Name: Analyse van extracellulaire vesicle-gemedieerde vasculaire calcificatie met behulp van in vitro en in vivo modellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-27T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Ontdek een methode om vasculaire calcificatie te analyseren met behulp van murine aorta-isolatie en extracellulaire vesicels. Deze techniek biedt inzicht in moleculaire mechanismen en ondersteunt cardiovasculair onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Heart, Lung, and Blood Institute van de National Institutes of Health (NIH) (1R01HL160740 en 5 T32GM132054-04) en de Florida Heart Research Foundation. We willen Kassandra Gomez bedanken voor haar hulp bij het synthetiseren en in beeld brengen van de hydrogels.

Het in vivo werk werd goedgekeurd en gecontroleerd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan de Florida International University en voldeed aan de huidige richtlijnen van de National Institutes of Health (NIH). Voor dit protocol verschilt de procedure niet afhankelijk van de stam, het gewicht, de leeftijd en het geslacht van de muis. Het type verkalking dat wordt bestudeerd, diëten en behandelingen kunnen de duur van het onderzoek en het gewicht van de gebruikte muis veranderen en kunnen afhankelijk zijn van een specifieke stam en geslacht van de muis die in het onderzoek wordt gebruikt. Voor dit protocol werden zowel mannelijke als vrouwelijke C57BL/6J-muizen gebruikt en kregen ze een verkalkingsdieet. De muizen werden geofferd tussen de 20 weken en 24 weken oud.
1. Isolatie en excisie van de aorta
<ol><li>Fluorescerende markers<ol><li>Achtenveertig uur voor euthanasie injecteert u de muizen met 20 μM OsteoSense 680, een fluorescerend beeldvormingsmiddel, in de aanbevolen dosis van 100 μL per 25 g via een intraveneuze injectie.</li>
		<li>Plaats onder de zuurkast een piepschuimplaat met vier t-pinnen, een emmer bekleed met een papieren handdoek, een buis van 50 ml gevuld met een papieren handdoek, een microcentrifugebuis van 1,5 ml, dissectiegereedschappen (zie de materiaaltabel) en ethanol in een spuitfles. Plaats bekers met PBS op ijs.</li>
	</ol></li>
	<li>Bloedafname<ol><li>Voeg 2 ml isofluraan toe aan een conische buis van 50 ml gevuld met het keukenpapier. Plaats de buis in de emmer en sluit deze met het deksel. LET OP: Isofluraan moet worden behandeld in een goed geventileerde ruimte zonder recirculatie van uitlaatlucht vanwege de toxiciteit van kortdurende blootstelling.</li>
		<li>Breng één muis tegelijk in de emmer. Eenmaal verdoofd, plaatst u de muis op het keukenpapier in de dorsale positie. Houd de muis vast met de palm van de niet-dominante hand en plaats de oren terug met de duim en wijsvinger.</li>
		<li>Snijd met het pincet een van de ogen weg. Houd de muis boven de buis van 1,5 ml om te beginnen met bloedafname, waarbij 1 ml bloed moet worden verzameld. Zodra het bloed stopt met weglopen, plaatst u de muis terug in de emmer voor verdere sedatie.</li>
	</ol></li>
	<li>Euthanasie<ol><li>Leg een papieren handdoek op de snijmat. Zodra de muis is verdoofd, plaatst u de muis op de mat in rugligging. Bevestig de muis in rugligging met behulp van een t-pin om elke ledemaat vast te houden.</li>
		<li>Spuit de buik van de muis in met alcohol. Til met het pincet de huid op de borststreek op. Knip met de schaar de mediale lijn in de thoracale holte. Zodra het borstbeen in het midden is gesneden, snijdt u het diafragma aan weerszijden van de ribbenkast af.</li>
		<li>Snijd indien nodig het frontale deel van de ribbenkast weg om het hart en de longen bloot te leggen.</li>
	</ol></li>
	<li>Orgaanverwijdering<ol><li>Til met een pincet de huid op en maak een incisie langs de middellijn. Verwijder overtollige huid of vet. Verwijder de voortplantingsorganen en blaas, evenals vet buiten de middellijn.</li>
		<li>Verplaats de gastro-intestinale (GI) organen naar de rechterkant en volg de darmen in de middellijn. Eenmaal gevonden, til je de middellijn op en snijd je het maagdarmkanaal weg tot aan de maag.</li>
		<li>Snijd de nieren weg door ze weg te tillen van de middellijn. Snijd zo dicht mogelijk bij de nier.</li>
		<li>Begin vervolgens met het verwijderen van de lever door de lobben op te tillen en weg te snijden van de middellijn.</li>
		<li>Perfuseer het hart en de aorta. Injecteer met een spuit van 10 ml koude PBS in de rechterkamer. Wacht tot de longen zijn opgeblazen en wit worden. Verwijder de longen, evenals een overtollig middenrif of ribbenkast.</li>
	</ol></li>
	<li>Botverwijdering<ol><li>Open een schaar wijd en plaats ze op het onderste deel van de muis boven de staart. Snijd naar beneden en begin met het optillen van de wervelkolom van de huid. Verwijder het vet van de zijkanten van de middellijn. Zodra de huid is losgemaakt, snijdt u de wervelkolom en intacte organen weg door recht boven het hart te snijden. Als u naar een stereoscoop transporteert, plaatst u de wervelkolom en intacte organen in een bekerglas PBS in de ijsemmer.</li>
		<li>Beweeg de wervelkolom en organen in de ontleedschaal. Vul met ijskoude PBS. Pin de wervelkolom en ribbenkast vast met behulp van naalden.</li>
		<li>Gebruik onder de dissectiemicroscoop een pincet om het hart voorzichtig op te tillen en begin boven de wervelkolom en onder de aorta te snijden. Ga hiermee door totdat de onderkant van de wervelkolom is bereikt. Verwijder de wervelkolom uit de ontleedschaal en pin het hart en eventuele vreemde vetten of spieren vast.</li>
	</ol></li>
	<li>Microdissectie<ol><li>Beginnend bij het gebied direct onder het hart, identificeer de drie buisvormige structuren: de slokdarm, vena cava en aorta. Verwijder de slokdarm en vena cava om een duidelijk gezichtsveld van de aorta te hebben.</li>
		<li>Gebruik de microdissectietang en schaar om het vetweefsel op te tillen en zo dicht mogelijk bij de aorta te snijden. Zorg ervoor dat u de aorta niet snijdt. Ga hiermee door langs de mediale lijn totdat alle aorta en de dijbeenslagaders blootliggen.</li>
		<li>Verwijder in het hart al het vetweefsel en leg de drie takken bij de aortaboog bloot. Verwijder de aortawortel uit de linker ventrikel door de microdissectieschaar in de linker ventrikel in te brengen en de spier rond de aorta door te snijden.</li>
		<li>Zodra de aorta is geïsoleerd en gereinigd, beeldt u de aorta af met behulp van een nabij-infraroodscanner om vasculaire verkalking te visualiseren.</li>
		<li>Gebruik het aangepaste MATLAB-script (Supplemental File 1) om het totale signaal van de calciumtracer te kwantificeren, dat is genormaliseerd naar het totale gescande aortagebied. Het MATLAB-script functioneert met behulp van de Bioinformatics toolbox add-in. MATLAB wordt eerst naar de locatie van de TIFF-bestanden geleid vanuit de nabij-infraroodscan van de aorta's, de afzonderlijke bestanden worden vervolgens geopend en de pixelintensiteitswaarden worden uit de TIFF-bestanden geëxtraheerd.<ol><li>Zodra de afbeelding aan de gebruiker is gepresenteerd met een kleurenkaart, selecteert u de aorta met de grootste verkalking als de maximale schaal.</li>
			<li>Wanneer MATLAB vraagt "Hoeveel exemplaren zijn er in de afbeelding?" in het opdrachtvenster, voert u het aantal aorta's in de huidige afbeelding in en selecteert u elke aorta één voor één. Zodra een aorta is geselecteerd, maakt MATLAB een binaire afbeelding met een masker van de totale oppervlakte van de aorta en een andere binaire afbeelding met een masker van het verkalkte gebied van de aorta. De waarden van deze gemaskeerde beelden worden vervolgens gebruikt om het totale verkalkte gebied, de totale oppervlakte van de aorta, het percentage positieve verkalkingsgebieden en de gemiddelde intensiteit van het verkalkte gebied te bepalen.</li>
			<li>Als u een aorta wilt selecteren, maakt u een vak rond de aorta van belang op de meest recente afbeelding op het scherm door vier hoeken te selecteren met één linkerklik en een vak rond de afbeelding te maken. Om het vak te sluiten, dubbelklikt u op de eerste hoek. OPMERKING: De drempel kan verschillen, afhankelijk van het gebruikte verkalkingsmodel. Het is aan de gebruiker om te bepalen welke waarde een positief signaal voor vasculaire verkalking bepaalt. Zodra de drempel voor een experiment is ingesteld, moet deze gedurende de gehele duur van het experiment hetzelfde blijven.</li>
		</ol></li>
		<li>Zodra de kwantitatieve gegevens zijn geëxtraheerd, voert u een eenrichtings-ANOVA uit met de post-hoctest van Tukey om de significantie tussen de groepen aan te tonen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Isoleren en extraheren van EV's uit aorta's
OPMERKING: Zodra de aorta's zijn geïsoleerd en verwijderd, kunnen EV's uit het weefsel worden geëxtraheerd. Met behulp van een spijsverteringsoplossing en meerdere centrifugecycli kunnen EV's worden verzameld en gebruikt voor veel verschillende technieken, waaronder verkalkingstests, gel-elektroforese en immunoblotting13. Het protocol voor het isoleren en extraheren van EV's is als volgt:
<ol><li>Onmiddellijk na het scannen van de aorta's, pool twee tot drie aorta's om een voldoende eiwitconcentratie te verkrijgen.</li>
	<li>Bereid een spijsverteringsoplossing met 0,25 M sucrose, 0,12 M natriumchloride (NaCl), 0,01 M kaliumchloride (KCl), 0,02 M Trishydrochloride en 600 E/ml collagenase13.</li>
	<li>Incubeer twee tot drie gepoolde aorta's in 1,5 ml spijsverteringsoplossing gedurende 2 uur bij 37 °C. Verzamel de oplossing. Centrifugeer de oplossing gedurende 15 minuten bij 1.000 × g om celresten te verwijderen.</li>
	<li>Centrifugeer het supernatant gedurende nog eens 30 minuten bij 33.000 × g om microvesicles te verwijderen. Verzamel en beoordeel het supernatant op verkalkingspotentieel (zie rubriek 3). OPMERKING: Volg de volgende stappen als gel-elektroforese en eiwitimmunoblotting van de EV's moeten worden uitgevoerd.</li>
	<li>Ultracentrifugeer het supernatant gedurende 1 uur op 100.000 × g om de interessante EV's te isoleren.</li>
	<li>Terwijl het supernatant ultracentrifugatie ondergaat, bereidt u RIPA-lysis en extractiebuffer voor (zie de tabel met materialen) door de proteaseremmer en vortexing toe te voegen totdat deze is opgelost.</li>
	<li>Zodra de ultracentrifugatie is voltooid, zuigt u het supernatant op en laat u de pellet achter, die de EV's bevat. Suspensie van de pellet in het bereide RIPA-lysis- en proteaseremmermengsel. De monsters zijn klaar voor gel-elektroforese en western blotting.</li>
</ol>3. Beoordeling van het verkalkingspotentieel van extracellulaire blaasjes met lichtverstrooiingsabsorptie
OPMERKING: Om de real-time minerale vorming van EV's te meten, gebruikten we een test die oorspronkelijk was ontwikkeld om de vorming van mineralen uit groeischijfkraakbeen EV's uit celcultuur14 te bestuderen. Aangezien calciumfosfaatdepositie het kenmerk is van verkalking, is een toename van de lichtverstrooiingsabsorptie als gevolg van de vorming van calciumfosfaatverbindingen indicatief voor het verkalkingspotentieel14. In vitro VSMC-modellen zijn handig voor het meten van het verkalkingspotentieel van EV's. Bij deze techniek kan een plaatlezer met een filter met een korte golflengte de in vitro verkalking van EV's kwantificeren. De absorptievermogensmeting wordt geregistreerd bij 340 nm en een hogere absorptie is indicatief voor meer calciumfosfaatmineraalvorming. Het protocol voor de lichtverstrooiingsabsorptietest is als volgt:
<ol><li>Centrifugeer het geconditioneerde verzamelde medium van VSMC's bij 1.000 × g gedurende 5 minuten om celresten te verwijderen14.</li>
	<li>Centrifugeer het supernatant gedurende 30 minuten op 33.000 × g , verzamel het supernatant en breng het over in een nieuwe buis. OPMERKING: De aanwezigheid van EV's in het verzamelde supernatant kan worden bevestigd door middel van dynamische lichtverstrooiing (DLS) of nanodeeltjesvolganalyse (NTA)</li>
	<li>Bereid een 300 mM natriumfosfaat monobasisch (NaH2PO4) steriele oplossing. Filter de oplossing indien nodig om steriele omstandigheden te garanderen.</li>
	<li>Voeg 1% (v/v) 300 mM NaH2PO4 toe aan de EV-monsters en pipetteer voorzichtig de oplossing om goed te mengen. Breng 200 μL van de mengseloplossing over in een plaat met 96 putten. Incubeer de 96-putplaat in de microplaatlezer bij 37 °C.</li>
	<li>Stel de plaatlezer in om de absorptie elke 1 minuut op te nemen bij een golflengte van 340 nm.</li>
</ol>4. Beoordeling van de verkalkingsmineraalvorming van extracellulaire blaasjes met collageenhydrogels
OPMERKING: De aggregatie van EV's en de vorming van microcalcificaties worden waargenomen door collageenhydrogels. Deze hydrogels fungeren als een steiger die de collageendichtheid nabootst die in vivois waargenomen 15. Dit toont het effect van collageen op de groei van verkalking. Het protocol voor het beoordelen van de minerale vorming van EV's in hydrogels is als volgt:
<ol><li>Dag 1<ol><li>Bereid een collageenoplossing van 2,5 mg/ml in DMEM. Voeg langzaam 5 M natriumhydroxide toe aan het collageen/DMEM-mengsel totdat de kleur rood wordt. Controleer of de pH van de oplossing ongeveer 7 is. OPMERKING: Als de oplossing paars wordt en te eenvoudig wordt, start u het proces opnieuw.</li>
		<li>Pipetteer 300 μL van de 2,5 mg/ml collageenoplossing met een pH van 7 in elke put van een 8-well kamerglas. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gecontroleerde vochtigheid gedurende 72 uur.</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 4<ol><li>Voeg 300 μL DMEM als controle toe aan de putten.</li>
		<li>Voeg 300 μL van de eerder verzamelde EV-mediummonsters toe aan de resterende putten.</li>
		<li>Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gecontroleerde luchtvochtigheid gedurende 6 dagen.</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 10<ol><li>Bereid 2,5 μL Osteosense 680EX met 22,5 μL DMEM.</li>
		<li>Pipetteer 2,5 μL van het Osteosense en DMEM mengsel in elk putje. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gecontroleerde vochtigheid gedurende 24 uur.</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 11<ol><li>Stel de hydrogels voor met filters die geschikt zijn voor Osteosense fluorescentie. Beeld ze af via de onderkant van een afdekglaskamer met behulp van een omgekeerde microscoop of vanaf de bovenkant met een lange werkafstandsobjectief.</li>
		<li>Beoordeel het aantal verkalkingen en de verkalkingsgrootte in de verzamelde afbeeldingen met behulp van de deeltjesanalyse-opties die beschikbaar zijn in ImageJ.<ol><li>Gebruik de afbeelding | Aanpassen | Threshold-opdracht om de afbeeldingen zodanig te binariseren dat alleen het Osteosense-signaal wit lijkt. Gebruik de Analyze | Analyseer deeltjes opdracht om informatie te verkrijgen voor elke verkalking in de afbeelding. Zorg ervoor dat u dezelfde drempelparameters gebruikt voor elke afbeelding die is geanalyseerd op consistentie.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Bakhshian Nik, A., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+mediators+of+cardiovascular+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as mediators of cardiovascular calcification.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 78(2017).</li>
<li>Ho, C. Y., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medial+arterial+calcification%3A+an+overlooked+player+in+peripheral+arterial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Medial arterial calcification: an overlooked player in peripheral arterial disease.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (8), 1475-1482 (2016).</li>
<li>Marinelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+arterial+media+calcification+in+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiorenal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of arterial media calcification in chronic kidney disease.</a> Cardiorenal Medicine. 3 (2), 89-95 (2013).</li>
<li>Moe, S. M., Chen, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+vascular+calcification+in+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of vascular calcification in chronic kidney disease.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 19 (2), 213-216 (2008).</li>
<li>Mir, B., Goettsch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+delivery+vehicles+of+specific+cellular+cargo%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as delivery vehicles of specific cellular cargo.</a> Cells. 9 (7), 1601(2020).</li>
<li>Ruiz, J. L., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+calcification%3A+Current+controversies+and+novel+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular calcification: Current controversies and novel concepts.</a> Cardiovascular Pathology. 24 (4), 207-212 (2015).</li>
<li>New, S. E., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+extracellular+vesicles+in+de+novo+mineralization%3A+An+additional+novel+mechanism+of+cardiovascular+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of extracellular vesicles in de novo mineralization: An additional novel mechanism of cardiovascular calcification.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 1753-1758 (2013).</li>
<li>Aikawa, E., Hutcheson, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAikawa%2C+E+%22Cardiovascular+Calcification+and+Bone+Mineralization%22">Cardiovascular Calcification and Bone Mineralization</a>. , Humana Press. Cham, Switzerland. (2020).</li>
<li>Johnson, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P-407-induced+murine+model+of+dose-controlled+hyperlipidemia+and+atherosclerosis%3A+A+review+of+findings+to+date%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The P-407-induced murine model of dose-controlled hyperlipidemia and atherosclerosis: A review of findings to date.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43 (4), 595-606 (2004).</li>
<li>Shobeiri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+calcification+in+animal+models+of+CKD%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Vascular calcification in animal models of CKD: A review.</a> American Journal of Nephrology. 31 (6), 471-481 (2010).</li>
<li>El-Abbadi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphate+feeding+induces+arterial+medial+calcification+in+uremic+mice%3A+role+of+serum+phosphorus%2C+fibroblast+growth+factor-23%2C+and+osteopontin%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Phosphate feeding induces arterial medial calcification in uremic mice: role of serum phosphorus, fibroblast growth factor-23, and osteopontin.</a> Kidney International. 75 (12), 1297-1307 (2009).</li>
<li>Veseli, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Animal models of atherosclerosis.</a> European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).</li>
<li>Chen, N. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transglutaminase+2+accelerates+vascular+calcification+in+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Transglutaminase 2 accelerates vascular calcification in chronic kidney disease.</a> American Journal of Nephrology. 37 (3), 191-198 (2013).</li>
<li>Wu, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+characterization+of+the+nucleational+core+of+matrix+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Physicochemical characterization of the nucleational core of matrix vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4404-4411 (1997).</li>
<li>Hutcheson, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genesis+and+growth+of+extracellular-vesicle-derived+microcalcification+in+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques.</a> Nature Materials. 15 (3), 335-343 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Bij het uitvoeren van het protocol is het belangrijk om de kritieke stappen voor het verkrijgen van succesvolle resultaten te noteren. Tijdens de isolatie van de murine aorta is het van vitaal belang dat de perfusie goed wordt uitgevoerd. Bij het injecteren van de PBS moet ervoor worden gezorgd dat de rechterkamer niet wordt doorboord. Dit zou ervoor zorgen dat de vloeistof rechtstreeks uit de ventrikel lekt en niet door de longen circuleert, waardoor bloed in de aorta achterblijft. Zodra de perfusie goed is uitgevoerd e...

Verkalking is de belangrijkste voorspeller van sterfte en morbiditeit van hart- en vaatziekten1. Verkalking verandert de slagaderwandmechanica door de opbouw van calcium- en fosfaatmineralen2. Bij atherosclerose kan verkalking lokale stress verergeren en resulteren in plaqueruptuur, wat de belangrijkste oorzaak is van hartaanvallen. Mediale verkalking - vaak als gevolg van chronische nierziekte - is wijdverspreider en leidt tot significante arteriële verstijving, disfunctie en cardiale overbelasting 2,3. Momenteel zijn er geen therapeutische opties voor de behandeling of preventie van vasculaire calcificatie.
Vasculaire gladde spiercellen (VSMC's) nemen een osteoblastachtig fenotype aan en geven verkalkende extracellulaire blaasjes (EV's) af die ontluikende mineralen nucleeren, waardoor verkalking wordt aangedreven 4,5,6. Dit proces lijkt op de fysiologische mineralisatie van osteoblasten in bot7. Hoewel het eindpunt van mineralisatie vergelijkbaar is in de vaatwand- en botmatrix, verschillen de mechanismen waardoor de verkalkende EV's ontstaan in de twee weefsels8. Er zijn veel soorten modellen die worden gebruikt om vasculaire calcificatie te bestuderen. In vitro bootsen celkweekmodellen de osteogene overgang van VSMC's en de daaropvolgende mineraalvorming na met gespecialiseerde media.
Bij het bestuderen van in vivo verkalking hangt het gebruikte model af van het type verkalking dat wordt bestudeerd. Hyperlipidemische muismodellen worden vaak gebruikt om atherosclerotische verkalking te bestuderen, die meer focaal lijkt binnen lipidenrijke plaques9. Mediale verkalking is daarentegen wijdverspreider in de vasculatuur en wordt vaak bestudeerd met behulp van chronische nierziektemodellen die een adeninerijk dieetregime gebruiken om nierfalen te induceren of chirurgische technieken om aanzienlijke delen van de nieren te verwijderen10,11. Agressieve modellen van vasculaire calcificatie hebben een combinatie van zowel hyperlipidemische als chronische nierziektemodellengebruikt 12. Dit protocol biedt een methode voor het beoordelen van vasculaire calcificatie in muriene aortas voor zowel mediale als atherosclerotische calcificatie, het extraheren van EV's uit de aortawand en het observeren van het mineralisatiepotentieel in de EV's verkregen uit in vitro celkweekmodellen. Toekomstige studies kunnen deze procedures gebruiken in mechanistische analyses van vasculaire calcificatie en om potentiële therapeutische interventies te beoordelen.

```html
<table><tbody><tr><td>8-well chambered coverglass</td><td>Thermo Scientific</td><td>155409PK</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Syringe</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>20 G 1 inch Needle</td><td>BD</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Collagen, High Concentraion, Rat Tail</td><td>Corning</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004174</td><td></td></tr><tr><td>Curved Forceps</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-8254</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Dish</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>DD-90-S</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Pan and Wax</td><td>United Scientific Supplies</td><td>DSPA01-W</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cytiva</td><td>SH30022.FS</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>LI-COR Odyssey</td><td>LI-COR</td><td>DLx</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade) </td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5913</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade)</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5677</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade)</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5600</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip)</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-4976</td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-TL Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>B11229</td><td></td></tr><tr><td>OsteoSense 680EX</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEV10020EX</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protease Inhibitor</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32963</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Fischer Chemical</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td><td>G Biosciences</td><td>786-489</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fischer Chemical</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Thermo Scientific</td><td>A4782602</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Synergy HTX Multimode Reader</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture plate, 96-well</td><td>Thermo Fisher</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>T-Pins</td><td>United Scientific Supplies</td><td>TPIN02-PK/100</td><td></td></tr><tr><td>Tris Hydrochloride</td><td>Fischer Chemical</td><td>BP153</td><td></td></tr></tbody></table>
```

analyse van extracellulaire vesicle-gemedieerde vasculaire calcificatie met behulp van in vitro en in vivo modellen

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Hart- en vaatziekten zijn de belangrijkste doodsoorzaak in de wereld en vasculaire verkalking is de belangrijkste voorspeller van cardiovasculaire gebeurtenissen; Er zijn momenteel echter geen behandelings- of therapeutische opties voor vasculaire calcificatie. Verkalking begint in gespecialiseerde extracellulaire blaasjes (EV's), die dienen als kernhaarden door calcium- en fosfaationen te aggregeren. Dit protocol beschrijft methoden voor het verkrijgen en beoordelen van verkalking in muriene aortas en het analyseren van de bijbehorende geëxtraheerde EV's. Eerst wordt grove dissectie van de muis uitgevoerd om relevante organen te verzamelen, zoals de nieren, lever en longen. Vervolgens wordt de muriene aorta geïsoleerd en weggesneden van de aortawortel naar de dijbeenslagader. Twee tot drie aorta's worden vervolgens samengevoegd en geïncubeerd in een spijsverteringsoplossing voordat ze ultracentrifugatie ondergaan om de EV's van belang te isoleren. Vervolgens wordt het mineralisatiepotentieel van de EV's bepaald door incubatie in een fosfaatrijke oplossing en het meten van de lichtabsorptie bij een golflengte van 340 nm. Ten slotte worden collageenhydrogels gebruikt om de verkalkte minerale vorming en rijping geproduceerd door de EV's in vitro te observeren.

Zodra de aorta's zijn geëxtraheerd, toont beeldvorming met behulp van een nabij-infrarode optische scanner een visuele weergave van de aorta en de vasculaire verkalking (figuur 1). De pixelintensiteitswaarden in de gescande fluorescerende afbeelding vertegenwoordigen de verdeling van verkalking en worden hier weergegeven met behulp van een gekleurde heatmap. Kwantificeringsmethoden omvatten het identificeren van een positieve drempel en het rapporteren van het procentuele gebied van de aorta...

Dit artikel presenteert de methodologie voor het verkrijgen en beoordelen van vasculaire calcificatie door het isoleren van muriene aorta's gevolgd door het extraheren van verkalkte extracellulaire blaasjes om het mineralisatiepotentieel te observeren.

Analyse van extracellulaire vesicle-gemedieerde vasculaire calcificatie met behulp van in vitro en in vivo modellen

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; ...

Dit protocol biedt een methode die kan worden gebruikt om te helpen bij het beoordelen en in de toekomst helpen bij het ontwikkelen van behandelingen voor vasculaire calcificatie, de belangrijkste voorspeller van hart- en vaatziekten. Het vermogen om EV's te isoleren stelt ons in staat om de mechanismen die leiden tot vasculaire verkalking en de fenotypische verandering van vasculaire gladde spiercellen verder te bestuderen. Deze techniek geeft inzicht in vroege moleculaire mechanismen van vasculaire gladde spiercel-gemedieerde verkalking.Door dit te begrijpen, kunnen therapeutische opties worden bestudeerd voor het begrepen mechanisme. Alle EV's van belang kunnen met behulp van deze methode worden bestudeerd. Het is niet exclusief voor vasculaire gladde spiercellen, osteoblasten of vasculaire calcificatie.Nadat u de muis hebt geëuthanaseerd, tilt u de huid op met een pincet en maakt u een incisie langs de middellijn. Verwijder overtollige huid of vet. Verwijder vervolgens de voortplantingsorganen, blaas en vet buiten de middellijn.Verplaats vervolgens de gastro-intestinale organen naar de rechterkant en volg de darmen in de middellijn. Eenmaal gevonden, til de middellijn op en snijd het maagdarmkanaal weg tot aan de maag. Snijd de nieren weg door ze weg te tillen van de middellijn.Snijd zo dicht mogelijk bij de nier. Verwijder de lever door de lobben op te tillen en weg te snijden van de middellijn. Perfuseer vervolgens het hart en de aorta door koude PBS in de rechterkamer te injecteren met behulp van een spuit van 10 milliliter.Wacht tot de longen zijn opgeblazen en wit worden. Verwijder de longen en eventuele overtollige middenrif of ribbenkast. Om het bot te verwijderen, opent u een schaar breed en plaatst u deze op het onderste deel van de muis boven de staart.Snijd naar beneden, til de wervelkolom van de huid en verwijder het vet van de zijkanten van de middellijn. Zodra de huid is losgemaakt, snijdt u de wervelkolom en intacte organen weg door recht boven het hart te snijden. Plaats de wervelkolom en intacte organen in een bekerglas PBS in de ijsemmer als u ze naar een stereoscoop transporteert.Nadat u de wervelkolom en organen in de ontleedschaal hebt verplaatst, vult u deze met ijskoude PBS en pint u de wervelkolom en ribbenkast vast met naalden. Til onder de dissectiemicroscoop het hart voorzichtig op met een pincet en begin met snijden boven de wervelkolom en onder de aorta. Ga hiermee door totdat de onderkant van de wervelkolom is bereikt.Verwijder de wervelkolom uit de ontleedschaal en pin het hart en eventuele vreemde vetten of spieren vast. Beginnend vanuit het gebied direct onder het hart, identificeer de slokdarm, vena cava en aorta. Verwijder de slokdarm en vena cava om een duidelijk gezichtsveld van de aorta te hebben.Gebruik de microdissectietang en schaar om het vetweefsel op te tillen en zo dicht mogelijk bij de aorta te knippen. Ga hiermee door langs de mediale lijn totdat alle aorta en de dijbeenslagaders blootliggen. Verwijder in het hart al het vetweefsel dat de drie takken bij de aortaboog blootlegt.Verwijder de aortawortel uit de linker ventrikel door de microdissectieschaar in de linker ventrikel in te brengen en de spier rond de aorta door te snijden. Zodra de aorta is geïsoleerd en gereinigd, beeldt u de aorta af met behulp van een nabij-infraroodscanner om vasculaire verkalking te visualiseren. Kwantificeer met behulp van het aangepaste MATLAB-script het totale signaal van de calciumtracer genormaliseerd naar het totale gescande aortagebied.Leid het MATLAB naar de locatie van de TIF-bestanden van de nabij-infraroodscan van de aorta's, open de afzonderlijke bestanden en extraheer de pixelintensiteitswaarden uit de TIF-bestanden. Selecteer de aorta met de grootste verkalking als het schaalmaximum op de afbeelding met de kleurtoewijzing. Wanneer de opdracht Hoeveel exemplaren zijn er in de afbeelding in het venster verschijnt, voert u het aantal aorta's in de huidige afbeelding in en selecteert u elke aorta één voor één.Zodra een aorta is geselecteerd, maakt MATLAB binaire afbeeldingen met een masker van het totale gebied en het verkalkte gebied van de aorta. De waarden van deze gemaskeerde beelden worden vervolgens gebruikt om het totale verkalkte gebied, de totale oppervlakte van de aorta, het percentage positieve verkalkingsgebieden en de gemiddelde intensiteit van het verkalkte gebied te bepalen. Onmiddellijk na het scannen van de aorta's, pool twee tot drie aorta's om een voldoende eiwitconcentratie te verkrijgen.Incubeer twee tot drie gepoolde aorta's in 1,5 milliliter spijsverteringsoplossing gedurende twee uur bij 37 graden Celsius. Verzamel de oplossing en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 1.000 g om celresten te verwijderen. Om vervolgens de microvesicles te verwijderen, centrifugeert u het supernatant opnieuw gedurende 30 minuten bij 33.000 g.Verzamel en beoordeel het supernatant op verkalkingspotentieel. Na het verwijderen van het celafval uit het geconditioneerde verzamelde medium door centrifugatie, draait u het verzamelde supernatant gedurende 30 minuten op 33.000 g. Verzamel het supernatant en breng het over in een nieuwe buis.Voeg vervolgens 1% van 300 millimolair natriumdiwaterstoffosfaat toe aan de extracellulaire blaasjesmonsters en meng de oplossing door pipetteren. Breng 200 microliter van de mengseloplossing over in een plaat met 96 putten en incubeer de plaat met 96 putten in de microplaatlezer bij 37 graden Celsius. Stel de plaatlezer in om de absorptie op een golflengte van 340 nanometer elke minuut op te nemen.Pipetteer 300 microliter van de collageenoplossing in elke put van een glas met acht putjes en incubeer gedurende 72 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Voeg na de incubatie 300 microliter DMEM toe als controle in de putten. Voeg 300 microliter van de eerder verzamelde extracellulaire blaasjesmediummonsters toe aan de resterende putten en incubeer gedurende zes dagen, zoals eerder aangetoond.Op de 10e dag, pipetteer 2,5 microliter van het OsteoSense- en DMEM-mengsel in elk putje en incubeer gedurende 24 uur. Aan het einde van de incubatie, beeld de hydrogels met filters voor OsteoSense fluorescentie door de onderkant van een afdekglaskamer met behulp van een omgekeerde microscoop, of vanaf de bovenkant met een lange werkafstandsobjectief. Beoordeel het aantal verkalkingen en de verkalkingsgrootte en de verzamelde beelden met behulp van de deeltjesanalyse-opties die beschikbaar zijn in ImageJ.Navigeer vervolgens naar Afbeelding, selecteer Aanpassen en klik op Drempel om de afbeeldingen te binariseren, zodat alleen het OsteoSense-signaal wit lijkt. Gebruik vervolgens de opdracht Analyseren en klik op Deeltjes analyseren om informatie op te halen voor elke verkalking in de afbeelding. Gebruik dezelfde drempelparameters voor consistentie voor elke geanalyseerde afbeelding.Nabij-infrarood optische scannerbeelden van de ontlede aorta's toonden een hoger OsteoSense-signaal in de aorta van een muis met chronische nierziekte dan de twee aorta's van controlemuizen. Het geconditioneerde medium verkregen uit vasculaire gladde spiercellen gekweekt in een pro-calcific medium vertoonde een hogere absorptie bij 340 nanometer dan het controlemedium. De absorptietoename trad 1,5 keer sneller op in het pro-calcific monster in vergelijking met een controlemonster.Het geconditioneerde medium uit cellen gekweekt in pro-calcific omstandigheden bevatte minerale afzettingen. Bij het micro-ontleden van de aorta is het belangrijk om het vet rond de aorta zorgvuldig te snijden. Je wilt zoveel mogelijk van de aorta analyseren, maar dit kan behoorlijk vervelend zijn.Zodra EV's zijn geïsoleerd, kunnen aanvullende tests, zoals een alkalische fosfatase-activiteitstest of immunolichaam, worden voltooid. Deze tests zouden verder de mechanismen en eiwitten aantonen die aanwezig zijn in EV's.

analysis-extracellular-vesicle-mediated-vascular-calcification-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates a staining technique for assessing arterial medial calcification of the vascular smooth muscle cells in vitro. The von Kossa method employs a photochemical reaction to deposit metallic silver at the sites of calcification and impart a black coloration.

Von Kossa Staining of Aortic Vascular Smooth Muscle Cells: An In Vitro Technique for Assessment of Arterial Medial Layer Calcification

Source: Hakim, M. A. et al., Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the functional analysis of an arteriolar endothelial tube isolated from a mouse brain. It outlines the steps for measuring intracellular calcium levels and membrane potential, both at baseline and in response to pharmacological stimulation.

Analysis of Calcium Dynamics and Membrane Potential Changes in a Mouse Arteriolar Endothelium

Gerichte-esterase geïnduceerde kleurstof laden (TED) ondersteunt de analyse van de intracellulaire calcium winkel dynamiek door fluorescentie beeldvorming. De methode baseert op richten van een recombinant carboxylesterase het endoplasmatisch reticulum (ER), waar het verbetert de lokale ontmaskering van synthetische lage affiniteit...

Direct Imaging van ER Calcium met Targeted-esterase-Induced Dye Loading (TED)

Vasculaire calcificatie is een belangrijke voorspeller van en bijdrager aan hart- en vaatziekten bij mensen. Dit protocol beschrijft methoden voor het induceren van calcificatie van gekweekte primaire vasculaire gladde spiercellen en voor het kwantificeren van calcificatie en macrofagenlast in dierlijke aorta's met behulp van near-infrared fluorescentiebeeldvorming.

Verkalking van vasculaire gladde spiercellen en Imaging van Aorta verkalking en Ontsteking

We presenteren een protocol voor humane endotheliale pericyte-interacties in muizen te bestuderen onder toepassing van een variatie van de matrix gel plug angiogenese assay.

In vivo studie van humane endotheliale-pericyte Interaction Met behulp van de Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Dit protocol beschrijft de isolatie, cultuur en verkalking van de rat-afgeleide ventiel interstitiële cellen, een zeer fysiologische in vitro model van calcific aortaklep ziekte (CAVD). Exploitatie van dit model rat vergemakkelijkt CAVD onderzoek in het verkennen van de cel- en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan dit complexe pathologisch proces.

Isolatie en karakterisatie van primaire Rat klep interstitiële cellen: een nieuw Model voor het bestuderen van verkalking van de aortaklep

In dit werk beschrijven we protocollen voor het onderzoek naar de rol van extracellulaire blaasjes (EVs) uitgebracht door Plasmodium falciparum geïnfecteerd erytrocyten. In het bijzonder richten we ons op de interacties van EVW met endotheliale cellen.

Beoordeling van extracellulaire vesikel functie tijdens Malaria infectie

Dit artikel beschrijft de isolatie van muis aortaklepcellen door een twee-stap collagenase procedure. Geïsoleerde muisklepcellen zijn belangrijk voor het uitvoeren van verschillende assays, zoals deze in vitro verkalkingstest, en voor het onderzoeken van de moleculaire paden die leiden tot aortaklepmineralisatie.

Isolatie van muis interstitiële klepcellen om de verkalking van de aortaklep in vitro te bestuderen

Hier presenteren we een protocol om van bloedplaatjes lysaat afgeleide extracellulaire blaasjes te labelen om hun migratie en opname in kraakbeenexplantaten te volgen die worden gebruikt als een model voor artrose.

Etikettering van extracellulaire blaasjes voor het monitoren van migratie en opname in kraakbeenexplantaten

Hart- en vaatziekten zijn wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak. Vasculaire verkalking draagt substantieel bij aan de last van cardiovasculaire morbiditeit en mortaliteit. Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om vasculaire gladde spiercel-gemedieerde calciumprecipitatie in vitro te kwantificeren door fluorescentie beeldvorming.

Een semi-geautomatiseerde en reproduceerbare biologische methode om calciumdepositie in vitro te kwantificeren

Het protocol gebruikt een adipocyt-specifieke CD63-GFP reportermuislijn om de secretie van adipocyten-afgeleide extracellulaire blaasjes (EV's) te visualiseren en te kwantificeren en hun opname door voorlopercellen aan te tonen, waarmee een paracriene route in vetweefsel wordt onthuld.

Karakterisering van door adipocyten afgeleide extracellulaire vesikelsecretie met behulp van een CD63-GFP Reporter Mouse Model in vivo en in vitro

Ontdek een methode om vasculaire calcificatie te analyseren met behulp van murine aorta-isolatie en extracellulaire vesicels. Deze techniek biedt inzicht in moleculaire mechanismen en ondersteunt cardiovasculair onderzoek.

Analyse van extracellulaire vesicle-gemedieerde vasculaire calcificatie met behulp van in vitro en in vivo modellen

Meer video's verkennen