Adipocyt-specifieke ATAC-Seq met vetweefsels met behulp van fluorescentie-geactiveerde kernsortering

ATAC-seq is een krachtige techniek om de regulerende mechanismen voor genexpressie te begrijpen. Vetweefsel is echter moeilijk met behulp van deze techniek vanwege het grote lipidegehalte, hoge mitochondriale contaminatie en cellulaire heterogeniteit. In dit protocol werd adipocyt-specifieke ATAC-sequencing uitgevoerd met behulp van fluorescentie-geactiveerde kernsortering, die hoogwaardige gegevens genereert met minimale mitochondriale DNA-contaminatie.

Deze methode kan ook worden gebruikt in andere weefsels waar celtype-specifieke Cre-muislijnen beschikbaar zijn met nucleaire labeling transgene reporterlijnen. Begin met de kernisolatie door de glazen Dounce-homogenisatoren op ijs te koelen met één glas Dounce per monster. Voeg vervolgens 7 milliliter van de NPB-mix toe aan elke glazen Dounce.

Plaats vervolgens 50 tot 100 milligram bevroren vetweefsel in het glas Dounce en snijd het in een paar kleinere stukjes met een lange schaar. Strijk 10 keer met een losse stamper voor alle monsters en vervolgens 10 keer met een strakke stamper. Filter de inhoud door een zeef van 100 micrometer in een nieuwe buis van 50 milliliter voordat u de gefilterde homogenaten overbrengt naar een buis van 15 milliliter voor centrifugatie.

Na het verwijderen van het supernatant, resuspensie de pellet in 500 microliter PBS-N door zacht maar grondig vingertikken. Filter vervolgens de suspensie door een zeef van 40 micrometer in een buis van 50 milliliter en spoel de zeef af met 250 microliter PBS-N. Breng de gefilterde nucleaire suspensie over naar een fluorescentie-geactiveerde celsortering of FACS-buis met behulp van een micropipette.

Bereid de opvangbuis voor door 500 microliter PBS-N toe te voegen aan de nieuwe buis van 1,5 milliliter en keer deze een paar keer om om alle binnenoppervlakken nat te maken met de buffer. Draai de buizen kort om alle vloeistof naar beneden te brengen voordat je ze op ijs legt totdat ze zijn gesorteerd. Gebruik voor FACS de FSC-A/FSC-H gating voor singlets en FSC-A/SSC-A voor het verwijderen van klein of groot vuil.

Poort voor de mCherry/GFP-positieve adipocytenkernpopulatie en verzamel 10.000 kernen in elke eerder voorbereide verzamelbuis. Voeg voor de voorbereiding van de nasorteerkern 500 microliter PBS-N toe aan elke verzamelbuis en meng deze door de buis een paar keer om te keren voordat u de opvangbuizen gedurende 10 minuten bij 4 graden Celsius op 200 G centrifugeert. Verwijder het supernatant volledig.

Om 25 microliter Tn5-mastermengsel te bereiden, mengt u 12,5 microliter 2x tagmentatie DNA-buffer of TD-buffer, 1,25 microliter Tn5-transposase of TDE I-enzym en 11,25 microliter nucleasevrij water. Voeg vervolgens 25 microliter Tn5-hoofdmengsel toe aan elke kernpellet en resuspensie het door voorzichtig pipetteren. Incubeer bij 600 RPM gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius met behulp van een thermische mixer.

Voeg 25 microliter nucleasevrij water toe aan de 25 microliter van het mengsel van Tn5-kernresuspensie waardoor het uiteindelijke volume 50 microliter wordt. Voeg vervolgens 250 microliter buffer PB en 5 microliter 3 M natriumacetaat met pH 5,2 toe. Nadat u het mengsel hebt overgebracht naar een kolom die bij de referentiekit is geleverd, centrifugeert u het gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur bij 17.900 G.

Nadat u de doorstroming hebt weggegooid, plaatst u een spinkolom terug in dezelfde opvangbuis. Voeg 750 microliter buffer PE met absolute ethanol toe aan de buis. Centrifugeer de kolom, gooi de doorstroming weg en plaats de spinkolom terug in dezelfde verzamelbuis.

Centrifugeer de buis en gooi de opvangbuis met de doorstroming weg. Om de getransponeerde DNA-fragmenten te versterken, bereidt u het PCR-hoofdmengsel voor zonder een unieke Ad2 toe te voegen. n barcoding primer.

Voer de PCR uit. Voer de kwantitatieve PCR of qPCR uit. Controleer de versterkingscurven en identificeer het aantal extra PCR-cycli dat nodig is door het aantal cycli te schatten dat ongeveer 35% van het maximum bereikte.

Gebruik de berekeningen om de PCR uit te voeren voor de resterende 45 microliter van de PCR-reactie. Met behulp van de eerdere procedures elueert u de versterkte DNA-fragmenten met 20 microliter buffer EB. Breng het geëlueerde DNA over naar een nieuwe PCR-buis en pas het volume aan tot 100 microliter door 80 microliter buffer EB toe te voegen. Voeg vervolgens 55 microliter SPRI-kralen toe en meng door te pipetteren. Na 5 minuten incubatie bij kamertemperatuur, scheid het op een mini magnetische standaard gedurende 5 minuten.

Als u klaar bent, brengt u 150 microliter van het supernatant over naar een nieuwe PCR-buis, voegt u 95 microliter SPRI-kralen toe en mengt u door pipetteren. Incubeer de reactie gedurende 5 minuten voordat u de kralen op de mini magnetische standaard scheidt. Gooi het supernatant voorzichtig weg en was de kralen gedurende 1 minuut met 200 microliter 70% ethanol.

Herhaal nog twee wasbeurten. Na de laatste wasbeurt, centrifugeer de buizen op 1000 G gedurende 1 minuut. Pipetteer de resterende ethanol eruit en droog de pellet op 37 graden Celsius gedurende 2 minuten op een PCR-machine met het deksel open.

Eenmaal gedroogd, resuspendieert u de pellet in 20 microliter buffer EB door pipetteren en incubeer u de buis gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Scheid de kralen gedurende 5 minuten op de mini-magnetische standaard voordat u 18 microliter van het supernatant met de uiteindelijke bibliotheek overbrengt naar een nieuwe buis van 1,5 milliliter. mCherry-gelabelde en GFP-gelabelde adipocytkernen waren te onderscheiden van de andere celtypen kernen geïsoleerd uit de vetweefsels van een Adipoq-NuTRAP-muis.

Afhankelijk van het type vetdepot is het verschil van ongeveer 50% in eWAT, 30% in iWAT en 65% in BAT werden waargenomen in de adipocytfracties. De monsters die meer dan 15 PCR-cycli nodig hadden, gaven monsters van lage kwaliteit aan. De grootteverdelingsanalyse van de ATAC-seq-bibliotheken toonde meerdere pieken die overeenkomen met het nucleosoomvrije gebied, of NFR, en mono-, di- en multinucleosomen met gemiddelde groottes van ongeveer 500 tot 800 basenparen.

Monsters van slechte kwaliteit vertoonden meestal NFR met geen of weinig nucleosomale pieken. De kwaliteitscontroletests door de qRT-PCR-analyse toonden 10 tot 20-voudige verrijkingen met de positieve genomische elementen in de buurt van adipocytenmarkergenen zoals Adipoq, Fabp4, Plin1 en Pnpla2, terwijl er geen verrijking werd aangetoond met de negatieve controle. De verrijking met het thermogene gen Ucp1 werd specifiek waargenomen in BAT.

De mitochondriale metingen waren minder dan 2% en de fractie onder de pieken was ongeveer 18% tot 44%Meerdere sterke pieken met hoge signaal-ruisverhoudingen werden onthuld in de buurt van adipocytenmarkergenen zoals Adipoq, Fabp4 en Plin1 van alle vetdepots. Sterke ATAC-seq-pieken werden waargenomen bij de bruine adipocytenmarker Ucp1-locus in het BBT-monster. De meest kritische factor voor dit protocol is de kwaliteit van de kern.

Het is belangrijk om weefselmonsters van hoge kwaliteit te gebruiken en de kernen tijdens het experiment voorzichtig te behandelen, vooral tijdens resuspensie na centrifugeren en sorteren. Het is belangrijk om te onthouden dat dit protocol afhankelijk is van transgene reportermuizen met nucleaire etikettering. NuTRAP-muizen werden hier gebruikt, maar elk vergelijkbaar systeem kan worden gebruikt.

Met onze FACS-gegevens kan men computationele meervoudige analyses uitvoeren om belangrijke transcriptomische factoren te vinden die genexpressie in biologische omgevingen reguleren.