Kwantificering en karakterisering van het hele genoom van SARS-CoV-2-RNA in afvalwater- en luchtmonsters

Op afvalwater gebaseerde epidemiologie wordt momenteel gebruikt om COVID-19-bestrijdingsstrategieën wereldwijd aan te vullen door viraal RNA in afvalwatermonsters te detecteren en mogelijke uitbraken te identificeren. Deze techniek biedt een bevolkingsbrede momentopname van de prevalentie van COVID-19 in onze gemeenschap, inclusief asymptomatische gevallen. Ook luchtbemonstering is een belangrijke aanvulling op dit protocol.

Klinische diagnostiek is nog steeds de meest nauwkeurige manier om ziekte-uitbraken en pandemieën te beheersen. Deze techniek is echter nog steeds nuttig als aanvulling daarop. Deze methode heeft veel stappen en kritieke punten.

Een visuele demonstratie is essentieel, omdat laboratoria die niet zo vertrouwd zijn met moleculaire biologie de procedure kunnen repliceren. Verzamel om te beginnen een liter van een 24-uurs composiet afvalwatermonster. Prik 20 microliter mengovirus in 70 milliliter van het monster.

Na het centrifugeren van het monster bij 700G gedurende 10 minuten, concentreert u het resulterende supernatans met behulp van een centrifugaal ultrafiltratie-apparaat met een cutoff van 10 kilodalton door centrifugeren. Ontkoppel het concentraat door gedurende 40 minuten op 700 G te centrifugeren en de positie van het ultrafiltratieapparaat om te keren. Gebruik het resulterende concentraat voor RNA-extractie.

Om de luchtmonsters te verzamelen, plaatst u een steriele kegel in de luchtmonsternemer voordat u met de verzameling begint. Zodra de bemonstering voorbij is, extraheert u RNA uit de gewassen PBS van de kegel met behulp van een commerciële virale RNA-extractiekit of een interne methode. Bereid de reactiemastermix voor elk doelwit, mengovirus, SARS-CoV-2, N1- en N2-genen in een schone kap in de reagensopstellingsruimte.

Meng de primers-sondemix en het enzym door vijf keer om te keren of te pulseren. Bewaar de microcentrifugebuisjes in een koud rek en doseer 15 microliter van het mengsel in PCR-stripbuisjes of een PCR-plaat met 96 putjes die op een koelrek is geplaatst. Bedek de plaat en verplaats deze naar het nucleïnezuurverwerkingsgebied.

Draai voorzichtig een aliquot van het geëxtraheerde RNA gedurende vijf seconden. Pipeteer vijf microliter van het RNA in het reactiemengsel om 25 microliter te maken en start de RT-qPCR. In een PCR-plaat pipet u 16 microliter van elk monster naar zijn positie op de plaat en voegt u vier microliter van vijfmaal reverse transcriptie of RT-mastermix toe.

Start dan de PCR-reactie. Bereid vervolgens 10 micromolaire verdunningen van elke primerset en de mastermix voor elke set primers. In een nieuwe PCR-plaat pipetteer je 20 microliter van het mastermengsel en vervolgens vijf microliter van het RT-monster in elk mengsel.

Start na het afdekken van de plaat de PCR-reactie. Zodra de PCR voorbij is, draait u de plaat gedurende 15 tot 30 seconden op 1000 G. Voeg voor PCR-zuivering 50 microliter reagens op basis van kralen toe aan elk putje en meng door te pipetteren om door te gaan met de magnetische scheiding.

Verwijder de plaat van de magnetische standaard. Resuspendeer elke pellet met 15 microliter water van PCR-kwaliteit en incubeer de plaat gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Plaats de plaat terug op de magnetische standaard en laat de kralen twee minuten pelleteren.

Pipetteer vervolgens voorzichtig 15 microliter van het supernatans van elk monster op een nieuwe PCR-plaat. Voeg vervolgens voor de voorbereiding van de bibliotheek 1,75 microliter reactiebuffer uit de voorbereidingskit van de DNA-bibliotheek en 0,75 microliter enzymmix toe aan elk monster. Draai de afgedekte plaat kort rond en draai gedurende 15 tot 30 seconden naar beneden op 1000G.

Incubeer vijf minuten bij 21 graden Celsius en vijf minuten bij 65 graden Celsius. Pipetteer drie microliter water van PCR-kwaliteit voor elk monster op een nieuwe PCR-plaat. Voeg 0,75 microliter van de voorbereide monsters en 1,25 microliter barcodes toe voor de voorbereiding van de sequentiebibliotheek.

Voeg vervolgens vijf microliter T4 DNA-ligase mastermix toe en meng goed door te pipetteren. Nadat u de plaat in de centrifuge hebt rondgedraaid, incubeert u de plaat gedurende 20 minuten bij 21 graden Celsius en gedurende 10 minuten bij 65 graden Celsius. Voeg na het poolen van alle monsters 192 microliter reagens op basis van kralen toe aan het zwembad voor PCR-zuivering.

Meng goed door te pipetteren en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Plaats de buis op een magnetische standaard. Wacht tot het supernatans helder is en er zich een parelkorrel vormt.

Verwijder het supernatans en de buis van de magnetische standaard. Voeg 700 microliter van de korte fragmentbuffer of SFB toe en meng door te pipetteren. Plaats de buis terug op de magnetische standaard en wacht tot de pellet zich vormt en de vloeistof helder is.

Gooi het supernatans weg met een pipet. Voeg 35 microliter water van PCR-kwaliteit toe aan de buis, meng door te pipetteren en incubeer gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Plaats de buis op de magnetische standaard en laat de kralen pelleteren en de vloeistof helder worden.

Pipetteer 35 microliter van het supernatans op een nieuw buisje. Bereid vervolgens het adapterligatiereactiemengsel zoals beschreven in het tekstmanuscript en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Meng 20 microliter van het reagens op basis van kralen met de ligatiereactiemix voor PCR-zuivering en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Plaats de buis op de magnetische standaard en wacht tot de kralenkorrel zich vormt en het supernatans kleurloos wordt. Gooi het supernatans voorzichtig weg door te pipetteren. Meng 125 microliter SFB in de buis en plaats deze terug op de magnetische standaard om de kralen te scheiden.

Wanneer de vloeistof helder wordt, gooit u het supernatans weg en herhaalt u het toevoegen van SFB zoals eerder gedemonstreerd. Laat de buis op de magnetische standaard 30 seconden open staan. Voeg 15 microliter van de elutiebuffer toe en meng goed door te pipetteren.

Na een korte centrifuge en incubatie bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten, plaatst u deze twee minuten op de magnetische standaard. Pipetteer 15 microliter van het supernatans in een nieuwe buis met lage binding om de concentratie te meten met een fluorometrische DNA-kwantificeringskit. Plaats vervolgens de stroomcel in het real-time DNA- en RNA-sequencingapparaat.

Steek de punt van een pipet van 1.000 microliter die is ingesteld op 200 microliter in de aanzuigpoort. Draai aan het volumeinstelwiel om het volume te verhogen totdat u de vloeistof in de punt ziet en gooi de punt weg. Voeg 800 microliter van het primingmengsel toe aan de primingpoort zonder luchtbellen en wacht vijf minuten.

Pipetteer 200 microliter van het bibliotheekmengsel in de aanzuigpoort. Sluit de afdekpoort en de aanzuigpoort. Start het sequencing-experiment in de software en selecteer Base Calling On.Deze methode detecteerde en kwantificeerde SARS-CoV-2-RNA in afvalwater- en luchtmonsters.

Afvalwatermonsters hadden een standaarddeviatie van 1,91% tot 13,98% bij de drievouden en varieerden van 3,05 keer 10 tot de drie tot 2,83 keer 10 tot de acht genkopieën per liter. Luchtmonsters varieerden van 6,17 keer 10 tot drie tot 5,48 keer 10 tot negen, met de standaarddeviatie in de duplicaten tussen 0,54% en 10,95%Zoals beschreven in dit protocol, werden de monsters gesequenced en een voorbeeld van drie gesequencede monsterresultaten wordt hier samengevat. In alle drie de monsters is de afstamming BA.5.

x werd door de Freyja-tool aangewezen als de meest voorkomende. De concentratie van afvalwatermonsters is een cruciale stap, aangezien viraal RNA in lage concentraties in afvalwater aanwezig is. En dus is deze stap van fundamenteel belang voor nauwkeurige detectie en kwantificering.

Deze procedure kan worden aangepast door verschillende primers in het RT-qPCR-protocol te gebruiken om andere infectieuze agentia te detecteren en te kwantificeren. De techniek kwantificeerde SARS-CoV-2 nauwkeurig in afvalwater- en luchtmonsters. Verschillende ziekteverwekkers kunnen vanaf verschillende locaties worden gedetecteerd en gekwantificeerd.