Analyse van extracellulaire vesicle-gemedieerde vasculaire calcificatie met behulp van in vitro en in vivo modellen

Dit protocol biedt een methode die kan worden gebruikt om te helpen bij het beoordelen en in de toekomst helpen bij het ontwikkelen van behandelingen voor vasculaire calcificatie, de belangrijkste voorspeller van hart- en vaatziekten. Het vermogen om EV's te isoleren stelt ons in staat om de mechanismen die leiden tot vasculaire verkalking en de fenotypische verandering van vasculaire gladde spiercellen verder te bestuderen. Deze techniek geeft inzicht in vroege moleculaire mechanismen van vasculaire gladde spiercel-gemedieerde verkalking.

Door dit te begrijpen, kunnen therapeutische opties worden bestudeerd voor het begrepen mechanisme. Alle EV's van belang kunnen met behulp van deze methode worden bestudeerd. Het is niet exclusief voor vasculaire gladde spiercellen, osteoblasten of vasculaire calcificatie.

Nadat u de muis hebt geëuthanaseerd, tilt u de huid op met een pincet en maakt u een incisie langs de middellijn. Verwijder overtollige huid of vet. Verwijder vervolgens de voortplantingsorganen, blaas en vet buiten de middellijn.

Verplaats vervolgens de gastro-intestinale organen naar de rechterkant en volg de darmen in de middellijn. Eenmaal gevonden, til de middellijn op en snijd het maagdarmkanaal weg tot aan de maag. Snijd de nieren weg door ze weg te tillen van de middellijn.

Snijd zo dicht mogelijk bij de nier. Verwijder de lever door de lobben op te tillen en weg te snijden van de middellijn. Perfuseer vervolgens het hart en de aorta door koude PBS in de rechterkamer te injecteren met behulp van een spuit van 10 milliliter.

Wacht tot de longen zijn opgeblazen en wit worden. Verwijder de longen en eventuele overtollige middenrif of ribbenkast. Om het bot te verwijderen, opent u een schaar breed en plaatst u deze op het onderste deel van de muis boven de staart.

Snijd naar beneden, til de wervelkolom van de huid en verwijder het vet van de zijkanten van de middellijn. Zodra de huid is losgemaakt, snijdt u de wervelkolom en intacte organen weg door recht boven het hart te snijden. Plaats de wervelkolom en intacte organen in een bekerglas PBS in de ijsemmer als u ze naar een stereoscoop transporteert.

Nadat u de wervelkolom en organen in de ontleedschaal hebt verplaatst, vult u deze met ijskoude PBS en pint u de wervelkolom en ribbenkast vast met naalden. Til onder de dissectiemicroscoop het hart voorzichtig op met een pincet en begin met snijden boven de wervelkolom en onder de aorta. Ga hiermee door totdat de onderkant van de wervelkolom is bereikt.

Verwijder de wervelkolom uit de ontleedschaal en pin het hart en eventuele vreemde vetten of spieren vast. Beginnend vanuit het gebied direct onder het hart, identificeer de slokdarm, vena cava en aorta. Verwijder de slokdarm en vena cava om een duidelijk gezichtsveld van de aorta te hebben.

Gebruik de microdissectietang en schaar om het vetweefsel op te tillen en zo dicht mogelijk bij de aorta te knippen. Ga hiermee door langs de mediale lijn totdat alle aorta en de dijbeenslagaders blootliggen. Verwijder in het hart al het vetweefsel dat de drie takken bij de aortaboog blootlegt.

Verwijder de aortawortel uit de linker ventrikel door de microdissectieschaar in de linker ventrikel in te brengen en de spier rond de aorta door te snijden. Zodra de aorta is geïsoleerd en gereinigd, beeldt u de aorta af met behulp van een nabij-infraroodscanner om vasculaire verkalking te visualiseren. Kwantificeer met behulp van het aangepaste MATLAB-script het totale signaal van de calciumtracer genormaliseerd naar het totale gescande aortagebied.

Leid het MATLAB naar de locatie van de TIF-bestanden van de nabij-infraroodscan van de aorta's, open de afzonderlijke bestanden en extraheer de pixelintensiteitswaarden uit de TIF-bestanden. Selecteer de aorta met de grootste verkalking als het schaalmaximum op de afbeelding met de kleurtoewijzing. Wanneer de opdracht Hoeveel exemplaren zijn er in de afbeelding in het venster verschijnt, voert u het aantal aorta's in de huidige afbeelding in en selecteert u elke aorta één voor één.

Zodra een aorta is geselecteerd, maakt MATLAB binaire afbeeldingen met een masker van het totale gebied en het verkalkte gebied van de aorta. De waarden van deze gemaskeerde beelden worden vervolgens gebruikt om het totale verkalkte gebied, de totale oppervlakte van de aorta, het percentage positieve verkalkingsgebieden en de gemiddelde intensiteit van het verkalkte gebied te bepalen. Onmiddellijk na het scannen van de aorta's, pool twee tot drie aorta's om een voldoende eiwitconcentratie te verkrijgen.

Incubeer twee tot drie gepoolde aorta's in 1,5 milliliter spijsverteringsoplossing gedurende twee uur bij 37 graden Celsius. Verzamel de oplossing en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 1.000 g om celresten te verwijderen. Om vervolgens de microvesicles te verwijderen, centrifugeert u het supernatant opnieuw gedurende 30 minuten bij 33.000 g.

Verzamel en beoordeel het supernatant op verkalkingspotentieel. Na het verwijderen van het celafval uit het geconditioneerde verzamelde medium door centrifugatie, draait u het verzamelde supernatant gedurende 30 minuten op 33.000 g. Verzamel het supernatant en breng het over in een nieuwe buis.

Voeg vervolgens 1% van 300 millimolair natriumdiwaterstoffosfaat toe aan de extracellulaire blaasjesmonsters en meng de oplossing door pipetteren. Breng 200 microliter van de mengseloplossing over in een plaat met 96 putten en incubeer de plaat met 96 putten in de microplaatlezer bij 37 graden Celsius. Stel de plaatlezer in om de absorptie op een golflengte van 340 nanometer elke minuut op te nemen.

Pipetteer 300 microliter van de collageenoplossing in elke put van een glas met acht putjes en incubeer gedurende 72 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Voeg na de incubatie 300 microliter DMEM toe als controle in de putten. Voeg 300 microliter van de eerder verzamelde extracellulaire blaasjesmediummonsters toe aan de resterende putten en incubeer gedurende zes dagen, zoals eerder aangetoond.

Op de 10e dag, pipetteer 2,5 microliter van het OsteoSense- en DMEM-mengsel in elk putje en incubeer gedurende 24 uur. Aan het einde van de incubatie, beeld de hydrogels met filters voor OsteoSense fluorescentie door de onderkant van een afdekglaskamer met behulp van een omgekeerde microscoop, of vanaf de bovenkant met een lange werkafstandsobjectief. Beoordeel het aantal verkalkingen en de verkalkingsgrootte en de verzamelde beelden met behulp van de deeltjesanalyse-opties die beschikbaar zijn in ImageJ.

Navigeer vervolgens naar Afbeelding, selecteer Aanpassen en klik op Drempel om de afbeeldingen te binariseren, zodat alleen het OsteoSense-signaal wit lijkt. Gebruik vervolgens de opdracht Analyseren en klik op Deeltjes analyseren om informatie op te halen voor elke verkalking in de afbeelding. Gebruik dezelfde drempelparameters voor consistentie voor elke geanalyseerde afbeelding.

Nabij-infrarood optische scannerbeelden van de ontlede aorta's toonden een hoger OsteoSense-signaal in de aorta van een muis met chronische nierziekte dan de twee aorta's van controlemuizen. Het geconditioneerde medium verkregen uit vasculaire gladde spiercellen gekweekt in een pro-calcific medium vertoonde een hogere absorptie bij 340 nanometer dan het controlemedium. De absorptietoename trad 1,5 keer sneller op in het pro-calcific monster in vergelijking met een controlemonster.

Het geconditioneerde medium uit cellen gekweekt in pro-calcific omstandigheden bevatte minerale afzettingen. Bij het micro-ontleden van de aorta is het belangrijk om het vet rond de aorta zorgvuldig te snijden. Je wilt zoveel mogelijk van de aorta analyseren, maar dit kan behoorlijk vervelend zijn.

Zodra EV's zijn geïsoleerd, kunnen aanvullende tests, zoals een alkalische fosfatase-activiteitstest of immunolichaam, worden voltooid. Deze tests zouden verder de mechanismen en eiwitten aantonen die aanwezig zijn in EV's.