Geautomatiseerde multimodale stimulatie en gelijktijdige neuronale opname van meerdere kleine organismen

Neurale reacties geven inzicht in hersenactiviteit, maar kunnen variëren tussen experimenten en individuen. Dit protocol helpt door het automatiseren van stimulatieregistratie en -analyse en het vereenvoudigen van het programmeren van verschillende soorten en patronen van stimuli. De geautomatiseerde techniek maakt opnames mogelijk voor meerdere neuronen en organismen in hetzelfde microfluïdische formaat parallel.

Dit verbetert de herhaalbaarheid van opnames en maakt het mogelijk om neuronale variabiliteit tussen populaties te verkennen. Verschillende stimulatiepatronen zijn nodig om neurale verschijnselen zoals aanpassing en sensorische integratie te onthullen. Deze methode is generaliseerbaar naar andere dynamische signalen van cellen en organoïden naar organismen en planten.

Zet om te beginnen de microscoop aan, vul en verwijder de luchtbellen uit de reservoirslang met behulp van de primingspuit en vul vervolgens de uitstroomslang met buffer. Verwijder het microfluïdische apparaat uit de vacuüm exsiccator. Plaats het apparaat op de microscoop en plaats snel de uitlaatslang.

Druk zachtjes op de uitlaatspuit om vloeistof in het apparaat te injecteren totdat er een druppel uit een inlaat komt. Gebruik bij deze druppelvormige inlaat een drop-to-drop-verbinding om de overeenkomstige vloeistofinlaatbuis in te brengen, zodat er vloeistofdruppels aanwezig zijn op zowel de inlaatslang als de patrijspoort van het apparaat om te voorkomen dat een bel wordt geïntroduceerd. Sluit de volgende inlaatbuis aan op de volgende druppel.

Injecteer indien nodig meer vloeistof uit de uitlaat en herhaal dit totdat alle inlaten zijn gevuld. Plaats een stevige blokkeringspen bij ongebruikte inlaten en de wormlaadpoort. Controleer de stroom op het scherm om er zeker van te zijn dat de stroom in de gewenste richting gaat.

Draai klep één op de klepregelaar en observeer de stimulusstroom die in de microfluïdische arena stroomt. Als de stroom uit balans is, past u de reservoirhoogten aan. Breng de jongvolwassen dieren over op een ongezaaid nematodengroeimedium of NGM-agarplaat met behulp van een draadpuntprikker en overspoel de plaat vervolgens met ongeveer vijf milliliter van één XS-basale buffer, zodat de dieren kunnen zwemmen.

Zuig de wormen op in een laadspuit van één tot drie milliliter met behulp van de bijgevoegde slang die is voorgevuld met één XS-basale buffer. Beweeg met behulp van een stereoscoop de slang met één hand onder het vloeistofoppervlak naar elk gewenst dier en trek deze in de slang met behulp van de spuit in de andere hand. Sluit de omtrek van de uitlaat, verwijder de wormlaadpen en sluit de wormlaadspuit aan op het apparaat met behulp van een drop-to-drop-verbinding.

Laat de dieren vervolgens zachtjes de arena in stromen. Stel een bufferstroom in en laat maximaal een uur immobilisatie door tetramisol instellen. Maak met de teksteditor een stimulusdefinitietekstbestand met de naam userdefinedacquisitionsettings.

txt met de stimulatie-instellingen voor de geautomatiseerde beeldacquisitie. Dit bestand definieert microscoopacquisitieparameters zoals belichtings- en excitatietiming, studieduur, intervallen en opslagmap. Het definieert ook het experimenttype en de instellingen voor stimulatietiming.

Gebruik voor een enkel stimulusexperiment een indeling met slechts één herhaalde stimulatieopdracht. Gebruik voor een experiment met meerdere patronen een indeling met meerdere stimulatieopdrachten door een patroonreeks cijfers op te nemen die de volgorde van de stimuluspatronen vertegenwoordigt. Voer voor elk patroon een stimulatieopdracht in op een afzonderlijke regel.

Voer vervolgens de microscoopbesturingssoftware uit. Controleer of alle vloeistofinlaten open zijn, de stroom gewenst is in de arena en de neuronen van belang in focus zijn binnen het live-venster. Sluit vervolgens het live-venster en voer het script multipatternrunscript uit.

BSH binnen de software. Om de gegevens te analyseren, voert u NeuroTracker uit door achtereenvolgens op plug-ins te klikken, vervolgens op tracking en vervolgens op NeuroTracker. Selecteer de map met de tiff-videobestanden die moeten worden bijgehouden en selecteer het bereik van de bestanden die moeten worden verwerkt.

Open vervolgens met behulp van de afbeelding en pas menu's de helderheidscontrast- en drempelregelvensters open. Controleer de donkere achtergrond en stel het bereik niet opnieuw in in het drempelvenster, waarbij u de drempelmethode instelt op standaard en de visualisatie op rood. Klik vervolgens op automatisch in het helderheidscontrastvenster voor neuronzichtbaarheid.

Pas in het helderheidscontrastvenster de minimale en maximale schuifregelaars aan totdat de neuronen duidelijk te onderscheiden zijn. Pas vervolgens het drempelniveau aan totdat alle neuronen verschijnen als kleine rode vlekken gescheiden van andere objecten. Pas de frameschuifregelaar aan om de beweging en intensiteitsveranderingen van het neuron te observeren, waarbij u merkt dat dieren moeten worden uitgesloten van tracking, bijvoorbeeld vanwege overlap met andere dieren.

Na het identificeren van de neuronen voor tracking, past u indien nodig het drempelniveau voor elk dier aan, zodat het rode drempelgebied boven het neuron in elk frame zichtbaar is. Klik op het neuron om de positie en het drempelniveau vast te leggen. Wanneer alle neuronen zijn geselecteerd, drukt u op de spatiebalk om te beginnen met volgen.

Bewaak het volgproces voor elk dier en breng de nodige correcties aan. Als NeuroTracker pauzeert, verliest het het neuron. Pas het drempelniveau indien nodig aan en klik opnieuw op het neuron.

Als het integratievak naar een andere nabijgelegen dierlijke of niet-neuronale structuur springt, drukt u op de spatiebalk om te pauzeren. Verplaats de schuifregelaar terug naar het eerste foutieve frame en klik opnieuw op de juiste neuronlocatie. Voer de neurotrackersummarypdf uit.

m in MATLAB en selecteer de map met de NeuroTracker-gegevenstekstbestanden. Wacht tot er een overzichts-PDF wordt gegenereerd, zodat het trackingproces kan worden geverifieerd. De dieren kunnen worden geïdentificeerd aan de hand van de aantallen en de neurale reacties van elk dier en elke proef en kunnen worden bekeken om de populatievariabiliteit te beoordelen.

Gebruik de functie databrowse. m om de neurale gegevens te verkennen, gegroepeerd op proefnummer, diernummer, stimulatiepatroon of op een andere categorie. Het temporele remmingsfenomeen werd getest in een gepaard pulsexperiment dat acht patronen produceerde die bestonden uit twee geurpulsen van één seconde, gescheiden door een interval variërend van nul tot 20 seconden.

De eerste geurpuls van één seconde veroorzaakte een gelijke responsgrootte in de diacetyl die AWA-neuronen detecteerde en reacties in de tweede puls varieerden met het interstimulusinterval. Ontremming werd beoordeeld door het catch trial experiment waarbij aanpassing aan de diacetylstimulus werd waargenomen, maar de presentatie van de nieuwe 2-methylpyrazine stimulus veroorzaakte geen sterk ontremmingseffect. De geteste multimodale stimulatie toonde aan dat chemische stimulatie alleen aanpassing veroorzaakte, terwijl optische stimulatie alleen dat niet deed.

Het gecombineerde multimodale stimuluspatroon toonde echter aan dat optogene responsen gevoelig waren voor chemisch geïnduceerde aanpassing. Door het microfluïdische ontwerp aan te passen om twee arena's op te nemen, kunnen we genetische of andere verstoringen tegelijkertijd vergelijken met een gematchte referentie. Eenmaal ingesteld, kan het systeem op vele manieren worden gewijzigd.

We hebben bijvoorbeeld automatisch chemische dosisresponsen en toestandsafhankelijke veranderingen in neurale activiteit gemeten, zoals tussen slaap- en waaktoestanden.