Visualisatie van organellen in situ door cryo-STEM tomografie

TEM-tomografie wordt veel gebruikt voor beeldvorming van cellen, maar het is zeer beperkt in termen van monsterdikte. FIB SEM en zachte röntgentomografie kunnen worden gebruikt voor grotere monsters, zij het met een lagere resolutie. STEM-tomografie vult deze leemte perfect op.

STEM-tomografie biedt een blik op micron dikke monsters met een resolutie van enkele nanometers. De combinatie met cryogene bereiding laat ons biologische monsters en secties in 3D bekijken. Bekijk de basisprincipes van STEM-optica om beeldvorming te begrijpen en ervoor te zorgen dat de servicetechnicus de stuurpen- en Lomax-stammodi goed heeft uitgelijnd en dat de kalibratiestappen eruitzien als die in de video.

Laad om te beginnen het kolomuitlijningsbestand en open de kolomwaarden. Als u een cryohouder aan de zijkant gebruikt, opent u het cryo-schild en start u in de TEM-modus. De straal moet op het scherm verschijnen.

Verlaag de vergroting als de bundel niet verschijnt. Breng de microscoop naar eucentrische focus door op de knop op het bedieningspaneel te drukken. Stel de spotgrootte in op een handige waarde voor het direct visualiseren van het fluorescerende scherm of met de ingebouwde camera.

Zet de microscoop op de STEM-modus en controleer of de scherpstelling de condensorlenzen gebruikt in plaats van het objectief. Stel op het paneel de eucentrische focus in en ga uit de diffractiemodus voor initiële aanpassingen. Zorg ervoor dat de straal niet leeg is en verklein de vergroting totdat de straal op het scherm verschijnt.

Pas de bundelverschuiving naar het midden aan en verhoog de vergroting in stappen tot 70.000, terwijl de bundel in het midden blijft. Plaats vervolgens de gewenste condensoropening, meestal 50 micrometer voor de microsondemodus, en controleer de opening centreren. Terwijl je de scherpstelknop heen en weer draait, moet de spot uitzetten en samentrekken, maar op zijn plaats blijven, alsof een vlak een denkbeeldige verticale zandloper snijdt.

Als het diafragma niet gecentreerd is, zal de verlichting zijdelings verschuiven alsof de zandloper gekanteld is. Breng de bundel scherp, druk op de intensiteitslijstfocus op het tabblad Uitlijningen of keer terug naar eucentrische focus. Stel de positie van de bundel opnieuw in op het midden en pas het rotatiecentrum aan.

Draai nu het focusstapwiel naar het minimum, of een stap erboven, zodat de bundel zachtjes pulseert en ervoor zorgt dat deze stationair blijft terwijl de focus op en neer beweegt. Selecteer de draaipunten en breng de twee punten samen met X- en Y-aanpassingen. Pas de condensorstigmators aan om de balk rond te maken.

Ga op en neer door focus om te optimaliseren. Er mag geen neiging zijn om in de ene of de andere richting uit te rekken bij het passeren van de focus. Normaliseer de lenzen, verhoog vervolgens de vergroting geleidelijk tot ongeveer 240.000, terwijl u de bundelverschuiving gebruikt om de vlek gecentreerd te houden en de rotatiecentrum- en draaipuntaanpassingen te herhalen.

Ga terug naar de diffractiemodus. In dit stadium moet de bundel als een uniforme schijf op het fluorescerende scherm verschijnen. De cameralengte regelt nu effectief de optische afstand tot de detector als een röntgenkristallografie.

Wijzig het en kijk hoe de schijf samentrekt en vergroot alsof de schermlocatie naar of van het monster zou bewegen. Deze kegel vertegenwoordigt de brightfield-verlichting. Om de STEM-modus bij hoge vergroting in te schakelen, begint u met de brightfield-stamdetector en past u de diffractie-uitlijning aan om de bundel te centreren met behulp van de gewenste cameralengte.

Schakel de brightfield-markering op het scherm in, verklein de cameralengte tot 330, til het scherm op en plaats de detectoren. Start een scan in de microscoopsoftware. Gebruik de scopeweergave om te helpen bij het aanpassen van de helderheids- en contrastinstellingen zoals beschreven in het manuscript.

Herhaal de aanpassing meerdere keren. Breng de microscoop terug naar een relatief lage vergroting in het hoge vergrotingsregister, zonder in de lage vergrotingsmodus te gaan. Plaats het fluorescerende scherm en noteer de schermstroom ter referentie.

Net als bij TEM kan de stroom worden gewijzigd met de pistoollens en de spotgrootte-instellingen met toenemende aantallen die overeenkomen met een verminderde stroom. Sla op dit punt een FEG-register op om een terugkeer naar standaardwaarden te vergemakkelijken. Ga naar de LMTEM-modus om het exemplaar te zien.

Plaats het monster. Breng het monster op eucentrische hoogte. Er zijn verschillende methoden om dit te doen.

Gebruik bijvoorbeeld de werknaalwiebelaar om het raster te kantelen terwijl u de monsterhoogte langs de Z-as beweegt totdat de afbeelding niet meer zijdelings verschuift. U kunt ook enkele functies op het weergavescherm markeren en het podium tot 10 tot 30 graden kantelen. De functie beweegt zijdelings.

Pas de hoogte van het monster aan om het terug te brengen naar de oorspronkelijke positie. Verhoog de vergroting of de kanteling van het podium om de kanteling te verfijnen en terug te brengen naar nul graden. Ga nu terug naar de STEM-modus en plaats de STEM-detector.

Zorg ervoor dat LM-scan inschakelen is uitgeschakeld. Ga naar de laagste hoge vergrotingsmodus. Stem het astigmatisme van de condensor af volgens de methode.

Stel met de bundel over een dun monstergebied scherp op het punt waar de uitgezonden bundel opblaast tussen schaduwbeelden van het monster aan weerszijden. Pas vervolgens de condensorafstemming aan om de centrale schijf rond te maken. Dit vereist enige oefening, vooral voor cryogene monsters.

Ga terug naar het diafragma van 50 micrometer en werk het FEG-register bij. Ga naar de LMSTEM-modus en ga verder met scannen om een interessant gebied te vinden. Pas indien nodig de helderheids- en contrastinstellingen van de detector ongeveer op dit punt aan.

Druk op eucentrische focus, verhoog de vergroting en verfijn de focus tijdens het scannen met behulp van de focuslus van de microscoop en controleer het astigmatisme op gouden kralen. Tot nu toe wordt alles uitgevoerd in nano-sondemodus. Merk op dat het plaatsen van een kleiner condensordiafragma de semi-convergentiehoek vermindert, wat handig is voor dikke monsters.

Een alternatieve benadering met TFS-instrumenten is om over te schakelen naar de micro-sondemodus, wat leidt tot een verminderde semi-convergentiehoek. Pas vervolgens de cameralengte aan om de verzamelhoek drie keer groter te maken dan de convergentiehoek; d.w.z. de BF-detectorgebiedmarkeringen op het scherm zijn ongeveer drie keer groter dan de straal.

Schat de dosis voor registratie met behulp van een vergelijking. Als vuistregel geldt dat je voor de hele tomograaf 100 tot 150 elektronen per vierkante inktstrom moet mikken. Breng het podium terug naar een geheel en pas de straalstroom aan met behulp van spotgrootte en of pistoollensinstellingen om de gewenste schermstroom te bereiken.

Volledige lage vergrotingsrasterkaart opgenomen in STEM-modus toont de gebieden met cellen van belang. Cellen lijken gedeeltelijk helder met elektronen verspreid in de richting van de HAADF-detector. Op een kaart met een gemiddelde resolutie die in de STEM-modus is opgenomen, worden twee ankerkaarten met een gemiddelde resolutie weergegeven.

Nul graden kanteling van een stengelkantelingsreeks maakte de visualisatie van de calciumfosfaatafzettingen, cristae en gouden fiduciale markers van een mitochondrion mogelijk. Volumeweergave van 60 nanometer en 40 nanometer dikke secties worden weergegeven. Cryostamtomografie, of CSTET, biedt een brug tussen structurele biologie en celbiologie, evenals een context voor superresolutiefluorescentie.

Zonder de noodzaak van secties of lamellenvoorbereiding, kunnen we het hele cellulaire theater in een bijna inheemse staat zien.