Ontwikkeling van een ⁶⁸gallium-gelabelde D-peptide PET-tracer voor beeldvorming van geprogrammeerde dood-ligand 1-expressie

Deze methode maakt gebruik van D-peptide DPA, gelabeld met Gallium-68. De radiotracer Gallium-68 om de DPA te labelen maakt real-time visualisatie van PDL-1-expressie in het hele lichaam op een niet-invasieve manier mogelijk. Het gebruik van D-peptide geeft de radiotracer hyperresistent tegen proteolytische afbraak en verlengt opmerkelijk hun metabole halfwaardetijd.

In het bijzonder kan de techniek worden toegepast om verschillende ziekten te evalueren, afhankelijk van de ontdekking van specifieke doelen en de ontwikkeling van radiotracers met een goede kinetiek van telefoongesprekken. De techniek kan ook worden toegepast op de behandeling van PDL-1-positieve tumoren, terwijl DPA wordt gelabeld met andere radionucleotiden, zoals lutetium-177 en actinium-225. Wu Jiang, een onderzoeker uit mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren.

Voor het radioactief labelen van de peptide d-dodecapeptide-antagonist, of DPA, pipetteer vijf microliter van de voorbereide voorraadbuffer met DPA in een polypropyleencontainer van 1,5 milliliter met een schroefdop en voeg 400 microliter 68 galliumtrichloride toe aan de container. Draai het mengsel vijf seconden in een draaikolf. Meet de pH van het mengsel met behulp van pH-teststrips en stel de pH in op 4 tot 4,5 met 0,1 molair natriumhydroxide.

Incubeer de oplossing vijf tot 10 minuten bij kamertemperatuur. Onderwerp, volgens de in de tekst genoemde voorwaarden, het reactiemengsel vervolgens aan radioactieve HPLC voor het analyseren van de opbrengst van radioactieve labeling. Om de stabiliteit van de tracer in PBS te testen, voegt u 10 microliter gallium-68-gelabelde DPA in natriumacetaatoplossing toe aan 990 microliter PBS.

Incubeer het mengsel bij 37 graden Celsius gedurende één, twee en vier uur, met lichte agitatie. Verzamel 200 microliter van de oplossing op elk genoemd tijdstip en analyseer deze met behulp van radio-HPLC. Om de stabiliteit van de tracer in muizenserum te testen, voegt u 10 microliter gallium-68-gelabelde DPA in natriumacetaatoplossing toe aan 90 microliter van het vers bereide muizenserum en incubeert u het mengsel bij 37 graden Celsius gedurende één, twee en vier uur met lichte agitatie.

Verzamel vervolgens 20 microliter van de oplossing op elk genoemd tijdstip en voeg 100 microliter acetonitrilwatermengsel toe aan het verzamelde aliquot. Centrifugeer het mengsel bij 5.000 G gedurende 10 minuten bij 25 graden Celsius. Analyseer het supernatans met behulp van radio-HPLC.

Kweek de U-87 MG-cellen in platen met 12 putjes totdat 80% confluentie is bereikt. Verwijder vervolgens het medium en was de cellen met 0,5 milliliter PBS. Verdun de DPA met gallium-68-label in vers medium tot een concentratie van 74 kilobecquerel per milliliter.

Voeg vervolgens 0,5 milliliter van de verdunde Gallium-68-gelabelde DPA-buffer toe aan elk putje. Incubeer de cellen met Gallium-68-gelabelde DPA bij 37 graden Celsius voor de duur van 10, 30, 40 en 120 minuten. Zuig het medium na incubatie op met een pipet en was de cellen driemaal met 0,5 milliliter PBS.

Voeg vervolgens 300 microliter 0,5 molaire natriumhydroxideoplossing per putje toe om de cellen te lyseren. Verzamel na 30 seconden de stroperige cellysaten in buisjes van 1,5 milliliter. Was de plaat door twee keer 0,4 milliliter PBS per putje toe te voegen en vang de wasoplossing op in de genoemde buizen van 1,5 milliliter.

Start de ingebouwde computer van de automatische gammateller en plaats de buizen in de ingebouwde plank. Nadat u alle monsters op de transportband hebt geladen, drukt u op de startknop. De resultaten worden berekend in de interne software, terwijl de uitlezing de vervalgecorreleerde tellingen per minuut, of CPM, van elke buis registreert.

Verzamel de U-87 MG-cellen volgens het protocol dat in de tekst wordt vermeld en zuig de cellen op in een spuit van 0,5 milliliter. Neem vervolgens BALB/c Naakte muizen en injecteer de cellen subcutaan, waarbij u een telling van twee tumoren per muis handhaaft. Bewaak de tumorgroei na injectie totdat het tumorvolume 100 tot 300 kubieke millimeter is.

Om PET-beeldvorming uit te voeren, injecteert u de tracers intraveneus via een vooraf geïnstalleerde staartaderkatheter. Maak een scanworkflow op een hostcomputer met behulp van de referentiesoftware, gevolgd door het maken van een studiemap en het instellen van het acquisitieprotocol volgens de richtlijnen van de fabrikant. Voer gedurende 60 minuten dynamische scans uit op elke muis in de 3D-lijstmodus.

Definieer vervolgens een histogramprotocol en een reconstructieprotocol, volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik het filter van Hanning met een Nyquist-cutoff van 0,5 cycli per pixel om dynamische PET-beelden gedurende 25 tot 30 minuten te reconstrueren, en 55 tot 60 minuten door middel van gefilterde terugprojectie. Genereer projectie met maximale intensiteit, of MIP-beelden, voor alle muizen.

Dien Gallium-68-gelabelde DPA toe aan de U-87 MG dragende BALB/c Naakte muizen via staartaderinjectie. Ontleed na euthanasie de borstwand van het dier en open het hart. Gebruik een spuit van één milliliter om bloed af te nemen en het bloed uit de spuit in een radio-immunoassaybuis, of RIA, te persen met een diameter van 13 millimeter voor de gammateller.

Snijd de belangrijkste organen en tumoren weg en plaats ze in vergelijkbare RIA-buisjes voor de gammateller. Weeg alle belangrijke organen die in de tekst worden genoemd. Meet de radioactiviteit in de verzamelde organen met behulp van een automatische gammateller en corrigeer de waarden van het verval.

Bereken het percentage geïnjecteerde dosis per gram nat weefsel. De Gallium-68-gelabelde DPA vertoonde een hoge radiochemische opbrengstonzuiverheid. Het was zeer stabiel in zowel PBS- als muizenserum en vertoonde geen gallium-68-afbraak of peptidehydrolyse na de incubatie van vier uur.

Ongeveer 60% van de U-87 MG-cellen bleek geprogrammeerd te zijn om ligand één te doden, of PDL-1-positief door flowcytometrie, en immunofluorescerende kleuring bevestigde een sterke expressie van PDL-1 in de U-87 MG-cellen. U-87 MG-cellen vertoonden een tijdsafhankelijke opname van gallium-68-gelabeld DPA, die aanzienlijk verminderde bij gebruik van een PDL-1-remmer, BMS-202, als blokker. De geschatte bindingsaffiniteit voor BMS-202 was 43,8 nanomol per liter wanneer Gallium-68-gelabeld DPA als concurrent werd gebruikt.

PET-beelden van het hele lichaam toonden een hoge Gallium-68-gelabelde DPA-accumulatie in de tumor na 30 en 60 minuten injectie. Een parallel experiment toonde weinig Gallium-68-gelabelde DPA-accumulatie aan in de negatieve controle Bon-1-tumoren 60 minuten na injectie. Verder bleek uit immunohistochemische kleuring dat de U-87 MG-cellen een aanzienlijke PDL-1-expressie vertoonden, maar niet de Bon-1-tumor.

Hematoxyline- en eosinekleuring vertoonden een vergelijkbare celmorfologie tussen de twee tumorweefsels. De ex-vivo biodistributiestudie toonde een snelle klaring van radioactiviteit en bloed in de meeste geanalyseerde organen, waaronder het hart, de lever, de longen en de spieren. De nier accumuleerde de hoogste hoeveelheid radioactiviteit, terwijl de tumor op alle tijdstippen de op één na hoogste traceropname vertoonde.

De structuur van D-peptide is anders met behulp van een efficiënte methode voor het labelen van DPA met gallium-68 de belangrijkste stap. Deze techniek maakte de weg vrij om de PET-test te gebruiken als effectieve radiofarmaceutica voor de behandeling van verschillende vormen van kanker, zowel als PET-tracers als als radiodiagnostisch middel.