter (figuur 2F) te tekenen met de gewenste peroxisomen die in stap 3.4 zijn verkregen en waarop ROS-spanning wordt toegepast (zie figuur 3 voor een voorbeeld).</li>
	<li>Om ROS-stress toe te passen, gebruikt u 561 nm voor cellen met de diKillerRed-PTS1- of TMR-gelabelde SLP-ligand en gebruikt u 640 nm voor cellen die zijn gekleurd met de Janelia Fluor 646-gelabelde SLP-ligand.</li>
	<li>Selecteer de lasergolflengte voor het toepassen van de ROS-spanning. Voer het gewenste laserpercentage en de duur in (figuur 2G).</li>
	<li>Klik op Acquire en klik op de stimulatieknop (figuur 2H) om het scannen met 561/640 nm-licht door de ROI's voor elk 30 s te starten. Dit komt overeen met een laservermogensinstelling van ~5% voor zowel 561 nm als 640 nm op de confocale microscoop die hier wordt gebruikt. Deze bewerking zal leiden tot ROS-productie in de peroxisomen. OPMERKING: Men kan ROI's van verschillende groottes selecteren. Men moet de verlichtingstijd voor elke ROI proportioneel aanpassen aan het gebied.</li>
	<li>Na 30 s laserverlichting hebben peroxisomen binnen de ROIs hun diKillerRed-PTS1/TMR/Janelia Fluor 646-signalen verloren. Dit signaalverlies maakt het mogelijk om de verlichte van de niet-verlichte peroxisomen (beschadigd versus gezond) in een cel te onderscheiden.</li>
</ol>4. Monitoring van pexofagie in levende cellen door time-lapse beeldvorming
<ol><li>Volg de translocatie van EGFP-gelabelde Stub1, Hsp70, Ub, p62 of LC3B op de verlichte/ROS-gespannen peroxisomen door time-lapse beeldvorming met intervallen van 10 minuten tussen frames (zie bijvoorbeeld figuren 3-7). OPMERKING: EGFP-Stub1- of EGFP-Hsp70-signalen beginnen 10-20 minuten na de verlichting te verschijnen en blijven op alle beschadigde peroxisomen tot ~ 40 minuten na de verlichting. De EGFP-Ub-signalen verschijnen 30 minuten na de verlichting en duren 2-3 uur. EGFP-p62-translocatie verschijnt 60 minuten na verlichting en EGFP-LC3B-signalen worden zichtbaar ~ 3 uur na verlichting.</li>
	<li>Kwantificeer de EGFP-signalen op de beschadigde peroxisomen (van Stub1, Ub, p62 of LC3B) met behulp van ImageJ. Voer de volgende stappen uit voor het gebruik van ImageJ om een driekanaals image te kwantificeren (PMP34-TagBFP/EGFP-LC3B/HaloTag-VKSKL).<ol><li>Open de afbeelding en pas elliptische selecties of selecties uit de vrije hand toe om het gebied met alle verlichte peroxisomen (PMP34-TagBFP-signaalpositief en HaloTag-ligandsignaal gebleekt) te omsluiten; Figuur 8A).</li>
		<li>Klik op Dupliceren om het PMP34-TagBFP-kanaal uit te kiezen (Figuur 8A). Stel een drempel in met behulp van het vervolgkeuzemenu Afbeelding > Pas > drempel aan om de peroxisomen te markeren (afbeelding 8B).</li>
		<li>Selecteer Analyseren > Deeltjes analyseren om de exacte gebieden van de verlichte peroxisomen te bepalen. ImageJ registreert deze interessegebieden (ROI's) in de ROI-manager (Figuur 8C).</li>
		<li>Klik op Dupliceren om het EGFP-kanaal uit te kiezen voor het analyseren van het fluorescentiesignaal van EGFP-geconjugeerd Ub, p62 of LC3B (figuur 8D). Selecteer alle ROI's in de ROI Manager (Figuur 8E).</li>
		<li>Pas Measure toe in de ROI Manager om de EGFP-signalen op de peroxisomen te meten (Figuur 8E). Zoek de waarde van het gebied en de geïntegreerde dichtheid (de som van alle pixelintensiteiten) voor elke ROI in de resultatentabel (figuur 8E).</li>
		<li>Om de gemiddelde EGFP-fluorescentie-intensiteiten op verschillende tijdstippen na verlichting te verkrijgen, deelt u de geïntegreerde EGFP-intensiteit door het totale oppervlak van verlichte peroxisomen (PMP34-TagBFP-signaalpositieve en HaloTag-ligandsignaalnegatieve gebieden). Om het geaccumuleerde signaal op de peroxisomen te verkrijgen, trekt u de gemiddelde intensiteit op een tijdstip af van de gemiddelde intensiteit op tijd = 0 en normaliseert u vervolgens met de gemiddelde intensiteit op tijd = 0.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Wereldwijd beschadigen van alle peroxisomen (in elke cel) op een kweekschaal
<ol><li>Voer stap 1 (voorbereiding van cellen die peroxisoomgerichte diKillerRed [diKillerRed-VKSKL] of SLP [SLP-VKSKL]) en stap 2 (kleuring van peroxisomen met de SLP-ligand [voor lichtgeactiveerde ROS-productie] uitvoeren).</li>
	<li>Verwijder na 1 uur TMR-gelabelde ligandkleuring het kleurmedium en voeg 1 ml kweekmedium toe met 30 mM 3-AT (3-amino-1,2,4-triazool; een katalaseremmer). OPMERKING: Catalase is een ROS-aaseter uitgedrukt in het peroxisoomlumen, dus 3-AT-behandeling helpt de door licht opgewekte oxidatieve schade aan de peroxisomen te vergroten.</li>
	<li>Plaats de kweekschaal boven een LED (555-570 nm). Verlicht alle cellen met een vermogensdichtheid van 1,8 W/cm2 gedurende 9 uur in een incubator. OPMERKING: Om deze stap buiten een incubator uit te voeren, plaatst u de kweekschaal op een verwarmingsplaat van 37 °C. Voeg 20 mM HEPES toe aan het 3-AT-bevattende medium en bedek de kweekschaal met een transparante film om gasuitwisseling te minimaliseren. HEPES is een buffermiddel dat de fysiologische pH in celkweek buiten een CO 2-incubator handhaaft tijdens LED-verlichting.</li>
	<li>Valideer het succes van LED-opgewekte schade door de EGFP-Ub-, EGFP-p62- of EGFP-LC3B-signalen op de peroxisomen af te beelden. Met behulp van de hierboven beschreven verlichtingsconditie vertoonde 82% van de SHSY5Y-cellen die stabiel HaloTag-VKSKL tot expressie brachten Stub1-gemedieerde pexofagie.</li>
	<li>Oogst de cellen voor downstream biochemische analyse.</li>
</ol>

<ol><li>Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+interplay+between+peroxisomes+and+other+subcellular+organelles+including+mitochondria+and+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83(2016).</li>
<li>He, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetyl-CoA+derived+from+hepatic+peroxisomal+%CE%B2-oxidation+inhibits+autophagy+and+promotes+steatosis+via+mTORC1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal β-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation.</a> Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).</li>
<li>Cipolla, C. M., Lodhi, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomal+dysfunction+in+age-related+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Peroxisomal dysfunction in age-related diseases.</a> Trends in Endocrinology & Metabolism. 28 (4), 297-308 (2017).</li>
<li>Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. Aging, age-related diseases and peroxisomes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFransen%2C+M+%22Peroxisomes+and+their+Key+Role+in+Cellular+Signaling+and+Metabolism%22">Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism</a>. 69, Springer. Dordrecht, the Netherlands. 45-65 (2013).</li>
<li>Puri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasma+lipidomic+signature+of+nonalcoholic+steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis.</a> Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).</li>
<li>Law, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+peroxisomal+AAA+ATPase+complex+prevents+pexophagy+and+development+of+peroxisome+biogenesis+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders.</a> Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).</li>
<li>Nazarko, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pexophagy+is+responsible+for+65%25+of+cases+of+peroxisome+biogenesis+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders.</a> Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).</li>
<li>Eberhart, T., Kovacs, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pexophagy+in+yeast+and+mammals%3A+An+update+on+mysteries%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries.</a> Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).</li>
<li>Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farré, J. -C., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+and+physiological+role+of+pexophagy%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism and physiological role of pexophagy.</a> FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).</li>
<li>Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pexophagy%3A+The+selective+degradation+of+peroxisomes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 512721(2012).</li>
<li>Germain, K., Kim, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pexophagy%3A+A+model+for+selective+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pexophagy: A model for selective autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578(2020).</li>
<li>Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+signals+autophagic+degradation+of+cytosolic+proteins+and+peroxisomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).</li>
<li>Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane+peroxin+PEX3+induces+peroxisome-ubiquitination-linked+pexophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy.</a> Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).</li>
<li>Nordgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Export-deficient+monoubiquitinated+PEX5+triggers+peroxisome+removal+in+SV40+large+T+antigen-transformed+mouse+embryonic+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts.</a> Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATM+functions+at+the+peroxisome+to+induce+pexophagy+in+response+to+ROS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS.</a> Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).</li>
<li>Chen, B. -H., Chang, Y. -J., Lin, S., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsc70%2FStub1+promotes+the+removal+of+individual+oxidatively+stressed+peroxisomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes.</a> Nature Communications. 11 (1), 5267(2020).</li>
<li>Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+controlled+induction+of+autophagy-mediated+lysosome+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover.</a> Nature Communications. 4, 2111(2013).</li>
<li>Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cryo-electron+tomography+workflow+reveals+protrusion-mediated+shedding+on+injured+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane.</a> Science Advances. 7 (13), eabc6345(2021).</li>
<li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+controlled+initiation+of+parkin-mediated+mitophagy+within+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells.</a> Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).</li>
<li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bit-by-bit+autophagic+removal+of+parkin-labelled+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria.</a> Nature Communications. 4, 2428(2013).</li>
<li>Los, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HaloTag%3A+A+novel+protein+labeling+technology+for+cell+imaging+and+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis.</a> ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).</li>
<li>Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+monitoring+of+subcellular+redox+dynamics+in+living+mammalian+cells+using+RoGFP2-based+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).</li>
<li>Nordgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+limitations+in+the+use+of+KillerRed+for+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

Dit protocol beschrijft hoe Stub1-gemedieerde pexofagie in celculturen kan worden geactiveerd door peroxisomale ROS-niveaus met licht te verhogen. Omdat het protocol afhankelijk is van kleurstof-geassisteerde ROS-generatie, moet men zorgen voor voldoende expressie van diKillerRed-VKSKL of kleurstof-gelabelde SLP-ligandkleuring in de cellen van belang. Gezien het feit dat verschillende celtypen of cellen met verschillende genetische achtergronden peroxisomen met enigszins verschillende eigenschappen kunnen bevatten, moet ...

Peroxisomen zijn enkelmembraangebonden organellen die aanwezig zijn in de meeste eukaryote cellen. Peroxisomen zijn een metabolisch compartiment dat essentieel is voor het uitvoeren van de bèta-oxidatie van vetzuren met een zeer lange keten, purinekatabolisme en etherfosfolipide- en galzuursynthese1. Peroxisoom-afgeleid acetyl-CoA regelt lipidehomeostase door de centrale signalering in metabolisme2 te reguleren. Daarom is het geen verrassing dat gecompromitteerde peroxisomale functies worden geïmpliceerd in verschillende ziekten, waaronder neurodegeneratieve aandoeningen, veroudering, kanker, obesitas en diabetes 3,4,5. Een essentieel proces bij het handhaven van peroxisomale werking is pexofagie. Pexofagie is een katabolisch proces voor de selectieve omzetting van peroxisomen door autofagie. Cellen gebruiken pexofagie om de kwantiteit en kwaliteit van peroxisomen te helpen beheersen, waardoor een goede peroxisomale functie wordt gegarandeerd. Een recente studie toonde aan dat peroxisoomverlies veroorzaakt door mutaties in PEX1 peroxisomale biogenese factoren 1 en 6 het gevolg is van ongecontroleerde pexofagie6. Met name 65% van alle patiënten met peroxisoombiogenesestoornis (PBD) heeft tekortkomingen in het peroxisomale AAA ATPase-complex, bestaande uit PEX1, PEX6 en PEX26 in zoogdiercellen7.
Een aantal methoden kan worden gebruikt om pexofagie te initiëren en te bestuderen. In gist wordt pexofagie geactiveerd wanneer de geleverde voedingsstoffen worden overgeschakeld van peroxisoomafhankelijke koolstofbronnen naar peroxisoomonafhankelijke koolstofbronnen (naar lagere cellulaire peroxisoomaantallen)8. De overdracht van methanol-gekweekte Pichia pastoris-cellen van methanolmedium naar glucosemedium en ethanolmedium induceert bijvoorbeeld micropexofagie en macropexofagie, respectievelijk 8,9,10. Micropexofagie-sequesters clusterden peroxisomen voor afbraak door de vacuole te hermodelleren om cup-achtige vacuolaire sekwestratiemembranen en een dekselachtige structuur te vormen die het micropexofagie-specifieke membraanapparaat (MIPA) wordt genoemd. Bij macropexofagie worden individuele peroxisomen overspoeld door dubbelmembraanstructuren die bekend staan als pexofagosomen, gevolgd door fusie met de vacuole voor afbraak 8,9,10. De fosforylering van pexofagiereceptoren, zoals Atg36p in Saccharomyces cerevisiae en Atg30p in Pichia pastoris, is van cruciaal belang voor de receptoren om kernautofagiemachines te rekruteren en om peroxisomale targeting op autofagosomen 8,11 te vergemakkelijken.
In zoogdiercellen kan pexofagie worden geïnduceerd door ubiquitinatie. Het labelen van de peroxisomale membraaneiwitten PMP34 of PEX3 met ubiquitine aan de cytosolische kant induceert pexofagie12. De overexpressie van PEX3 induceert peroxisoom ubiquitinatie en peroxisoom eliminatie door lysosomen13. Bovendien schaadt de fusie van PEX5 met een C-terminale EGFP de export van monoubiquitinated PEX5 en resulteert in pexofagie14. Aan de andere kant kan pexofagie ook worden veroorzaakt door H 2 O2-behandeling. Peroxisomen produceren reactieve zuurstofsoorten (ROS); specifiek produceert het peroxisomale enzym Acox1, dat de eerste stap van bèta-oxidatie van zeer lange keten vetzuren (> 22 koolstof) katalyseert, niet alleen acetyl-CoA, maar ook peroxisomale ROS. Als reactie op de verhoogde ROS-niveaus onder H 2 O2-behandelingactiveren zoogdiercellen pexofagie om de ROS-productie te verlagen en stress te verlichten. Er is gemeld dat H 2 O2-behandelingde rekrutering van ataxie-teleangiëctasieën gemuteerd (ATM) naar peroxisomen stimuleert. ATM fosforyleert vervolgens PEX5 om de peroxisomale omzet te bevorderen door pexofagie15.
Omdat peroxisomen ROS-genererende centra zijn, zijn ze ook gevoelig voor ROS-schade. ROS-uitgelokte peroxisomale letsels dwingen cellen om pexofagie te activeren om peroxisoomkwaliteitscontroleroutes te initiëren (verwijdering van het beschadigde peroxisoom door autofagie). Hier schetsen we een aanpak voor het on-demand triggeren van ROS-uitgelokt peroxisomale schade. Het protocol maakt gebruik van lichtgeactiveerde ROS-productie binnen organellen 16,17,18,19,20 (figuur 1). Peroxisomen met kleurstoflabel worden verlicht, wat leidt tot ROS-productie in het peroxisomale lumen, wat specifiek peroxisomale schade veroorzaakt. Met behulp van dit protocol wordt aangetoond dat ROS-gestresste peroxisomen worden verwijderd via een ubiquitine-afhankelijke afbraakroute. ROS-gestreste peroxisomen rekruteren het ubiquitine E3-ligase Stub1 om hun overspoeling in autofagosomen mogelijk te maken voor individuele verwijdering door pexofagie16. Men kan dit protocol gebruiken om het lot van gewonde en gezonde peroxisomen in dezelfde cel te vergelijken door middel van time-lapse microscopie. De methode kan ook worden gebruikt om alle peroxisomen (in alle cellen) op een kweekschaal globaal te beschadigen, waardoor de biochemische analyse van de pexofagieroute mogelijk is.

<table><tbody><tr><td>35 mm kweekschaal met een glas microputje met een diameter van 20 mm&nbsp;</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>20 mm glazen bodem</td></tr><tr><td>3-amino-1,2,4-triazool (3-AT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8056</td><td></td></tr><tr><td>runder serum</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16170060</td><td></td></tr><tr><td>Cell cultuur incubator</td><td>Nuaire</td><td>NU-4750</td><td></td></tr><tr><td>diKillerRed-PTS1</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>gemaakt door de KillerRed tandem dimer met PTS1(VKSKL) toe te voegen</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-C1</td><td>Clontech</td><td>pEGFP-C1</td><td>De ruggengraat van EGFP-C1 werd gebruikt voor het klonen van EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62</td></tr><tr><td>EGFP-Hsp70</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>Hsp70-gen (HSPA1A) PCR versterkt vanuit HeLa cDNA en gekloneerd in EGFP-C1</td></tr><tr><td>EGFP-LC3B</td><td>Addgene</td><td>11546</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-p62</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>gegenereerd door het invoegen van het humane SQSTM1-gen (middels PCR-versterking van het HeLa-cel-cDNA) in EGFP-C1</td></tr><tr><td>EGFP-Stub1</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>gegenereerd door het invoegen van het muis Stub1-gen (middels PCR-versterking van het totale muisnier-cDNA) in EGFP-C1</td></tr><tr><td>EGFP-Ub</td><td>Addgene</td><td>11928</td><td></td></tr><tr><td>foetaal runder serum</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>HaloTag TMR ligand&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G8252</td><td></td></tr><tr><td>HaloTag-PTS1</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>PTS1 toegevoegd en gekloneerd in de ruggengraat van EGFP-C1</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerde confocale microscoop&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>FV3000RS</td><td>405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,&nbsp; microscoop met een TOKAI HIT kamer incubator en de UNIV2-D35 schotelaansluiting</td></tr><tr><td>Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand</td><td>Promega</td><td>GA1120</td><td></td></tr><tr><td>LED</td><td>VitaStar</td><td>PAR64</td><td>80 W, 555-570 nm</td></tr><tr><td>lipofectamine 2000&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668</td><td>transfectiereagens</td></tr><tr><td>NIH3T3-cel</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td>adherent</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>319850</td><td>serumreductiemedia</td></tr><tr><td>penicilline/streptomycine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>PMP34-TagBFP</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>PMP34 PCR versterkt vanuit HeLa cDNA en gekloneerd in TagBFP-C (Evrogen FP171)</td></tr><tr><td>roGFP2-PTS1</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>gegenereerd door eroGFP (genomen van Addgene plasmide 20131) aan te vullen met de aminozuursequentie VKSKL, en gekloneerd in de EGFP-C1</td></tr><tr><td>SHSY5Y-cel</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td>adherent</td></tr></tbody></table>

monitoring stub1-gemedieerde pexofagie

Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy

Zoogdiercellen kunnen peroxisomen omkeren via Stub1-gemedieerde pexofagie. De route maakt mogelijk cellulaire controle van de kwantiteit en kwaliteit van peroxisomen mogelijk. Tijdens dit proces transloceren heat shock protein 70 en het ubiquitine E3 ligase, Stub1, op peroxisomen om te worden omgedraaid om pexofagie te initiëren. De Stub1 ligase-activiteit maakt de accumulatie van ubiquitine en andere autofagie-gerelateerde modules op gerichte peroxisomen mogelijk. Het verhogen van reactieve zuurstofsoorten (ROS) niveaus binnen het peroxisomale lumen kan Stub1-gemedieerde pexofagie activeren. Men kan daarom kleurstof-ondersteunde ROS-generatie gebruiken om deze route te activeren en te monitoren. Dit artikel schetst de procedures voor het gebruik van twee klassen kleurstoffen, fluorescerende eiwitten en synthetische fluoroforen, om pexofagie in zoogdiercelculturen te initiëren. Deze op kleurstof ondersteunde ROS-generatie gebaseerde protocollen kunnen niet alleen worden gebruikt om alle peroxisomen binnen een celpopulatie wereldwijd aan te pakken, maar kunnen ook de manipulatie van individuele peroxisomen binnen afzonderlijke cellen mogelijk maken. We beschrijven ook hoe Stub1-gemedieerde pexofagie kan worden gevolgd met behulp van live-cell microscopie.

Het hier getoonde Stub1-gemedieerde pexofagie-inductieschema maakt gebruik van kleurstofondersteunde ROS-generatie binnen het peroxisoomlumen. Deze bewerking vereist minimale lichtintensiteiten. Peroxisomen die fluorescerende eiwitten of kleurstoffen bevatten, kunnen daarom worden verlicht met behulp van standaard laserscannende confocale microscopen. Focale verlichting leidt tot onmiddellijke en gelokaliseerde ROS-productie binnen individuele peroxisomen, zoals aangegeven door de fluorescerende reporter roGFP2-VKSKL (<s...

Dit protocol geeft instructies voor het activeren en monitoren van Stub1-gemedieerde pexofagie in levende cellen.

Monitoring Stub1-gemedieerde Pexofagie

Mammalian cells can turn over peroxisomes through Stub1-mediated pexophagy. The pathway potentially permits cellular control of the quantity and quality ...

Peroxisomen voeren bèta-oxidatie uit en zijn gevoelig voor ROS-schade. Deze methode maakt het mogelijk om te onderzoeken hoe cellen omgaan met ROS-gestresste peroxisomen. Dit protocol wordt niet alleen gebruikt om zich wereldwijd te richten op alle peroxisomen binnen een celpopulatie, maar kan ook de manipulatie van de individuele peroxisomen binnen afzonderlijke cellen mogelijk maken.Kleurstof-geassisteerde ROS-generatie kan ook worden gebruikt om organellen buiten peroxisomen te richten om te onderzoeken hoe cellen omgaan met organelletsels. Om te beginnen, zaai twee keer 10 tot de vijfde menselijke SHSY5Y-cellen of zes keer 10 tot de vierde muis NIH H3T3-cellen in 840 microliter kweekmedium op 35-millimeter kweekschalen met glazen bodem met een glazen microwell met een diameter van 20 millimeter. Kweek de cellen onder 5% koolstofdioxide bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur.Transfecteer vervolgens de cellen met de gewenste plasmiden met behulp van een transfectiereagens of SHSY5Y-celtransfectie. Verdun plasmiden in 55 microliter serumvrij DMEM/F-12 en verdun één microliter transfectiereagens in 55 microliter serumvrij DMEM/F-12. Combineer het verdunde DNA met het verdunde reagens.Meng voorzichtig en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg het complex toe aan de 20 millimeter microwell die eerder is bedekt met 100 microliter kweekmedium dat SHSY5Y-cellen zonder antibiotica bevat. Schud de schaal voorzichtig heen en weer.Voer NIH 3T3-celtransfectie uit zoals eerder aangetoond, maar vervang gereduceerd serummedium in plaats van serumvrije DMEM / F-12 voor plasmideverdunning en transfectiereagens. Verwijder na twee uur transfectie het transfectiereagensbevattende medium en voeg één milliliter vers kweekmedium toe. Incubeer de NIH 3T3- of SHSY5Y-cellen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 24 uur.Voor lichtgeactiveerde ROS-productie verwijdert u 24 uur na transfectie het kweekmedium en voegt u 10 microliter 200 nanomolair HaloTag TMR-ligand of 200 nanomolair Janelia Fluor 646 HaloTag-ligand toe aan de 20-millimeter glazen microwell. Breng de schaal over naar een 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide-incubator en laat het een uur staan om de cellen te kleuren. Verwijder na een uur het kleurmedium grondig en voeg een milliliter vers kweekmedium toe.Plaats een schaal met glazen bodem met de gewenste cellen op een laserscanning confocale microscoop uitgerust met een podiumincubator. Klik in de software op Gereedschapsvenster, kies Oculair en klik op de DIA-knop om het doorgelaten licht in te schakelen. Bekijk de schotel door het microscoopoculair en breng de cellen scherp door aan de scherpstelknop te draaien.Kies LSM en klik op de knop Dye Detector Select. Dubbelklik op de gewenste kleurstoffen in het pop-upvenster om de juiste laser- en filterinstellingen te selecteren voor het afbeelden van de cellen. Klik op Live4x in het Live-paneel om een snelle laserscanning te starten om te beginnen met het screenen op de fluorescerende signalen van de cellen.Verplaats het podium met behulp van de joystickcontroller en zoek de medium diKillerRed VKSKL- of SLP-VKSKL-expresserende cellen om ROS-spanning op de peroxisomen toe te passen. Verkrijg een afbeelding van de gewenste cel. Klik op Tool Window en kies LSM Stimulation.Klik vervolgens op de ellipsknop en gebruik in het Live Image-venster de muis om een ROI van 15 micrometer in diameter te tekenen met de gewenste peroxisomen waarop ROS-spanning zal worden toegepast. Om ROS-stress toe te passen, gebruikt u 561 nanometer voor cellen met de diKillerRed VKSKL of TMR-gelabelde SLP-ligand en gebruikt u 640 nanometer voor cellen gekleurd met de Janelia Fluor 646-gelabelde SLP-ligand. Selecteer de lasergolflengte voor het toepassen van de ROS-spanning.Voer het gewenste laserpercentage en de duur in. Voor ROS-productie in de peroxisomen klikt u op Acquire en vervolgens op de stimulatieknop om het scannen te starten met 561 of 640 nanometer licht door de ROIs gedurende elk 30 seconden. Deze stimulatie komt overeen met ongeveer 5% laservermogensinstellingen voor 561 en 640 nanometer.Na 30 seconden laserverlichting verliezen peroxisomen binnen de ROIs hun diKillerRed VKSKL-, TMR- of Janelia Fluor 646-signalen. Dit signaalverlies maakt het mogelijk om de verlichte en niet-verlichte peroxisomen in de cel te onderscheiden. Om de pexofagean levende cellen te controleren, volgt u de translocatie van EGFP-gelabelde Stub1, Hsp70, ubiquitine, p62 of LC3B op de verlichte of ROS-belaste peroxisomen door timelapse-beeldvorming met intervallen van 10 minuten tussen frames.Focale verlichting leidt tot onmiddellijke en gelokaliseerde ROS-productie binnen individuele peroxisomen zoals aangegeven door de fluorescerende reporter roGFP2-VKSKL. De diKillerRed VKSKL-afbeelding werd genomen nadat alle roGFP2-VKSKL-metingen waren gedaan om de locatie van de beschadigde peroxisomen aan te geven. De gegevens tonen ook aan dat niet-geanolumineerde peroxisomen niet worden beïnvloed, wat wijst op de precisie van de methodologie.Deze methodologie werd gebruikt om Stub1-gemedieerde pexofagie te monitoren. Tijdens dit proces verschijnen Hsp70, Stub1, ubiquitinated proteins, autofagy adapters p62 en LC3B vervolgens in ROS-gestresste peroxisomen om pexofagie aan te drijven. Met dezelfde strategie was het mogelijk om tegelijkertijd alle peroxisomen op een kweekschaal te beschadigen voor de biochemische karakterisering van Stub1-gemedieerde pexofagie.Vóór LED-verlichting was EGFP-ubiquitinefluorescentie homogeen in het cytoplasma en colokaliseerde het niet met de peroxisomen. Na negen uur LED-verlichting hoopten de EGFP-ubiquitinesignalen zich op op alle peroxisomen in de cellen die in een confocale schaal werden gekweekt. Met behulp van dit protocol ontdekten we dat ROS-gestresste peroxisomen worden verwijderd via een ubiquitine-afhankelijke afbraakroute.ROS-gestreste peroxisomen rekruteren het ubiquitine E3-ligase Stub1 om hun verwijdering door pexofagie mogelijk te maken.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Werkwijze voor ubiquitine-proteasoom activiteit in levende cellen te volgen beschreven. Een degron-gedestabiliseerd GFP-(GFP-dgn) en een stabiele GFP-fusie-eiwit dgnFS gegenereerd en wordt getransduceerd in de cel met een lentivirale vector expressie. Deze techniek maakt het mogelijk om een ​​stabiel GFP-dgn/GFP-dgnFS expressie cellijn waarin ubiquitine-proteasoom activiteit gemakkelijk worden bepaald onder toepassing epifluorescentie of flowcytometrie.

Monitoring van ubiquitine-proteasoom activiteit in levende cellen door een Degron (dgn)-gedestabiliseerd Green Fluorescent Protein (GFP)-gebaseerde Reporter Protein

Een handige en krachtige methode voor het bestuderen van autofagie in Penicillium chrysogenum door het gebruik van hongerpaden (mengsels van agarose en leidingwater in een microscoopglas met een centrale holte) wordt hier gepresenteerd.

Analyse van autofagie in<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Door gebruikmaken van uithongering pads in combinatie met fluorescentiemicroscopie

Hier beschrijven we in detail een time-lapse videomicroscopie-benadering om de temporele recrutering van EYFP-Parkin te meten tijdens de selectieve verwijdering van beschadigde mitochondriën. Dit dynamische proces van EYFP-Parkin-afhankelijke verwijdering van beschadigde mitochondriën kan worden gebruikt als een indicator van cellulaire gezondheid onder verschillende experimentele omstandigheden.

Time-lapse video microscopie voor de Beoordeling van EYFP-Parkin Aggregation als marker voor Cellular mitofagie

Mitophagy, het proces van clearing beschadigd de mitochondriën, is noodzakelijk voor mitochondriale homeostase en gezondheid onderhoud. Dit artikel presenteert een aantal van de meest recente mitophagy detectiemethoden in menselijke cellen, Caenorhabditis elegansen muizen.

In Vitro en In Vivo opsporing van Mitophagy in menselijke cellen, C. Elegansen muizen

Dit protocol schetst een methode voor kwantitatieve analyse van mitophagy eiwit complexvorming specifiek in bètacellen van primaire menselijke eilandje monsters. Deze techniek maakt dus analyse van mitophagie van beperkt biologisch materiaal mogelijk, die cruciaal zijn in de voorbeelden van kostbare humane alvleesklier bètacellen.

Visualisatie van endogene Mitophagie complexen in situ in humane pancreas Bètacellen met behulp van proximity Ligatie test

Recycling endosomen maken deel uit van het endosomale buisvormige netwerk. Hier presenteren we een methode om de dynamiek van recycling-endosomen te kwantificeren met behulp van GFP-STX13 als organelmarker.

De op microscopie gebaseerde test om de recycling-endosomen te bestuderen en te analyseren met behulp van SNARE-handel

Het verkennen van mitofagie door middel van elektronenmicroscopie, genetische sensoren en immunofluorescentie vereist dure apparatuur, geschoold personeel en een aanzienlijke tijdsinvestering. Hier demonstreren we de werkzaamheid van een commerciële fluorescentiekleurstofkit bij het kwantificeren van het mitofagieproces in zowel Caenorhabditis elegans als een leverkankercellijn.

Detectie van mitofagie in Caenorhabditis elegans en zoogdiercellen met behulp van organel-specifieke kleurstoffen

Lipofagie is een selectieve vorm van autofagie waarbij lipidedruppeltjes worden afgebroken. Disfuncties in dit proces worden in verband gebracht met de ontwikkeling van kanker. De precieze mechanismen zijn echter nog niet volledig begrepen. Dit protocol beschrijft kwantitatieve beeldvormingsbenaderingen om de wisselwerking tussen autofagie, lipidenmetabolisme en kankerprogressie beter te begrijpen.

Onderzoek naar de regulatie van katabolisme van lipidendruppels door middel van lipofagie

Hier presenteren we de methodologie voor het beknopt beoordelen van autofagosoommarker LC3-II-niveaus in extracellulaire vesikels (EV's) door middel van immunoblotting. Analyse voor LC3-II-niveaus in EV's, autolysosoomvorming en omegasoomvorming suggereert de nieuwe rol van STX6 bij de afgifte van LC3-II-positieve EV's wanneer autofagosoom-lysosoomfusie wordt geremd.

Evaluatie van LC3-II-afgifte via extracellulaire blaasjes in relatie tot de accumulatie van intracellulaire LC3-positieve blaasjes

PeroxiSPY-probes worden gebruikt om peroxisomen in zoogdiercellen te detecteren. Hier demonstreren we hoe de probes worden gebruikt om peroxisomen in levende en gefixeerde cellen te kleuren.

Peroxisoomkleuring in zoogdiercellen met behulp van peroxisoomspecifieke probes

Leer hoe Stub1-gemedieerde pexofagie wordt gemonitord in menselijke SHSY5Y- en muizen NIH 3T3-cellen met behulp van live imaging en confocale microscopie. Deze methode onthult ubiquitin-afhankelijke degradatie van ROS-gestresseerde peroxisomen.

Monitoring Stub1-gemedieerde Pexofagie

Meer video's verkennen