Vestiging, onderhoud, differentiatie, genetische manipulatie en transplantatie van muis en menselijke traanklier organoïden

Met traanklierorganoïden kan men onderzoeken hoe bepaalde genen de homeostase van de traanklier regelen. Bovendien kunnen de organoïden worden gebruikt voor regeneratieve geneeskunde. Het belangrijkste voordeel van volwassen stamcel-afgeleide traanklier organoïde technologie is dat het de groei en studie van gezonde en niet-getransformeerde traanklierepitheelcellen mogelijk maakt.

Deze organoïden kunnen uiteindelijk worden gebruikt om patiënten met droge ogen te behandelen. Begin met het voorbereiden van het medium en het materiaal dat nodig is voor het experiment, gevolgd door het combineren van alle componenten van het verteringsmedium vóór het experiment. Maak de scalpels in dit medium voor om te voorkomen dat er stukjes weefsel aan blijven plakken.

Haal het traanklierweefsel van de muis uit het medium, plaats het in de petrischaal en hak het fijn met behulp van voorbevochtigde scalpels. Zodra de weefselstukken minder dan 0,5 kubieke millimeter zijn, schraap je ze met het scalpel van de petrischaal en breng je ze over in een buis van 15 milliliter met het verteringsmedium. Voor een zeer kleine menselijke biopsie, plaats het direct in het verteringsmedium zonder gehakt.

Incubeer de buis van 15 milliliter met weefselstukjes gedurende maximaal 15 minuten in een waterbad van 37 graden Celsius. Vernauw ondertussen een Pasteur-pipetpunt in een vlam en maak deze voor nat in het basismedium. Om het dissociatieproces te vergemakkelijken, pipetteert u het gehaktmengsel elke vijf minuten op en neer met de voorbevochtigde, versmalde Pasteur-pipet.

Wanneer veel enkele cellen en kleine klonten zichtbaar zijn onder de microscoop, stop dan de dissociatie door 10 milliliter van het basismedium toe te voegen. Nadat u gedurende vijf minuten op 400 g hebt gedraaid, verwijdert u het supernatant en resuspenseert u de pellet in 10 milliliter van het basismedium om de was te herhalen en de cellen te pelleteren. Verwijder de grote, onverteerde weefselstukken en resterende collageenvezels door het gehakte mengsel door een zeef van 70 micrometer te filteren.

Draai de eluate vijf minuten op 400g. Na het verwijderen van het supernatant, resuspendien de celpellet in 100 microliter koude extracellulaire matrix, of ECM, voor een enkele muis traanklier en 50 microliter koude ECM voor een menselijke biopsie, zonder de bubbels te creëren. Zaai tot 100 microliter cellen per put van een 12-well suspensieplaat met behulp van een P200 om ongeveer 20-microliter druppels in de put te maken.

Plaats de plaat ondersteboven in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius gedurende 20 tot 30 minuten om ECM-stolling mogelijk te maken. Zodra de ECU is gestold, voegt u ongeveer één milliliter muisexpansiemedium op kamertemperatuur toe per put van een 12-putplaat. Maak vers een milliliter menselijk differentiatiemedium bereid dat individuele componenten bevat die secretie door de traanklierorganoïden induceren.

Stel met een geautomatiseerde brightfield time-lapse microscoop de posities in die in de plaat moeten worden vastgelegd, het tijdsinterval van vijf minuten en de duur van vier uur. Zorg ervoor dat op elke positie een hele ECM-druppel zichtbaar is. Voordat u begint met het afbeelden, verwijdert u het kweekmedium uit de te fotograferen putten zonder de plaat van de microscoop te verplaatsen en vervangt u deze door het vers bereide, goed geresuspendeerde menselijke differentiatiemedium dat verbindingen bevat, waaronder forskoline en noradrenaline.

Neem als negatieve controle een put op met een vernieuwd differentiatiemedium. Klik op de knop Uitvoeren op de microscoop en analyseer de resultaten na vier uur. Na het dissociëren van de organoïden zoals vermeld in de tekst, gooit u het supernatant weg.

Resuspendeerde de cellen in 80 microliter van de elektroporatiebuffer. Bereid in een buis van 1,5 milliliter de plasmiden voor die nodig zijn voor het experiment. Voeg de plasmiden toe aan de cellen en meng goed door op en neer te pipetteren.

Stel de elektroporator in met de parameters voor poring pulse en transfer pulse. Plaats de cellen met de plasmiden in een elektroporatiecuvet. Meet onmiddellijk de weerstand, die tussen 0,3 ampère en 0,55 ampère moet liggen, en elektroporate onmiddellijk.

Als u klaar bent, brengt u de cellen over naar een buis van 1,5 milliliter en voegt u 400 microliter elektroporatiebuffer toe, aangevuld met een Rho-kinaseremmer. Laat de cellen gedurende 30 minuten herstellen bij kamertemperatuur. Pellet vervolgens de cellen gedurende vijf minuten op 500 g.

Na het weggooien van het supernatant, plaat de cellen in 200 microliter ECM. Voeg na het stollen het muisexpansiemedium toe. Voor organoïdepreparaat, splits de menselijke traanklierorganoïden ongeveer drie dagen vóór de transplantatiedag.

Om de organoïden uit de ECU te extraheren, voegt u dispase toe aan het kweekmedium om een eindconcentratie van 0,125 eenheden per milliliter te bereiken en resuspenseert u de ECM-druppels grondig om ze te verstoren met behulp van een P1000. Plaats de plaat gedurende 30 minuten terug in de incubator van 37 graden Celsius. Resuspendeer de organoïden in 10 milliliter basismedium om het enzym uit te spoelen.

Na het pelleteren van de cellen op 400 g gedurende vijf minuten, resuspensie ze in 50 microliter koud menselijk expansiemedium aangevuld met 5% ECM. Plaats de organoïde suspensie op ijs en ga onmiddellijk over tot de transplantatie. Voor orthotopische transplantatie bij muizen, zuig de organoïde suspensie in een insulinenaald.

Wanneer de muis slaapt, plaats hem dan snel op zijn zij met de belangrijkste traanklier toegankelijk. Injecteer vijf microliter van de organoïde suspensie rechtstreeks door de huid in de traanklier. Laat de muis herstellen en beoordeel dagelijks de aanwezigheid van transplantatiegerelateerd ongemak, vooral in het oog.

Na de dissectie van de traanklier van de muis genereerde de enzymatische en mechanische spijsvertering kleine weefselfragmenten, waaronder de acini en de kanalen. In de succesvolle meristraanklier organoïde afleiding werden cystische organoïden van ongeveer 500 micrometer diameter gevonden na zeven dagen. Menselijke traanklierorganoïden groeiden als cysten binnen drie tot vier dagen en bereikten een volgroeide grootte in 10 tot 14 dagen na weefselisolatie.

Na respectievelijk vijf dagen en zeven dagen in het differentiatiemedium werden de organoïden van de muis en de menselijke traanklier dichter. Het aanbrengen van de cyclische AMP-activator forskoline of de neurotransmitter noradrenaline resulteerde in organoïde zwelling binnen minder dan drie uur. Bij succesvolle elektroporatie groeiden organoïden uit die resistent waren tegen hygromycine.

De groeiende organoïde klonen groter dan 300 micrometer werden geplukt voordat ze werden gedifferentieerd. PCR-amplificatie van de Pax6-locus gericht door gids-RNA leverde een 367-basenpaarband op voor alle geselecteerde klonen. Eén homozygote knock-out muis traanklier kloon van de zes gesequencede werd verkregen met behulp van het gids-RNA gericht op Pax6.

Sommige klonen groeiden goed uit, maar sommige organoïde klonen gingen verloren na het plukken of begonnen te differentiëren. Van de 10 geplukte organoïde klonen groeiden er zeven goed uit. Organoïde engraftment werd bevestigd een maand na het injecteren van de organoïden in de traanklier van de muis door kleuring voor een mensspecifieke marker, het menselijke nucleolaire antigeen.

Een ding om op te letten is om het weefsel niet te oververteren, noch de organoïden. Anders zouden de cellen kunnen afsterven, en dit zou de organoïde vestigingssnelheid verminderen. Traanklierorganoïden kunnen worden geanalyseerd door histologie.

Door dit te doen, kan men inzicht krijgen in hun cellulaire samenstelling.