Name: Visualisatie van organellen in situ door cryo-STEM tomografie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T12:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Ontdek cryo-STEM tomografie voor 3D-beeldvorming van organellen in intacte cellen met nanometerresolutie. Deze niet-invasieve methode behoudt biologische structuren in hun natuurlijke toestand.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn zeer dankbaar voor de voortdurende en constante steun van de auteur en onderhouder van het SerialEM-softwarepakket, David Mastronade en Günther Resch. P.K. werd gefinancierd door het Oostenrijkse Wetenschapsfonds (FWF) via een Schrödinger Fellowship J4449-B. Met het oog op open toegang hebben de auteurs een CC-BY publieke auteursrechtlicentie toegepast op elke door de auteur geaccepteerde manuscriptversie die voortvloeit uit deze inzending. M.E. en S.G.W. erkennen financiering van de Israel Science Foundation, subsidie nr. 1696/18, en van het Horizon 2020 Twinning-project van de Europese Unie, ImpaCT (subsidie nr.857203). M.E. erkent financiering van de ERC in het CryoSTEM-project (subsidie nr. 101055413). ME is de zittende van de Sam en Ayala Zacks Professorial Chair en hoofd van het Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging. Het laboratorium van ME heeft geprofiteerd van de historische vrijgevigheid van de familie Harold Perlman. We erkennen ook de financiering door de Europese Unie. De geuite standpunten en meningen zijn echter uitsluitend die van de auteur(s) en komen niet noodzakelijkerwijs overeen met die van de Europese Unie of het Uitvoerend Agentschap van de Europese Onderzoeksraad. Noch de Europese Unie, noch de subsidieverlenende autoriteit kan hiervoor verantwoordelijk worden gehouden.

<ol><li>Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+horizons+of+cryo-tomography+to+larger+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Expanding horizons of cryo-tomography to larger volumes.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 155-161 (2018).</li>
<li>Schertel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo+FIB-SEM%3A+Volume+imaging+of+cellular+ultrastructure+in+native+frozen+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens.</a> Journal of Structural Biology. 184 (2), 355-360 (2013).</li>
<li>Do, M., Isaacson, S. A., McDermott, G., Le Gros, M. A., Larabell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+characterizing+cells+using+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Imaging and characterizing cells using tomography.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 581, 111-121 (2015).</li>
<li>Groen, J., Conesa, J. J., Valcárcel, R., Pereiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+landscape+by+cryo+soft+X-ray+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">The cellular landscape by cryo soft X-ray tomography.</a> Biophysical Reviews. 11 (4), 611-619 (2019).</li>
<li>Kapishnikov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+nucleation+of+hemozoin+at+the+digestive+vacuole+membrane+in+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Oriented nucleation of hemozoin at the digestive vacuole membrane in Plasmodium falciparum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11188-11193 (2012).</li>
<li>Kapishnikov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+heme+detoxification+in+the+malaria+parasite+by+in+situ+correlative+X-ray+fluorescence+microscopy+and+soft+X-ray+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Unraveling heme detoxification in the malaria parasite by in situ correlative X-ray fluorescence microscopy and soft X-ray tomography.</a> Scientific Reports. 7 (1), (2017).</li>
<li>Sviben, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vacuole-like+compartment+concentrates+a+disordered+calcium+phase+in+a+key+coccolithophorid+alga%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A vacuole-like compartment concentrates a disordered calcium phase in a key coccolithophorid alga.</a> Nature Communications. 7, 11228(2016).</li>
<li>Wan, W., Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography and subtomogram averaging.</a> Methods in Enzymology. , 329-367 (2016).</li>
<li>Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging+and+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Advances in cryo-electron tomography and subtomogram averaging and classification.</a> Current Opinion in Structural Biology. 58, 249-258 (2019).</li>
<li>Bäuerlein, F. J. B., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+visual+proteomics+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards visual proteomics at high resolution.</a> Journal of Molecular Biology. 433 (20), 167187(2021).</li>
<li>Elbaum, M., Seifer, S., Houben, L., Wolf, S. G., Rez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+compositional+contrast+by+cryo-STEM%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Toward compositional contrast by cryo-STEM.</a> Accounts of Chemical Research. 54 (19), 3621-3631 (2021).</li>
<li>Elbaum, M., Wolf, S. G., Houben, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-scanning+transmission+electron+tomography+of+biological+cells%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Cryo-scanning transmission electron tomography of biological cells.</a> MRS Bulletin. 41 (7), 542-548 (2016).</li>
<li>Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-scanning+transmission+electron+tomography+of+vitrified+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cryo-scanning transmission electron tomography of vitrified cells.</a> Nature Methods. 11 (4), 423-428 (2014).</li>
<li>Houben, L., Weissman, H., Wolf, S. G., Rybtchinski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+of+ferritin+crystallization+revealed+by+cryo-STEM+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mechanism of ferritin crystallization revealed by cryo-STEM tomography.</a> Nature. 579 (7800), 540-543 (2020).</li>
<li>Li, Y., Huang, W., Li, Y., Chiu, W., Cui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+for+cryogenic+electron+microscopy+in+materials+science+and+nanoscience%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience.</a> ACS Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).</li>
<li>Hohmann-Marriott, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+3D+cellular+imaging+by+axial+scanning+transmission+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography.</a> Nature Methods. 6 (10), 729-731 (2009).</li>
<li>Engel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+transmission+electron+microscopy%3A+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Imaging+and+Electron+Physics%22%5BJournal%5D)">Scanning transmission electron microscopy: biological applications.</a> Advances in Imaging and Electron Physics. 159, 357-386 (2009).</li>
<li>Wolf, S. G., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoSTEM+tomography+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">CryoSTEM tomography in biology.</a> Methods in Cell Biology. 152, 197-215 (2019).</li>
<li>Biskupek, J., Leschner, J., Walther, P., Kaiser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+STEM+tomography+acquisition-A+comparison+of+convergent+beam+and+parallel+beam+STEM+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Optimization of STEM tomography acquisition-A comparison of convergent beam and parallel beam STEM tomography.</a> Ultramicroscopy. 110 (9), 1231-1237 (2010).</li>
<li>Trepout, S., Messaoudi, C., Perrot, S., Bastin, P., Marco, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+transmission+electron+microscopy+through-focal+tilt-series+on+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Scanning transmission electron microscopy through-focal tilt-series on biological specimens.</a> Micron. 77, 9-15 (2015).</li>
<li>Rez, P., Larsen, T., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+theoretical+basis+and+limitations+of+cryo-STEM+tomography+for+thick+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Exploring the theoretical basis and limitations of cryo-STEM tomography for thick biological specimens.</a> Journal of Structural Biology. 196 (3), 466-478 (2016).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li>
<li>Sheng, Y., Morris, K., Radecke, J., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography+remote+data+collection+and+subtomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (185), e63923(2022).</li>
<li>Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+optimization+of+cryogenic+electron+tomography+data+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition.</a> Journal of Visualized Experiments. (169), e62383(2021).</li>
<li>O'Toole, E., vander Heide, P., McIntosh, J. R., Mastronarde, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+electron+tomography+of+cells+using+SerialEM+and+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Imaging%3A+Electron+Tomography+and+Related+Techniques%22%5BJournal%5D)">Large-scale electron tomography of cells using SerialEM and IMOD.</a> Cellular Imaging: Electron Tomography and Related Techniques. , 95-116 (2018).</li>
<li>Zheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AreTOMO%3A+An+integrated+software+package+for+automated+marker-free%2C+motion-corrected+cryo-electron+tomographic+alignment+and+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">AreTOMO: An integrated software package for automated marker-free, motion-corrected cryo-electron tomographic alignment and reconstruction.</a> Journal of Structural Biology. (6), 100068(2022).</li>
<li>Seifer, S., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClusterAlign%3A+A+fiducial+tracking+and+tilt+series+alignment+tool+for+thick+sample+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Imaging%22%5BJournal%5D)">ClusterAlign: A fiducial tracking and tilt series alignment tool for thick sample tomography.</a> Biological Imaging. 2, 7(2022).</li>
<li>Waugh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+deconvolution+processing+for+STEM+cryotomography%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional deconvolution processing for STEM cryotomography.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (44), 27374-27380 (2020).</li>
<li>Kirchenbuechler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-STEM+tomography+of+intact+vitrified+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Cryo-STEM tomography of intact vitrified fibroblasts.</a> AIMS Biophysics. 2 (3), 259-273 (2015).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Lazić, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM+structures+from+iDPC-STEM+at+near-atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM structures from iDPC-STEM at near-atomic resolution.</a> Nature Methods. 19 (9), 1126-1136 (2022).</li>
<li>Seifer, S., Houben, L., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+STEM+with+simultaneous+phase+and+depth+contrast%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Flexible STEM with simultaneous phase and depth contrast.</a> Microscopy and Microanalysis. , 1-12 (2021).</li>
<li>Ophus, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-dimensional+scanning+transmission+electron+microscopy+%284D-STEM%29%3A+from+scanning+nanodiffraction+to+ptychography+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Four-dimensional scanning transmission electron microscopy (4D-STEM): from scanning nanodiffraction to ptychography and beyond.</a> Microscopy and Microanalysis. 25 (3), 563-582 (2019).</li>
<li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+phase+retrieval+of+biological+specimens+using+cryo-electron+ptychography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Low-dose phase retrieval of biological specimens using cryo-electron ptychography.</a> Nature Communications. 11 (1), 2773(2020).</li>
<li>Nellist, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+principles+of+STEM+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Transmission+Electron+Microscopy%3A+Imaging+and+Analysis%22%5BJournal%5D)">The principles of STEM imaging.</a> Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging and Analysis. , 91-115 (2011).</li>
<li>Elad, N., Bellapadrona, G., Houben, L., Sagi, I., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+isolated+protein-bound+metal+ions+by+single-particle+cryo-STEM%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Detection of isolated protein-bound metal ions by single-particle cryo-STEM.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (42), 11139-11144 (2017).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

Het protocol moet biowetenschappelijke microscopisten helpen die geïnteresseerd zijn in het verkrijgen van een 3D-beeld van intracellulaire organellen in regio's van de cel die niet toegankelijk zijn voor conventionele TEM-tomografie. Hetzelfde protocol kan ook worden gebruikt voor STEM-tomografie van plastic secties, met versoepelde beperkingen op de blootstelling. Het protocol moet worden beschouwd als een uitgangspunt in plaats van een reeks harde regels. De kracht van STEM is inderdaad de flexibiliteit ervan; Er is niet één juiste manier om het te bedienen.
We benadrukken dat STEM op zich alleen verwijst naar de gescande sonde en niet de beeldvorming definieert. Het contrast hangt voornamelijk af van de configuratie van detectoren. De meer eenvoudige methoden maken gebruik van detectoren met axiale symmetrie, ofwel een schijf gecentreerd op de optische as of een annulus eromheen. In het algemeen, wanneer de verlichting direct op de detector inwerkt, nemen we een BF-beeld op waarbij het (elektronenverstrooiende) monster donker lijkt; omgekeerd, wanneer de detector alleen verstrooide elektronen verzamelt, nemen we een DF-beeld op waarbij het dichte monster helder lijkt. Wanneer geschikte hardware beschikbaar is, kan SerialEM beide signalen tegelijkertijd verwerven en opnemen. Er zijn nog geavanceerdere configuraties beschikbaar, variërend van detectoren met meerdere segmenten tot volledig gepixelde camera's. Fasecontrastbeeldvorming kan bijvoorbeeld worden bereikt door het verschil tussen off-axis detectorelementente evalueren 32,33. Het verzamelen van het volledige 2D-verstrooiingspatroon (diffractie) per pixel definieert de methode die bekend staat als 4D STEM34, waarmee meerdere beeldcontrasten uit dezelfde oorspronkelijke gegevens kunnen worden gereconstrueerd. Vierdimensionale STEM maakt elektronenptychografie mogelijk, wat een ander middel biedt om fasecontrast35 te verkrijgen.
We hebben ons gericht op de specifieke STEM-modaliteit die we het meest nuttig achten voor de studie van organellen en intacte cellen of micron-dikke celsecties. Dit omvat specifiek het gebruik van BF-beeldvorming met een kleine semi-convergentiehoek in de verlichting en een relatief grote opvanghoek bij de detector. De kleine convergentie zorgt voor een grote scherptediepte, zodat het hele monster gedurende de hele kantelreeks19 scherp blijft. In de praktijk kan het met een goede microscoopfase ook de noodzaak van focusaanpassing tijdens de acquisitie elimineren. De prijs is een compromis in resolutie, zoals beschreven in sectie 3 van het protocol. We hebben 4k-beelden voorgesteld met een sonde van ~ 2 nm, die met 1 nm pixelafstand een gezichtsveld van 4 μm bereikt. De lezer wordt echter sterk aangemoedigd om te experimenteren. De tweede overweging bevindt zich aan de zijkant van de detector. Wanneer de verlichtingsschijf de on-axis BF-detector ondervult, wordt het fasecontrast onderdrukt en domineert het verstrooiingscontrast (amplitude); Deze aandoening wordt incoherent helder veldcontrast36 genoemd. De vraag is met welke fractie te ondervullen, en het antwoord hangt af van de steekproef. Een zeer dun monster zal het beste contrast vertonen met de detector volledig gevuld (d.w.z. de verzamelhoek komt overeen met die van de verlichting), maar een dikker monster zal alle intensiteit wegstrooien, waardoor een luidruchtig signaal met een slecht contrast achterblijft. Een handige vuistregel is dat hoe dikker het monster, hoe groter de buitenste afkaphoek van de BF-detector21 moet zijn. De grootte en positie van de detector zijn uiteraard vast, dus de grootte van de diffractieschijf wordt aangepast met behulp van de cameralengte, zoals beschreven in sectie 1. Als de instellingen van de detectorversterker zodanig zijn dat het signaal het dynamische bereik vult maar niet verzadigt onder directe verlichting (1.12.3), kan de cameralengte worden vergroot totdat een redelijke signaalintensiteit en contrast zijn bereikt. Opnieuw wordt de lezer aangemoedigd om te experimenteren. De kunst zit als het ware in de hoeken.
Een andere parameter, niet besproken in het protocol, is de microscoopversnellingsspanning. De interactie van de oplichtende elektronen met het monster zal sterker zijn bij een lagere spanning. Met al het andere gelijk, kunnen we een hoger contrast verwachten bij een lagere spanning. Aan de andere kant is het het begin van meervoudige verstrooiing in het monster dat de bruikbare monsterdikte beperkt, dus een hogere spanning maakt het gebruik van dikkere monsters mogelijk. Deze effecten zijn echter vrij subtiel. Onze ervaringen tot nu toe met 200 kV en 300 kV versnellingen zijn vergelijkbaar.
Gezien wat er van STEM verwacht mag worden qua resolutie, hangt dit weer af van het monster en de detectorconfiguratie. Met behulp van een enkele deeltjesanalysebenadering konden metaalionen op ferritine worden gelokaliseerd door ringvormige donkere veld-STEM met een precisie van enkele angstrom37. Meer recent werd sub-nanometerresolutie bereikt voor virus- en eiwitmonsters met behulp van beelden verkregen door geïntegreerd differentiaalfasecontrast (iDPC) STEM32 en ptychografie35. Voor unieke objecten in dikke cellulaire exemplaren, en met de hier beschreven methoden, is een dergelijke hoge resolutie niet realistisch. De optimale resolutie is de sondediameter, die betrekking heeft op de semi-convergentiehoek zoals beschreven. Andere factoren zullen de resolutie verminderen, met name een grove pixelbemonstering om een groot gezichtsveld te bereiken, verkeerde uitlijningen in de kantelreeks en verspreiding van de sondebundel tijdens de transmissie. Afbeeldingen zijn goed te vergelijken met plastic sectietomografie. Met de hier beschreven opstelling moet het bijvoorbeeld gemakkelijk zijn om de holle kern van de microtubuli te zien, maar niet de individuele protofilamenten.
Kortom, STEM-methoden en hardware bevinden zich beide in een ontwikkelingsfase. We kunnen verwachten dat innovaties in beeldvorming ook van invloed zullen zijn op tomografie, waardoor STEM in domeinen terechtkomt die niet toegankelijk zijn geweest met andere technieken. We verwachten dat een convergentie met correlatieve cryogene fluorescentiebeeldvorming op basis van moderne optische superresolutiemethoden bijzonder vruchtbaar zal zijn. De schaal van organellen, 100-1.000 nm, is een ideaal doelwit voor deze opkomende methoden.

Driedimensionale (3D) visualisatie van organellen is een belangrijke taak in de moderne celbiologie. Gezien de schalen, variërend van tientallen nanometers voor secretoire blaasjes tot vele microns voor de celkern, is het een uitdaging om een enkele microscopietechniek te vinden die geschikt is voor alle toepassingen. Hoewel moderne fluorescentiemicroscopie een groot deel van het bereik kan beslaan in termen van resolutie, verschijnen alleen de gelabelde moleculen. Het cellulaire theater blijft het rijk van de elektronenmicroscopie. Conventionele methoden van chemische fixatie, plastic inbedding en kleuring met zware metalen zijn sterk invasief, dus de resultaten kunnen afhangen van de details van de monstervoorbereiding. Cryo-EM daarentegen wordt beperkt door de noodzaak om het waterige medium te verglazen; IJskristallen die de elektronenverlichting vormen, diffracteren de elektronenverlichting, waardoor contrastartefacten met een hoger contrast ontstaan dan het organische materiaal van belang.
Het afgelopen decennium is er een wildgroei aan EM-beeldvormingstechnieken ontwikkeld of aangepast voor cellulaire studies1. Hogedrukbevriezing in combinatie met iteratief gefocusseerde ionenbundel (FIB) frezen en seriële oppervlaktebeeldvorming met behulp van de scanning elektronenmicroscoop (d.w.z. FIB-SEM) is momenteel de voorkeursmethode voor grote monsters2. Cryogene zachte röntgentomografie (cryo-SXT) is geschikt voor monsters van meerdere microns groot, beperkt door de karakteristieke absorptielengte van de zachte röntgenstralen in water 3,4,5. Deze schaal omvat veel intacte celtypen en de kwantitatieve aard van het röntgenabsorptiecontrast voegt een aspect toe van concentratiemeting6 of spectroscopie7. In combinatie met subtomogrammiddeling biedt cryotransmissie-elektronentomografie (cryo-ET), gebaseerd op fasecontrasttransmissie-elektronenmicroscopie (TEM), de hoogste resolutie voor macromoleculen of complexen 8,9,10. Het is echter zeldzaam dat intacte organellen zo regelmatig zijn dat ze in hun geheel kunnen worden gemiddeld. Bovendien is de conventionele modus van breedveld-TEM voor monsterdikte beperkt tot een paar honderd nanometer door de combinatie van inelastische verstrooiing (met energieverlies) in het monster en chromatische aberratie in de magnetische objectieflens11,12. De grote energiespreiding dicteert het gebruik van een energiefilter om de resulterende onscherpe waas te verwijderen, maar het gevoelige exemplaar lijdt nog steeds stralingsschade terwijl het beeldsignaal exponentieel zwakker wordt met toenemende dikte.
De alternatieve beeldvormingsmodus, scanning transmission EM (STEM), omzeilt de noodzaak van energiefiltering en behoudt de inelastisch verstrooide elektronen voor beeldvorming, zij het momenteel met een lagere resolutie dan voor TEM-tomografie (figuur 1). In feite wordt er geen echt beeld gevormd. In plaats daarvan worden, net als bij een scan-EM, metingen punt voor punt gedaan en wordt het beeld door de computer geassembleerd. De vergroting wordt alleen bepaald door de grootte van de scanstappen zonder de lensstromen te veranderen. Indien correct geconfigureerd, kan het bruikbare bereik van de monsterdikte voor cryo-STEM-tomografie (CSTET) 1,5 of zelfs 2 μm bereiken, hoewel de comfortzone, waar de nuttige signaalintensiteit een aanzienlijk deel van de verlichting blijft, ongeveer 600-900 nm11,13 is. Dit is voldoende om een groot deel van het cytoplasma te zien, en af en toe een rand van de celkern. In de praktijk zien we dat vitrificatie door de standaardmethode van het duiken in cryogene vloeistof een ernstiger beperking van de dikte oplegt dan STEM-beeldvorming. Het doel van dit videoartikel is om de integratie van CSTET in de gereedschapskist voor cel- en organelbeeldvorming in onderzoekslaboratoria en microscopiefaciliteiten te vergemakkelijken.
De eerste uitdaging is dat microscoopbewerkingen in CSTET nog niet gestandaardiseerd zijn voor life science-toepassingen op de manier waarop ze dat zijn geweest voor cryo-TEM-tomografie. STEM-hardware is zelden (of nooit) gericht geweest op de cryo-EM-markt. Dit verandert echter met de nieuwste generatie microscopen en veel bestaande gereedschappen kunnen achteraf worden ingebouwd. STEM als techniek heeft een vlucht genomen en grotendeels overgenomen in de materiaalwetenschappen, waar er ook ontluikende interesse is in cryogene en laaggedoseerde methoden14,15. De materiaalwetenschappelijke literatuur is rijk aan acroniemen BF-STEM, ADF-STEM, HAADF-STEM, 4D-STEM, DPC-STEM, enz., Die bijdragen aan de verwarring. We bieden hier een aanbevolen startpunt dat, in onze collectieve ervaring aan het Weizmann Institute of Science, het meest algemene protocol biedt voor nuttige resultaten op basis van bright field (BF) STEM-beeldvorming16. Op geen enkele manier put het uit of verkent het zelfs het scala aan mogelijkheden, maar het zal dienen als basis voor verdere verbeteringen. Hoewel we de nadruk leggen op cryo-STEM, is het grootste deel van het protocol even relevant voor stemtomografie bij kamertemperatuur van in plastic ingebedde secties.
De essentie van STEM is om het monster te scannen met een gefocusseerde elektronensonde (figuur 1), de verlichtingskegel, en om signalen van het diffractie (verstrooiing) vlak in transmissie te registreren, pixel voor pixel, om 2D-beelden te produceren17,18. Amorfe exemplaren, waaronder de meeste cellulaire materialen, zullen een diffuus verstrooiingspatroon produceren in transmissie. De eenvoudigste praktische STEM-configuratie is om een cirkelvormige detector te plaatsen om de centrale schijf op te nemen (d.w.z. de sondeverlichting die zonder monster zou worden verzonden). Het monster verstrooit elektronen weg van deze verlichtingskegel in die mate dat het signaal afneemt. Dit levert een BF-beeld op - het exemplaar lijkt donker op een heldere achtergrond. Een ringvormige detector kan ook (of in plaats daarvan) worden gebruikt om de verstrooiing van het monster buiten de verlichtingskegel te detecteren. Met het monster verwijderd, is er geen signaal. Wanneer een exemplaar op zijn plaats is, worden objecten helder weergegeven op een donkere achtergrond in de afbeelding met het donkere veld (DF). De nomenclatuur voor STEM (BF, ringvormig donker veld [ADF], ringvormig donkerveld met hoge hoek [HAADF], enz.) verwijst voornamelijk naar de reeksen van verzamelhoeken voor de detectoren.
De convergentiehoek van de verlichting vertegenwoordigt een essentiële aanpassing van STEM aan cellulaire tomografie. Wanneer hoge resolutie de hoogste prioriteit heeft, moet de convergentiehoek zo groot mogelijk zijn. (Dit is vergelijkbaar met confocale laserscanmicroscopie; de resolutie wordt bepaald door de sondediameter, die schaalt als de golflengte gedeeld door het numerieke diafragma. Merk op dat we verwijzen naar de halve hoek of semi-convergentiehoek voor EM.) Wanneer de prioriteit daarentegen de scherptediepte is, biedt een compromis in resolutie een groot voordeel, omdat de scherpgestelde bundel ongeveer evenwijdig blijft voor een afstand gelijk aan tweemaal de golflengte gedeeld door een halve hoek in het kwadraat. Idealiter blijft het volledige celvolume in focus19. Bij 300 keV is de elektron deBroglie golflengte bijvoorbeeld 0,002 nm, dus een convergentie van 1 mrad levert een resolutie op van 2 nm en een scherptediepte van 4 micron. Onder deze omstandigheden kan tomografie zelfs zonder focus worden uitgevoerd tijdens het gegevensverzamelingsproces, maar slechts één keer aan het begin van de acquisitie. Een conventionele tomografie-compatibele STEM kan een semi-convergentiehoek van 7 of 8 mrad bereiken; Daarom zouden we in principe een resolutie in de orde van 0,25 nm kunnen bereiken, maar dan met een brandpuntsdiepte van slechts 62 nm. Dit is duidelijk te dun voor cellulaire beeldvorming. Meer geavanceerde microscopen met drie condensorlenzen bieden een continue aanpassing van de semi-convergentiehoek over een aanzienlijk bereik. Bij de meer traditionele configuratie met twee condensors wordt de convergentie discreet vastgesteld door het diafragma van de condensor (C2).
Voor robuuste, in plastic ingebedde monsters kan men bij elke kanteling een brandpuntsreeks opnemen en combineren voor een hoge resolutie20, maar voor cryogene monsters is het stralingsbudget te ernstig beperkt. Ten slotte moet men bij het afwegen van de voordelen van BF- of DF-beeldvorming, voor dikke monsters, rekening houden met de effecten van meervoudige elastische verstrooiing in het monster. Het BF-signaal wordt minder beschadigd door meervoudige verstrooiing en toont een hogere resolutie voor dikke exemplaren16,21.
Een handige vuistregel was om verzamelhoeken in te stellen die meerdere malen groter waren dan de convergentie. Hoe dikker het exemplaar, hoe groter de verzamelschijf moet zijn. Een te kleine schijf zorgt voor een lage signaalintensiteit; Een te grote schijf zal resulteren in een slecht beeldcontrast, omdat alleen de verstrooiing met de hoogste hoek zal bijdragen. De verzamelhoeken moeten worden geoptimaliseerd voor een bepaald monster. De detectorhoeken als functie van de (diffractie)cameralengte moeten onafhankelijk worden gekalibreerd. Ze kunnen gemakkelijk worden weergegeven door de microscoopsoftware. In de praktijk is een factor twee tot vijf in de verhouding tussen de halve hoeken van de verzameling en de verlichting, respectievelijk θ tot α (figuur 1), een aanbevolen uitgangspunt voor CSTET van cellulaire monsters.
Het volgende protocol beschrijft de werking van STEM-tomografie met behulp van de populaire SerialEM-software voor microscoopbesturing22,23. SerialEM is niet gebonden aan een specifieke fabrikant en wordt veel gebruikt in TEM-tomografie. De meeste bewerkingen bij het instellen voor tomografie kunnen rechtstreeks van TEM worden overgedragen. De SerialEM-strategie is om het scansysteem te modelleren als een camera. Dit maakt de eenvoudige crossover van TEM naar STEM mogelijk. Men moet echter in gedachten houden dat parameters zoals vergroting en binning volledig kunstmatig zijn. De belangrijke parameters zijn het gezichtsveld in microns, het aantal pixels in het gezichtsveld en de belichtingstijd. De pixelafstand, of sampling, is het lineaire veld gedeeld door het aantal pixels, terwijl de verblijftijd het aantal pixels is gedeeld door de belichtingstijd.
De minimale configuratie voor STEM en CSTET omvat drie functies op de microscoop: een scangenerator, een STEM-detector en tomografiebesturingssoftware. Het protocol verwijst naar de nomenclatuur van FEI/Thermo Fisher Scientific (TFS), maar de begrippen zijn generiek. De propriëtaire software van TFS is beschreven in JoVE voor TEM24, en de STEM-werking is zeer vergelijkbaar.
We gaan ervan uit dat de microscoop vooraf is uitgelijnd door het serviceteam of ervaren personeel en dat een kolomuitlijning kan worden opgeroepen door een bestand te laden. Kleine aanpassingen worden directe uitlijningen genoemd en kunnen worden opgeslagen in zogenaamde FEG-registers (TFS-microscopen). Directe uitlijningen omvatten rotatiecentrum, draaipunten, diffractie-uitlijning en compensatie voor condensastigmatisme. Aanpassingen moeten iteratief worden uitgevoerd. Merk op dat TFS-microscopen verschillende nanoprobe (nP) en microprobe (μP) modi implementeren; voor een gegeven condensoropening bieden deze een relatief smal of breed gezichtsveld met parallelle verlichting in TEM en een min of meer convergente (strak gefocusseerde) elektronenbundel in STEM, respectievelijk. Andere fabrikanten gebruiken verschillende schema's om het bereik van convergentiehoeken te dekken.
Voordat wordt begonnen, moeten het gezichtsveld L en de bemonstering (pixelbreedte) l worden gekozen, afhankelijk van het onderzochte monster. Voor l = 1 nm/pixel moet bijvoorbeeld een afbeelding van 4.000 x 4.000 pixels worden gekozen die een gezichtsveld van 4 μm2 beslaat. De resolutie is in het beste geval tweemaal de ruimtelijke bemonstering, dus 2 nm, en de sondediameter, d, moet daarmee overeenkomen. Kalibratie van de sondehoek valt buiten het bestek van dit protocol, dus we gaan ervan uit dat er een tabel of een schermaflezing beschikbaar is. De diameter van de sonde is ongeveer de golflengte van het elektron gedeeld door de semi-convergentiehoek (in radialen): d = λ/θ. De golflengte, λ, is 0,002 nm voor 300 keV en 0,0025 nm voor 200 keV elektronen, dus θ van 1 mrad levert een spotdiameter op van respectievelijk 2 of 2,5 nm.
Het protocol wordt gepresenteerd in een progressie van toenemende complexiteit. De eerste taak is om een STEM-beeld te produceren, dat afhankelijk is van de software van de microscoopfabrikant, en vervolgens een kantelserie, waarvoor we SerialEM gebruiken. Veel lezers zullen ongetwijfeld bekend zijn met SerialEM, dus de meer gecompliceerde taken zullen vanzelf komen. Het is niet nodig om de procedures strikt te volgen. Ontwikkelingen met betrekking tot automatisering kunnen zowel voor STEM als voor TEM rechtstreeks worden geïmplementeerd. Ervaren gebruikers zullen het protocol waarschijnlijk omkeren, te beginnen met correlatieve registratie van fluorescentiekaarten en doorgaan met het instellen van batchtomografie. Verdere details zijn te vinden in de uitgebreide documentatie- en zelfstudiebibliotheken voor SerialEM zelf, waaronder een recent JoVE-artikel over de nieuwste ontwikkelingen in automatisering25.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;SerialEM</td><td>University of Colorado</td><td>Veriosn 4.0</td><td>SerialEM is een gratis softwareplatform voor microscoopbesturing en gegevensverwerving.&nbsp;</td></tr><tr><td>STEM-capable transmissie-elektronenmicroscoop</td><td></td><td></td><td>Het protocol is geschreven op basis van ervaring met verschillende microscopen van Thermo Fisher Scientific: Titan Krios, Talos Arctica en Tecnai T20-F. In principe zou het ook toepasbaar moeten zijn op andere fabrikanten.</td></tr></tbody></table>

visualisatie van organellen in situ door cryo-stem tomografie

Visualization of Organelles In Situ by Cryo-STEM Tomography

Cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM) is gebaseerd op de beeldvorming van biologische of organische monsters ingebed in hun oorspronkelijke waterige medium; Water wordt gestold in een glas (d.w.z. verglaasd) zonder kristallisatie. De cryo-EM-methode wordt veel gebruikt om de structuur van biologische macromoleculen te bepalen, onlangs met een bijna-atomaire resolutie. De benadering is uitgebreid tot de studie van organellen en cellen met behulp van tomografie, maar de conventionele modus van breedveldtransmissie EM-beeldvorming lijdt aan een ernstige beperking in de dikte van het monster. Dit heeft geleid tot een praktijk van het frezen van dunne lamellen met behulp van een gerichte ionenbundel; De hoge resolutie wordt verkregen door subtomogramgemiddelde van de reconstructies, maar driedimensionale relaties buiten de resterende laag gaan verloren. De diktebeperking kan worden omzeild door gescande sondebeeldvorming, vergelijkbaar met de scannende EM of de confocale laserscanmicroscoop. Terwijl scanning transmissie elektronenmicroscopie (STEM) in de materiaalkunde atomaire resolutie in afzonderlijke beelden biedt, vereist de gevoeligheid van cryogene biologische monsters voor elektronenbestraling speciale overwegingen. Dit protocol presenteert een opstelling voor cryotomografie met behulp van STEM. De actuele basisconfiguratie van de microscoop wordt beschreven voor zowel twee- als driecondensorsystemen, terwijl automatisering wordt geleverd door de niet-commerciële SerialEM-software. Verbeteringen voor batchacquisitie en correlatieve uitlijning met eerder verkregen fluorescentiekaarten worden ook beschreven. Als voorbeeld tonen we de reconstructie van een mitochondrion, wijzend op het binnenste en buitenste membraan en calciumfosfaatkorrels, evenals omliggende microtubuli, actinefilamenten en ribosomen. Cryo-STEM tomografie blinkt uit in het onthullen van het theater van organellen in het cytoplasma en, in sommige gevallen, zelfs de nucleaire periferie van aanhangende cellen in cultuur.

Een volledige rastermontage voorbereid in STEM toont de gebieden met cellen van belang (figuur 4). Merk op dat de afbeelding zich in een donker veld bevindt, dus lege gaten lijken donker. Cellen lijken gedeeltelijk helder, waar de elektronen worden verstrooid in de richting van de HAADF-detector. Op de dikste delen, meestal de middelpunten of in de buurt van de rasterbalken, wordt het contrast weer donker. Dit komt door meervoudige verstrooiing, waarbij de elektronen hoeken bereiken die niet door de detector worden opgevangen. In de praktijk zullen deze gebieden te dik zijn voor tomografie.
De volgende fase omvat kaarten van tussentijdse vergroting (figuur 10). Deze worden vaak middelgrote montagekaarten of vierkante kaarten genoemd, verwijzend naar de rastervierkanten in plaats van de vorm. Zelfs bij de laagste microprobe STEM-modus worden ze ook als montagebeelden verkregen. Als u op het item in het navigatorvenster klikt, wordt de kaartafbeelding in het hoofdvenster geladen. Binnen dit gebied worden specifieke punten voor tomogramacquisitie gekozen. Gebruik de voorbeeldmodus om het gebied bij de opnamevergroting te lokaliseren. Houd er rekening mee dat er een zijdelingse verschuiving kan zijn tussen Voorvertoning en Opnemen, afhankelijk van de scansnelheden. Een enkele kantelreeks kan hier worden opgenomen. Mitochondriën kunnen bijvoorbeeld vaak worden geïdentificeerd in de afbeelding Voorvertoning en Record (figuur 12).
Voor batchtomografie zal het podium rond het raster reizen en mogelijk niet terugkeren naar precies dezelfde locatie. Ankertoewijzingen worden gebruikt om ervoor te zorgen dat de gewenste recordgebieden op betrouwbare wijze opnieuw worden geïdentificeerd door de voorvertoningsafbeelding te koppelen aan een weergave met een lagere vergroting, zelfs als de beweging van het werkgebied is verschoven. PyEM23,24 biedt een sneller alternatief dat zeker aan te raden is, maar nog geen deel uitmaakt van de standaard installatie.
In de CLEM-benadering kan een fluorescentiekaart worden gebruikt om de interessegebieden voor tomografie te identificeren. De fluorescentie wordt extern verkregen en moet worden geregistreerd op de volledige rastermontage. Het is handig om de rasterbalken en gaten zichtbaar te hebben, zodat een samengevoegde fluorescentie + heldere veldcomposiet kan worden voorbereid voordat deze wordt geïmporteerd, bijvoorbeeld in GIMP (https://www.gimp.org) of ImageJ31-software (zorg ervoor dat ImageJ de verticale as omkeert). Wanneer het dynamisch bereik van de fluorescentie groot is, kan het moeilijk zijn om een dergelijke samensmelting te creëren zonder verzadiging. In dit geval kunnen de twee kaarten afzonderlijk worden geïmporteerd en vervolgens samen worden geregistreerd zoals beschreven (figuur 13). Op deze manier brengt een punt op de fluorescentiekaart in het Navigator-venster, gevolgd door "Go To XY", het werkgebied naar de overeenkomstige positie op het raster zoals gemonteerd in de TEM. Zorg ervoor dat kleine inconsistenties in het maken van de montage (of de fluorescentiekaart, als het ook een montage is) leiden tot kleine verplaatsingen; Daarom moet de fluorescentie voor optimale precisie specifiek op de vierkante kaart opnieuw worden geregistreerd. Het is vaak voldoende om deze registratie op het oog te doen, op basis van gaten in de steunfilm of kenmerken die worden gedeeld met het heldere veldlichtbeeld.
Reconstructie van de kantelreeks resulteert in een 3D-volume (figuur 14). Dit voorbeeld heeft een pixelgrootte van 2,042 nm, wat resulteert in een gezichtsveld van ~4 μm. Calciumfosfaatafzettingen (oranje pijlpunten) vallen op, vanwege het hogere atoomnummer in vergelijking met de omgeving. Microtubuli (rode pijlpunten) kunnen over het hele gezichtsveld worden getraceerd. Ook zijn de binnenste en buitenste mitochondriale membranen (groene pijlpunten) duidelijk te zien. Actine kan worden waargenomen als bundels of als individuele filamenten. Om een meer isotrope resolutie te bereiken, kan de reconstructie worden verwerkt door deconvolutie.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig01.jpg"> Figuur 1: Vergelijking van TEM versus STEM. In TEM wordt het gezichtsveld verlicht door een bijna parallelle bundel en vormt de objectieflens een vergroot beeld op de camera. Voor cryo-TEM wordt de objectieve opening geopend om de verstrooide elektronengolven (onderbroken rode lijn) te passeren, die met onscherpte fasecontrast produceren door interferentie met de niet-verspreide (groene) golven. STEM, aan de andere kant, rastert een gerichte straal over het monster en verzamelt de verstrooide elektronen op een pixel-voor-pixel manier. Meerdere detectoren kunnen elektronen verzamelen die onder verschillende hoeken zijn verspreid. Dit cijfer is gewijzigd van30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig02.jpg"> Figuur 2: Voorbeeld van beeldvervorming aan de linkerkant door de hoge scansnelheid. Let op de vervorming gemarkeerd door gele pijlpunten, evenals de vervormde ovaalvormige gaten in de Quantifoil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig03.jpg"> Figuur 3: Montage setup dialoog voor de hele rastermontage. Kies de vergroting en het aantal stukken in X en Y, zodat het totale gebied ongeveer 2.000 μm bereikt om een kaart te krijgen voor het grootste deel van het raster. Kies ook Fase verplaatsen in plaats van afbeelding verschuiven en Montagetoewijzing gebruiken, geen recordparameters. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig04.jpg"> Figuur 4: Volledige lage vergroting GridMap opgenomen in STEM-modus. Gebroken gebieden worden volledig zwart weergegeven in het donkere veldbeeld. Donkergrijze gebieden zijn waarschijnlijk te dik en slecht verglaasd. Goede kandidaat-gebieden voor tomografie zijn wit of lichtgrijs in deze scan. Schaalbalk = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig05.jpg"> Figuur 5: Verschuiving naar markeringsproces. Een herkenbaar object is gemarkeerd in de kaart met lage resolutie door Punten toevoegen (38 in deze afbeelding). Let op de verschuiving tussen de kaart met lage resolutie (groene cirkel) en de kaart met gemiddelde resolutie (oranje cirkel). Vervolgens wordt het object gemarkeerd met de markering (groen kruis, rode cirkel) en wordt het dialoogvenster Verschuiven naar markering gestart. De gekozen optie verplaatst alle kaarten op 245x met dezelfde hoeveelheid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig06.jpg"> Figuur 6: Kantelserie setup dialoog voor een STEM tilt serie. Het dosissymmetrisch schema wordt gebruikt van -60° tot +60° in stappen van 2°. Autofocus wordt overgeslagen vanwege de hoge scherptediepte bij gebruik van een lage convergentiehoek. Het is niet nodig om eucentriciteit te verfijnen zoals dit eerder is gedaan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig07.jpg"> Afbeelding 7: Dialoogvenster met bestandseigenschappen voor kaarten met een gemiddelde resolutie. Sla op als een MRC-stackbestand, kies gehele getallen en sla extra informatie op in een MDOC-metagegevensbestand. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig08.jpg"> Figuur 8: Montage-instellingsdialoogvenster voor het opslaan van kaarten met een gemiddelde resolutie. Voor een vierkant op een rooster van 200 mazen, dat 90 μm breed is, is een totale oppervlakte van minimaal 90 μm x 90 μm aan te raden. Kies Werkgebied verplaatsen in plaats van afbeelding verschuiven en Weergaveparameters gebruiken in de modus Lage dose. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig08large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig09.jpg"> Figuur 9: Opname medium resolutie kaart. Acquire at Items dialoog voor het opnemen van kaarten met een gemiddelde resolutie. Kies Toewijzing, Afbeelding of montage ophalen en opslaan en schakel het selectievakje Navigatorkaart maken in. Kies in de taken voor of na het jeugdwerk de optie Ruw en fijn eucentricisme. Als u geen hulp hebt, kiest u optioneel Geen berichtvak wanneer er een fout optreedt en Kolomkleppen sluiten aan het einde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig09large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig10.jpg"> Figuur 10: Afbeelding van kaart met gemiddelde resolutie. Kaart met gemiddelde resolutie (vierkante kaart) opgenomen in STEM-modus door een montage van 3 x 3. De twee ankerkaarten met gemiddelde resolutie voor gegevensverzameling worden aangegeven door de blauwe vierkanten. Schaalbalk = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig10large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig11.jpg"> Figuur 11: Batch tilt serie data. Acquire at Items dialoogvenster voor het verzamelen van batch tilt series. Voor het verzamelen van gegevens uit de kantelreeks kiest u Definitieve gegevens en Kantelreeks ophalen. Schakel bij Taken voor of na primair het selectievakje Dewars/Vacuum beheren in (kies de juiste instellingen in het setup-menu), Opnieuw uitlijnen op item, Eucentriciteit fijn maken en Script uitvoeren vóór actie in. Schakel in de algemene opties het selectievakje Geen bericht in wanneer er een fout optreedt en kolomkleppen aan het einde sluiten (zie 5.14). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig11large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig12.jpg"> Figuur 12: 0° kanteling van een STEM-kantelreeks van een mitochondrion. Oranje pijlpunten wijzen op calciumfosfaatafzettingen (matrixkorrels), groene pijlpunten op cristae en rode pijlpunten op 15 nm gouden fiduciale markers. Schaalbalk = 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig12large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig13.jpg"> Figuur 13: Geregistreerde cryo-CLEM kaarten. (A) Stem-kaart met gemiddelde resolutie (vierkante kaart, 26-A) is geregistreerd op de (B) stemkaart met lage resolutie, (C) BF-kanaal cryo-FM-kaart en (D) GFP-kanaal cryo-FM-kaart. De negen registratiepunten (labels 4-21) worden weergegeven in de (E) Navigator. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig13large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig14.jpg"> Figuur 14: Volume rendering. Volumeweergave van (A) 60 nm en een (B) 40 nm dikke secties door een SIRT-achtig (30 cycli) gefilterd tomogram op verschillende diepten. De pixelgrootte is 2,048 nm, wat resulteert in een gezichtsveld van ongeveer 4 μm. Let op de omgekeerde dichtheid in vergelijking met figuur 12, wat betekent dat functies met een hoge intensiteit helder zijn. Oranje, witte, rode, groene en lichtblauwe pijlpunten wijzen op respectievelijk calciumfosfaatafzettingen, ribosomen, microtubuli, het binnenste en buitenste mitochondriale membraan en actinefilamenten. Schaalbalk = 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig14large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Cryo-STEM-tomografie biedt een middel om organellen van intacte cellen te visualiseren zonder inbedding, sectie of andere invasieve preparaten. De verkregen 3D-resolutie ligt momenteel in het bereik van enkele nanometers, met een gezichtsveld van enkele micrometers en een toegankelijke dikte in de orde van grootte van 1 μm.

Visualisatie van organellen in situ door cryo-STEM tomografie

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) relies on the imaging of biological or organic specimens embedded in their native aqueous medium; water is ...

TEM-tomografie wordt veel gebruikt voor beeldvorming van cellen, maar het is zeer beperkt in termen van monsterdikte. FIB SEM en zachte röntgentomografie kunnen worden gebruikt voor grotere monsters, zij het met een lagere resolutie. STEM-tomografie vult deze leemte perfect op.STEM-tomografie biedt een blik op micron dikke monsters met een resolutie van enkele nanometers. De combinatie met cryogene bereiding laat ons biologische monsters en secties in 3D bekijken. Bekijk de basisprincipes van STEM-optica om beeldvorming te begrijpen en ervoor te zorgen dat de servicetechnicus de stuurpen- en Lomax-stammodi goed heeft uitgelijnd en dat de kalibratiestappen eruitzien als die in de video.Laad om te beginnen het kolomuitlijningsbestand en open de kolomwaarden. Als u een cryohouder aan de zijkant gebruikt, opent u het cryo-schild en start u in de TEM-modus. De straal moet op het scherm verschijnen.Verlaag de vergroting als de bundel niet verschijnt. Breng de microscoop naar eucentrische focus door op de knop op het bedieningspaneel te drukken. Stel de spotgrootte in op een handige waarde voor het direct visualiseren van het fluorescerende scherm of met de ingebouwde camera.Zet de microscoop op de STEM-modus en controleer of de scherpstelling de condensorlenzen gebruikt in plaats van het objectief. Stel op het paneel de eucentrische focus in en ga uit de diffractiemodus voor initiële aanpassingen. Zorg ervoor dat de straal niet leeg is en verklein de vergroting totdat de straal op het scherm verschijnt.Pas de bundelverschuiving naar het midden aan en verhoog de vergroting in stappen tot 70.000, terwijl de bundel in het midden blijft. Plaats vervolgens de gewenste condensoropening, meestal 50 micrometer voor de microsondemodus, en controleer de opening centreren. Terwijl je de scherpstelknop heen en weer draait, moet de spot uitzetten en samentrekken, maar op zijn plaats blijven, alsof een vlak een denkbeeldige verticale zandloper snijdt.Als het diafragma niet gecentreerd is, zal de verlichting zijdelings verschuiven alsof de zandloper gekanteld is. Breng de bundel scherp, druk op de intensiteitslijstfocus op het tabblad Uitlijningen of keer terug naar eucentrische focus. Stel de positie van de bundel opnieuw in op het midden en pas het rotatiecentrum aan.Draai nu het focusstapwiel naar het minimum, of een stap erboven, zodat de bundel zachtjes pulseert en ervoor zorgt dat deze stationair blijft terwijl de focus op en neer beweegt. Selecteer de draaipunten en breng de twee punten samen met X- en Y-aanpassingen. Pas de condensorstigmators aan om de balk rond te maken.Ga op en neer door focus om te optimaliseren. Er mag geen neiging zijn om in de ene of de andere richting uit te rekken bij het passeren van de focus. Normaliseer de lenzen, verhoog vervolgens de vergroting geleidelijk tot ongeveer 240.000, terwijl u de bundelverschuiving gebruikt om de vlek gecentreerd te houden en de rotatiecentrum- en draaipuntaanpassingen te herhalen.Ga terug naar de diffractiemodus. In dit stadium moet de bundel als een uniforme schijf op het fluorescerende scherm verschijnen. De cameralengte regelt nu effectief de optische afstand tot de detector als een röntgenkristallografie.Wijzig het en kijk hoe de schijf samentrekt en vergroot alsof de schermlocatie naar of van het monster zou bewegen. Deze kegel vertegenwoordigt de brightfield-verlichting. Om de STEM-modus bij hoge vergroting in te schakelen, begint u met de brightfield-stamdetector en past u de diffractie-uitlijning aan om de bundel te centreren met behulp van de gewenste cameralengte.Schakel de brightfield-markering op het scherm in, verklein de cameralengte tot 330, til het scherm op en plaats de detectoren. Start een scan in de microscoopsoftware. Gebruik de scopeweergave om te helpen bij het aanpassen van de helderheids- en contrastinstellingen zoals beschreven in het manuscript.Herhaal de aanpassing meerdere keren. Breng de microscoop terug naar een relatief lage vergroting in het hoge vergrotingsregister, zonder in de lage vergrotingsmodus te gaan. Plaats het fluorescerende scherm en noteer de schermstroom ter referentie.Net als bij TEM kan de stroom worden gewijzigd met de pistoollens en de spotgrootte-instellingen met toenemende aantallen die overeenkomen met een verminderde stroom. Sla op dit punt een FEG-register op om een terugkeer naar standaardwaarden te vergemakkelijken. Ga naar de LMTEM-modus om het exemplaar te zien.Plaats het monster. Breng het monster op eucentrische hoogte. Er zijn verschillende methoden om dit te doen.Gebruik bijvoorbeeld de werknaalwiebelaar om het raster te kantelen terwijl u de monsterhoogte langs de Z-as beweegt totdat de afbeelding niet meer zijdelings verschuift. U kunt ook enkele functies op het weergavescherm markeren en het podium tot 10 tot 30 graden kantelen. De functie beweegt zijdelings.Pas de hoogte van het monster aan om het terug te brengen naar de oorspronkelijke positie. Verhoog de vergroting of de kanteling van het podium om de kanteling te verfijnen en terug te brengen naar nul graden. Ga nu terug naar de STEM-modus en plaats de STEM-detector.Zorg ervoor dat LM-scan inschakelen is uitgeschakeld. Ga naar de laagste hoge vergrotingsmodus. Stem het astigmatisme van de condensor af volgens de methode.Stel met de bundel over een dun monstergebied scherp op het punt waar de uitgezonden bundel opblaast tussen schaduwbeelden van het monster aan weerszijden. Pas vervolgens de condensorafstemming aan om de centrale schijf rond te maken. Dit vereist enige oefening, vooral voor cryogene monsters.Ga terug naar het diafragma van 50 micrometer en werk het FEG-register bij. Ga naar de LMSTEM-modus en ga verder met scannen om een interessant gebied te vinden. Pas indien nodig de helderheids- en contrastinstellingen van de detector ongeveer op dit punt aan.Druk op eucentrische focus, verhoog de vergroting en verfijn de focus tijdens het scannen met behulp van de focuslus van de microscoop en controleer het astigmatisme op gouden kralen. Tot nu toe wordt alles uitgevoerd in nano-sondemodus. Merk op dat het plaatsen van een kleiner condensordiafragma de semi-convergentiehoek vermindert, wat handig is voor dikke monsters.Een alternatieve benadering met TFS-instrumenten is om over te schakelen naar de micro-sondemodus, wat leidt tot een verminderde semi-convergentiehoek. Pas vervolgens de cameralengte aan om de verzamelhoek drie keer groter te maken dan de convergentiehoek; d.w.z. de BF-detectorgebiedmarkeringen op het scherm zijn ongeveer drie keer groter dan de straal.Schat de dosis voor registratie met behulp van een vergelijking. Als vuistregel geldt dat je voor de hele tomograaf 100 tot 150 elektronen per vierkante inktstrom moet mikken. Breng het podium terug naar een geheel en pas de straalstroom aan met behulp van spotgrootte en of pistoollensinstellingen om de gewenste schermstroom te bereiken.Volledige lage vergrotingsrasterkaart opgenomen in STEM-modus toont de gebieden met cellen van belang. Cellen lijken gedeeltelijk helder met elektronen verspreid in de richting van de HAADF-detector. Op een kaart met een gemiddelde resolutie die in de STEM-modus is opgenomen, worden twee ankerkaarten met een gemiddelde resolutie weergegeven.Nul graden kanteling van een stengelkantelingsreeks maakte de visualisatie van de calciumfosfaatafzettingen, cristae en gouden fiduciale markers van een mitochondrion mogelijk. Volumeweergave van 60 nanometer en 40 nanometer dikke secties worden weergegeven. Cryostamtomografie, of CSTET, biedt een brug tussen structurele biologie en celbiologie, evenals een context voor superresolutiefluorescentie.Zonder de noodzaak van secties of lamellenvoorbereiding, kunnen we het hele cellulaire theater in een bijna inheemse staat zien.

visualization-of-organelles-in-situ-by-cryo-stem-tomography

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Illustreren we hier hoe u elektron cryotomography (ECT) te gebruiken om de ultrastructuur van bacteriële cellen in near-native staten studie, om "macromoleculaire" (~ 4 nm) resolutie.

Electron Cryotomography van bacteriële cellen

We presenteren een protocol over hoe om te verzamelen en te verwerken elektronen cryo-tomogrammen van hele mitochondriën. De techniek biedt gedetailleerd inzicht in de structuur, functie en organisatie van grote membraan eiwitcomplexen in de moedertaal van biologische membranen.

Visualisatie van ATP synthase Dimeren in Mitochondriën door Electron Cryo-tomografie

Dit protocol wordt beschreven hoe de voorbijgaande verdichting van het DNA in cyanobacteriën visualiseren. Synchrone teelt, toezicht door fluorescentie microscopie, snelle invriezen, en hoge spanning cryo-Elektronentomografie worden gebruikt. Een protocol voor deze methodologieën wordt gepresenteerd, en toekomstige toepassingen en ontwikkelingen worden besproken.

Visualisatie van DNA verdichting in cyanobacteriën door hoogspannings-Cryo-Elektronentomografie

Hier wordt een protocol gepresenteerd dat de monstervoorbereiding en gegevensverzamelingsstappen beschrijft die nodig zijn in cryo zachte röntgentomografie (SXT) om de ultrastructuur van hele cryo-geconserveerde cellen in beeld te brengen met een resolutie van 25 nm halve toonhoogte.

Een 3D cartografische beschrijving van de cel door Cryo Soft X-ray Tomography

Met behulp van gefocusseerde ionenbundelfrezen om glasvochtlamellen op het rooster te produceren uit bevroren biologische monsters voor cryo-elektronentomografie.

Lamellen bereiden van glasvochtbiologische monsters met behulp van een dual-beam scanning elektronenmicroscoop voor cryo-elektronentomografie

We presenteren een protocol voor lamellenpreparaat van diepgevroren biologische monsters door cryo-gerichte ionenbundelmicromachining voor structurele studies met hoge resolutie van macromoleculen in situ met cryo-elektronentomografie. Het gepresenteerde protocol biedt richtlijnen voor de bereiding van hoogwaardige lamellen met een hoge reproduceerbaarheid voor structurele karakterisering van macromoleculen in de Saccharomyces cerevisiae.

Bereiding en Cryo-FIB microbewerking van Saccharomyces cerevisiae voor Cryo-Elektronen Tomografie

Het doel van dit protocol is om celadhesie en -groei te richten op gerichte gebieden van rasters voor cryo-elektronenmicroscopie. Dit wordt bereikt door een aangroeiwerende laag aan te brengen die wordt opgeblazen in door de gebruiker gespecificeerde patronen, gevolgd door afzetting van extracellulaire matrixeiwitten in de patroongebieden voorafgaand aan het zaaien van cellen.

Micropatterning Transmissie ElektronenMicroscopie Grids naar Direct Cell Positioning binnen Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Het huidige protocol beschrijft cryo-elektronentomografie op afstand met hoge resolutie data-acquisitie met behulp van Tomo5 en daaropvolgende gegevensverwerking en subtomogrammiddeling met behulp van emClarity. Apoferritine wordt als voorbeeld gebruikt om gedetailleerde stapsgewijze processen te illustreren om een cryo-ET-structuur met een resolutie van 2,86 Å te bereiken.

Cryo-elektronentomografie Gegevensverzameling op afstand en subtomogrammiddeling

Cryo-elektronentomografie (cryo-ET) maakt 3D-visualisatie van cellulaire ultrastructuur met nanometerresolutie mogelijk, maar handmatige segmentatie blijft tijdrovend en complex. We presenteren een nieuwe workflow die geavanceerde virtual reality-software integreert voor het segmenteren van cryo-ET-tomogrammen, waarbij de effectiviteit ervan wordt aangetoond door de segmentatie van mitochondriën in zoogdiercellen.

Gebruikmaken van virtual reality voor meeslepende segmentatie en analyse van cryo-elektronentomografiegegevens

Dit videoprotocol illustreert hoe scanning-transmissie-elektronenmicroscopietomografie van virologische monsters moet worden uitgevoerd. Voor optimale resultaten worden monsters bereid door vries onder hoge druk en daaropvolgende vriessubstitutie.

Scanning transmissie-elektronenmicroscopietomografie in de virologie: 3D-beeldvorming van onder hoge druk ingevroren, vriesgesubstitueerde monsters

Ontdek cryo-STEM tomografie voor 3D-beeldvorming van organellen in intacte cellen met nanometerresolutie. Deze niet-invasieve methode behoudt biologische structuren in hun natuurlijke toestand.

Visualisatie van organellen in situ door cryo-STEM tomografie

Meer video's verkennen