On-chip octanol-geassisteerde liposoomassemblage voor bio-engineering

OLA is een veelzijdig microfluïdisch platform dat nuttig is voor de synthetische biologiegemeenschap. in het bijzonder om kunstmatige cellen te bio-engineeren. OLA-gebaseerde liposomen kunnen ons helpen de zelforganisatieprincipes in de biologie te begrijpen en cel-nabootsende assemblages te construeren.

OLA produceert monodisperse, unilaminaire, celgrote liposomen op een high-throughput manier en met een uitstekende inkapselingsefficiëntie. Het vereist zeer kleine monstervolumes, in de orde van grootte van 50 microliter, en de gevormde liposomen zijn onmiddellijk beschikbaar voor verdere experimenten op de chip. OLA is nuttig voor het bestuderen van biologische reacties binnen microconfinements, vesikeldynamica en biomoleculaire condensaten en hun interacties met membranen.

OLA is ook toegepast als een high-throughput platform voor geneesmiddelenscreening, bijvoorbeeld om de permeabiliteit en membrane activiteit van antimicrobiële stoffen te testen. Oppervlaktefunctionalisatie, wat PV-behandeling is, is een kritieke stap voor het protocol en moet zorgvuldig worden uitgevoerd om te voorkomen dat de PV-oplossing de binnenste waterpijp en lipidendragende organische kanalen binnendringt. Ook moet het postproductiekanaal net lang genoeg zijn voor de scheiding van octanolpockets om liposomen te vormen.

Ketan Ganar, een promovendus uit mijn laboratorium, zal Chang Chen helpen de procedure te demonstreren. Neem om te beginnen een schone siliciumwafer met een diameter van vier inch en reinig deze verder met lucht onder druk om stofdeeltjes te verwijderen. Monteer de wafer op een spincoater en doseer voorzichtig ongeveer vijf milliliter van een negatieve fotoresist in het midden van de wafer.

Om een 10 micrometer dikke fotoresistlaag te verkrijgen, stelt u de spincoatinstellingen gedurende 30 seconden in op 500 RPM met een versnelling van 100 RRP per seconde voor initiële verspreiding, gevolgd door een spin van 60 seconden bij 3.000 RPM met een versnelling van 500 RPM per seconde. Draai vervolgens de wafer. Bak de wafel twee minuten op een verwarmingsplaat op 65 graden Celsius en daarna vijf minuten op 95 graden Celsius.

Zodra de wafer is afgekoeld, monteert u de wafer in de afdrukkamer van de direct rechtse optische lithografiemachine en voert u de octanolondersteunde liposoomassemblage of OLA-ontwerp in de software in. Zodra het ontwerp is afgedrukt, bak je de wafel gedurende één minuut op 65 graden Celsius, gevolgd door 95 graden Celsius gedurende drie minuten. Om de niet-uitgeharde fotoresist af te wassen, dompelt u de wafer in een glazen bekerglas met de ontwikkelaarsoplossing totdat de niet-uitgeharde fotoresist volledig is verwijderd.

Bak de wafer gedurende 30 minuten hard op 150 graden Celsius om ervoor te zorgen dat het afgedrukte ontwerp stevig aan het waferoppervlak is bevestigd en niet loskomt in het stroomafwaartse fabricageproces. Om het microfluïdische apparaat voor te bereiden, plaatst u de hoofdwafer op een vierkant stuk aluminium en wikkelt u de aluminiumfolie rond de wafer, waardoor een goed lijkende structuur ontstaat. Giet het PDMS-mengsel voorzichtig op de masterwafer.

Incubeer de assemblage in een oven op 70 graden Celsius gedurende ten minste twee uur. Haal de master wafer uit de oven en laat afkoelen. Om het gestold polydimethylsiloxaan of PDMS-blok te verwijderen, verwijdert u de aluminiumfolie en verwijdert u het PDMS-blok voorzichtig van de rand van de wafer.

Neem een transparante glazen afdekslip, giet ongeveer 0,5 milliliter PDMS op het midden van de glasplaat en verspreid deze over de afdekslip door de glasplaat voorzichtig te kantelen, waardoor de glasplaat volledig wordt bedekt met de PDMS. Monteer de glasplaat op de spincoater. Zorg ervoor dat deze centraal is geplaatst, zodat het midden van de schuif overlapt met het midden van de drukas.

Draai vervolgens de glasschuif op 500 RPM gedurende 15 seconden met een increment van 100 RPM per seconde en 1.000 RPM gedurende 30 seconden met een increment van 500 RPM per seconde. Plaats de PDM-gecoate glasplaat met de gecoate kant naar boven gericht op een verhoogd platform als een blok PDMS in een afgedekte petrischaal. Bak het twee uur op 70 graden Celsius.

Plaats het PDMS-blok met de gegraveerde kanalen naar boven gericht en de met PDM's gecoate glasplaat met de gecoate kant naar boven gericht in de vacuümkamer van de plasmareiniger. Schakel het vacuüm in en stel de inhoud bloot aan luchtplasma met een radiofrequentie van 12 megahertz gedurende 15 seconden om de oppervlakken te activeren. Zuurstofplasma is te zien in de vorm van een roze tint.

Plaats onmiddellijk na de plasmabehandeling de met PDMS gecoate glasplaat op een schoon oppervlak met de PDMS-zijde naar boven gericht. Plaats het PDMS-blok voorzichtig met het microfluïdische patroon nu naar de PDMS-gecoate glasplaat, zodat ze kunnen hechten. Bak de gebonden apparaten twee uur lang op 70 graden Celsius.

Doseer 200 microliter 5% polyvinylalcohol of OVA-oplossing in een buis van 1,5 milliliter en sluit deze aan op de microfluïdische reservoirstandaard. Plaats de slang zodanig dat het ene uiteinde wordt ondergedompeld in de PVA-oplossing en het andere uiteinde is verbonden met de inlaat van het buitenste waterige kanaal van het microfluïdische apparaat. Verhoog de druk van de buitenste waterige fase tot 100 millibar om de PVA-oplossing in de buitenste waterige kanalen te laten stromen.

Verhoog de druk van de binnenste waterige en lipidedragende organische fasen tot 120 millibar om de terugstroom van de PVA-oplossing in deze kanalen te voorkomen. Laat de PVA-oplossing op deze manier gedurende ongeveer vijf minuten stromen, waardoor het uitgangskanaal volledig functioneert. Verhoog de druk in de lipidedragende organische en binnenste waterige kanalen tot twee staven om de PVA-oplossing te verwijderen en maak de slang onmiddellijk los van de buitenste waterige inlaat.

Gebruik tegelijkertijd een slang die is aangesloten op een onderdrukkanaal om overtollig PVA uit het uitgangskanaal te verwijderen. Bak het apparaat 15 minuten op 120 graden Celsius en laat het voor gebruik afkoelen. Het apparaat kan ten minste een maand onder omgevingsomstandigheden worden bewaard.

Doseer de oplossingen in drie buizen van 1,5 milliliter en monteer ze. Sluit ze aan op de met PVA behandelde microfluïdische chip en oefen positieve druk uit op de drie kanalen, ongeveer 100 millibar op de binnenste waterige en lipidedragende organische kanalen en ongeveer 200 millibar op het buitenste waterige kanaal. Zodra alle drie de fasen op de junctie beginnen te stromen, moet u ervoor zorgen dat de dubbele emulsieproductie begint en de druk aanpassen aan de kwaliteit ervan.

Naarmate de dubbele emulsiedruppels stromen, worden de octanol alle pockets steeds prominenter en worden uiteindelijk afgeknepen, waardoor liposomen worden gevormd. Een helderveldbeeld van de snelle generatie van dubbele emulsiedruppels wordt hier getoond. Het fluorescerende lipidenkanaal toont de vorming van een octanol all pocket als gevolg van gedeeltelijke ontvochtiging.

Het binnenste waterige kanaal toont de inkapseling van geel fluorescerend eiwit. De ontvochtiging van de octanolzak in het uitgangskanaal dat een liposoom vormt, wordt in deze figuur weergegeven. Deze afbeelding toont het schema van de pH-afhankelijke overgang van de homogene oplossing van polylysine en ATP ingekapseld in het liposoom naar fasegescheiden polylysine ATP-coacervaten.

De initiële zure omgeving in het liposoom maakt de moleculaire lading van ATP neutraal, waardoor coacervatie wordt geremd. Wanneer de pH in de liposomen in evenwicht is met de extern aangebrachte pH-verhoging, krijgt ATP een negatieve lading, waardoor coacervatie wordt geactiveerd. De ruimtelijke verdeling van polylysine en het membraan en de timelapsebeelden van de vorming van polylysine ATP-coacervaten binnen de liposomen zijn in deze figuur weergegeven.

De externe editie van een basisbuffer verhoogt de pH-waarde in de liposomen in de loop van minuten en initieert coacervatie. T is gelijk aan nul minuten verwijst naar de tijd vlak voor het optreden van de eerste coacervatiegebeurtenis. Tijdens het demonstreren van de procedure is het cruciaal om de kanaaldruk geduldig aan te passen om een gestage dubbele emulsieproductie te genereren.

OLA en zijn variaties zijn gebruikt in diverse studies, bijvoorbeeld groei en deling van liposomen die de dynamiek van biomoleculaire condensaten begrijpen, celvrije expressie van eiwitten, evenals inkapseling van bacteriën. Dus in kneuzing geloven we dat OLA een veelzijdig platform is voor synthetische biologie.