Een muismodel van chronische leverfibrose voor de studie van galatresie

We hebben deze methode met succes gebruikt om een muismodel te maken dat meer consistent is met de pathologische veranderingen van de galatresie. Deze techniek kan de symptomen van acute en chronische galatresie simuleren, wat nuttig is voor toekomstig onderzoek naar ziektemechanismen. Na het gebruik van antilichamen werd de overlevingstijd van de muizen verlengd en werden de symptomen verlicht, wat het therapeutische effect van antilichamen op galatresie suggereert.

Na het verdelen van neonatale muizen in verschillende groepen, zoals beschreven in het manuscript, voorbehandel elke muis met een intraperitoneale injectie van vijf microgram anti-Ly6G-antilichaam vier uur vóór de rhesusrotavirus- of RRV-injectie om Gr1-positieve cellen uit te putten. Injecteer de neonatale muis binnen 24 uur na de geboorte intraperitoneaal met 20 microliter rhesusrotavirus of zoutoplossing. Dien na de RRV-injectie 20 microgram anti-Ly6G-antilichaam toe in de buik van de muis.

Controleer en registreer dagelijks het uiterlijk, het gewicht en de overleving van alle muizen. Voor intraperitoneale injectie stelt u de buik van de jonge muis bloot door de nekhuid met de wijsvinger en duim van één hand samen te knijpen en de achterpoten van de muis voorzichtig vast te houden met de ringvinger en staartvinger. Til de naald van de spuit op in een opwaartse helling en steek de naald in de middelste dij van de rechterachterpoot van de muis in een hoek van 15 graden met de huid.

Terwijl u de naald langs het onderhuidse pad beweegt totdat deze de rechter ribbelrand van de muis bereikt, richt u de naald naar beneden in de buikholte en injecteert u de vloeistof onder de lever van de muis. Trek de naald onmiddellijk na de injectie uit. Let op bloedingen of lekkage op de injectieplaats.

Na het verdoven van de muis op de 12e dag, ontleed je hem onder een microscoop. Plaats een insulinespuit van één milliliter in de linkerkamer van het hart om bloed te verzamelen. Centrifugeer het bloed gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur op 400 g en scheid het serum voor leverfunctiemetingen.

Ontleed de muizenlever en milt van de omliggende weefsels met een schaar en een pincet. Fotografeer het algemene uiterlijk van de lever en galwegen. Stel na inhalatie-anesthesie de lever, galblaas en extrahepatische galwegen bloot met een schaar en wattenstaafjes.

Injecteer onder een houdingsmicroscoop vijf tot 10 microliter van de fluorescerende kleurstof Rhodamine 123 in de galblaas met een insulinespuit van één milliliter en maak foto's. Dompel vers muizenleverweefsel gedurende 24 uur onder in 10% formaline. Zodra het weefsel is ingebed in paraffine, gebruikt u een paraffinemicrotoom om het paraffineblok in secties met een dikte van vier micrometer te snijden en plaatst u twee opeenvolgende secties op dezelfde dia.

Plaats de plakjes vervolgens in een snijrek, ontwas ze in xyleen en hydrateer ze achtereenvolgens in absolute ethanol, 95% ethanol, 80% ethanol, 70% ethanol en gedestilleerd water gedurende vijf minuten elk. Kleur de secties gedurende vijf minuten met hematoxyline-oplossing en week ze gedurende vijf seconden in 1% zoutzuur en 75% alcohol. Nadat u de secties met schoon water hebt gespoeld, kleurt u ze gedurende één minuut met eosine-oplossing.

Bereid de weefselsecties voor op kleuring, zoals eerder aangetoond, en voer antigeenherstel uit met Tris-EDTA-buffer. Verwarm de secties in een magnetron op 95 graden Celsius gedurende 10 minuten, verwijder ze vervolgens en koel ze op natuurlijke wijze af tot kamertemperatuur. Om endogene peroxidase te verwijderen, plaatst u de weefselsecties gedurende 10 minuten in 3% waterstofperoxide en behandelt u de plakjes met 5% geitenserum om niet-specifieke binding te blokkeren.

Voeg vervolgens primair anti-muis cytokeratine 19 of rat anti-muis F4/80 monoklonaal antilichaam toe aan de secties en incubeer 's nachts bij vier graden Celsius. Incubeer de secties met geschikte secundaire antilichamen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik 3, 3-prime-diaminobenzidine als chromogeen middel om de chromogene reactie onder de microscoop te observeren.

Observeer de plakjes onder een 40x microscoop om foto's te verkrijgen en analyseer ze indien nodig. Zodra de weefselsecties zijn voorbereid en gecounterd met hematoxyline, bedek elk weefsel met 50 microliter sirius rode kleurstofoplossing bij kamertemperatuur gedurende een uur. Droog de dia's op natuurlijke wijze op kamertemperatuur gedurende vier uur, voeg een druppel neutrale kauwgom toe aan elke dia en gebruik een afdekstrook om het weefsel te bedekken om bubbels te voorkomen.

Laat de glaasjes 24 uur op kamertemperatuur staan om de neutrale kauwgom te stollen. Observeer de collageenafzettingsdetails met behulp van gepolariseerde contrastlichtmicroscopie. Selecteer een duidelijk en geschikt gezichtsveld en pas de helderheid en witbalans van het gezichtsveld van de microscoop aan.

Verkrijg afbeeldingen en analyseer ze indien nodig onder een 40x microscoop. Na RRV-injectie was de mediane overlevingstijd in de RRV-groep 13 dagen. De meeste muizen die met het antilichaam werden behandeld, ontwikkelden milde geelzucht en er werd geen gewichtsverlies waargenomen.

De levers van BA-muizen vertoonden necrotische laesies en een extrahepatisch segment van galwegatresie. De grootte van de lever is kleiner dan de controles. Histologische analyse toonde aan dat lage dosis anti-Ly6G-therapie verminderde poortaderontsteking.

Op dag 42 werd nog steeds inflammatoire celaccumulatie waargenomen in de plakjes leverweefsel. Op dag 12 was er een lichte toename van collageenafzetting in het portaalgebied. Op dag 42 was de collageenexpressie aanzienlijk verhoogd en werd een aanzienlijke collageenafzetting waargenomen in het BA-weefsel.

De CK19-positieve cellen werden waargenomen op dag 12. Op dag 42 namen CK19-positieve cellen toe, maar er waren weinig rijpe galwegen. De extrahepatische galwegen bij chronische BA-muizen waren geblokkeerd en hadden inflammatoire infiltraten van microfagen.

De ALT- en ALP-waarden in de lever waren hoger in de chronische BA-groep dan in de normale controlegroep. De totale bilirubine-, directe bilirubine- en indirecte bilirubinespiegels waren verhoogd, wat aangeeft dat de leverfunctie significant was verminderd in het chronische fibrosestadium van BA. De injectie moet met voorzichtigheid worden gedaan om de lever van de muis niet te doorboren. Na de injectie moeten we ongeveer 10 seconden nemen om de toestand van de muis te observeren en het bloed uit de wond te reinigen.