Gestandaardiseerde identificatie van de samengestelde structuur in de Tibetaanse geneeskunde met behulp van ionenval massaspectrometrie en meertraps fragmentatieanalyse

Deze methode kan onderzoekers helpen bij het analyseren van de structuren van Tibetaanse medicijnverbindingen, met name de componenten van de boom. Het kan inzicht geven in de kwalitatieve studie van het gehalte van verbindingen in de natuurlijke geneeskunde. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de nauwkeurigheid van de samengestelde structuur die in dit geval wordt verkregen, hoger is dan die van de database.

Deze techniek kan worden gebruikt bij de structuuranalyse van metabole tussenproducten in blaas of urine. Om te beginnen, de Tibetaanse geneeskunde Abelmoschus manihot's zaden monster voorbereiding. Weeg een gram AMS nauwkeurig af en plaats deze in een erlenmeyer met 30 milliliter 80% methanol.

Gebruik een ultrasone badsonicator op 40 kilohertz en voer extractie uit op het mengsel gedurende 30 minuten bij 25 graden Celsius. Centrifugeer het monster vervolgens gedurende vijf minuten op 14.000 g. Bereid een injectiespuit en een organisch microporeus membraanfilter van 0,22 micron voor en filter het supernatant in een monsterfles van twee milliliter.

Nadat u de schakelaar van de vacuümpomp hebt ingeschakeld, opent u de hoofdklep van de argoncilinder samen met de partiële drukklep en stelt u de druk in op ongeveer 0,3 megapascal. Open vervolgens de stikstofklep. Start de massaspectrometrie, of MS, besturingssoftware.

Klik op Verwarmde ESI-bron in het softwarepaneel en stel de MS-parameters in, waaronder verwarmingstemperatuur, gasdebieten, sproeispanning voor positieve en negatieve modi en capillaire temperatuur. Klik op de knop Toepassen om de ionenbron voor vloeistofchromatografie of LC te activeren.Bereid mobiele fasen A en B met 0,1% mierenzuur in een waterige oplossing in respectievelijk zuiver acetonitril. Ontgast ze in een ultrasoon badsonicator op 40 kilohertz gedurende ten minste 15 minuten voordat de oplossingen worden aangesloten op respectievelijk de A- en B-vloeistofpassages.

Bereid een methanolwateroplossing van 1:9 volume per volume en vul deze vervolgens handmatig in de reinigingsvloeistofflessen van de pomp en injector. Nadat u de LC-MS-besturingssoftware hebt gestart, klikt u op Direct Control om het LC-bedieningspaneel te openen. Open de spoelklep tegen de klok in op de pompmodule.

Klik op Meer optie om de pompinstelling te openen en de spoelparameters gedurende drie minuten in te stellen op vijf milliliter per minuut. Klik op Leegmaken om het verwijderen van de bubbel te starten. Als u klaar bent, sluit u de spoelklep.

Klik vervolgens op Prime Syringe om de spuit gedurende drie cycli te spoelen, Wash Buffer Loop om de lus gedurende één cyclus te spoelen en Wash Needle Externally om de naald gedurende één cyclus te wassen. Plaats de monsterfles in de sampler. Klik op Instrument Setup om het venster Method Editing (Methodebewerkingsvenster) te openen en klik op Nieuw om een nieuwe LC-MS-instrumentmethode te maken.

Stel een totale runtime voor de methode vast en stel de druklimiet in. Totale stroomsnelheid, stroomgradiënt, monstertemperatuur, kolomtemperatuur en gereedheidstemperatuurdelta in het venster Methodebewerking. Selecteer voor de MS-methode het experimenttype Algemeen MS of MSn.

Voer waarden in van de acquisitietijd, polariteit, massabereik, omleidingswaardenummer en duur. Klik op Opslaan om de instellingen als instrumentmethode te configureren. Klik op Sequence Setup om de sequentietabel te openen, waarin u de informatie over het monstertype, het bestand, de naam, het pad, de sample-ID, de instrumentmethode, de positie en het injectievolume invoert.

Neem de volgordetabel op door op Opslaan te klikken, implementeer vervolgens de instellingen en start de MS-acquisitie. Om de MS-gegevens in de gegevensverwerkingssoftware te laden, dubbelklikt u op het onbewerkte bestand in Verkenner. Selecteer in het basispiekchromatogram BPI het maximale gebied onder de curve of AUC door met de muis te klikken en te slepen.

Het overeenkomstige MS-spectrum wordt in hetzelfde venster weergegeven. Selecteer een gericht ion voor de volgende MS/MS-analyse. Open het venster Methodebewerking opnieuw en stel in de msn-instellingentabel de m/z van het doelion in op één decimaal in de kolom Bovenliggende massa.

Selecteer vervolgens de botsingsmodus en voer de botsingsenergie of CE-waarde in. Stel het MS/MS-scanbereik in. Klik op Opslaan om de MS-methode op te nemen en voer een nieuwe bestandsnaam in de volgordetabel in.

Klik op de knop Start om de MS/MS-acquisitie te starten. Zodra de acquisitie is voltooid, dubbelklikt u op het RAW-bestand in Explorer om het MS / MS raw-bestand in de gegevensverwerkingssoftware te laden. Identificeer het sterkste fragmention in het spectrum en voer de m/z-waarde in de msn-methodelijst in.

Stel in de msn-instellingentabel de MS3-parameters in, waaronder botsingsmodus, CE-waarde en scanbereik. Klik nogmaals op Opslaan om de MS-methode op te nemen en voer een nieuwe bestandsnaam in de volgordetabel in. Klik op Start om de MS3-acquisitie te starten.

Zoals eerder gedemonstreerd, dubbelklikt u op het RAW-bestand in de Verkenner om het MS3 raw-bestand in de gegevensverwerkingssoftware te laden en herhaalt u de stappen om het MS4-spectrum te verkrijgen. Om de gegevens te analyseren, dubbelklikt u op de onbewerkte bestanden om alle massaspectra van MS naar MSn te openen. Bereken handmatig de m/z-verschilwaarden tussen het ion en de bijbehorende fragmentionen.

Teken vervolgens handmatig de kernstructuur volgens de MS4-resultaten en leid de oorspronkelijke structuur af met behulp van functionele groepen of moleculaire segmenten op basis van de m / z-verschilwaarde. Teken handmatig de moleculaire splitsingspaden volgens elke moleculaire structuur in MSn. De ESI-MS van modelkoolhydraatcellobiose produceerde het geproteïniseerde molecuul M H bij m/z 365 in positieve modus.

De product ion scan, of CID MS/MS resulteerde in een tweede fragmention bij m/z 305. Verder resulteerden MS3- en MS4-analyses achtereenvolgens in het derde en vierde fragmention bij respectievelijk m/z 254 en m/z 185. De MS/MS-analyse onthulde de volgorde van ionfragmentaties, namelijk ringopeningshydrolyse, CC-splitsing en uitdroging.

Deze methode werd dus geschikt bevonden voor koolhydraten. De voorlopige kwalitatieve analyse van AMS met behulp van LC Q-TOF MS onthulde de aanwezigheid van talrijke onbekende verbindingen. De negatieve MSn-analyse van het M H-ion bij m/z 617 leverde een tweede fragmention op bij m/z 571.

De MS3-analyse van dit fragmention leverde een derde fragmention op bij m/z 525 door het verlies van hydroxyethyl als methanol overeenkomend met 32 dalton en hydroxyl als water, wat 18 dalton is. De MS4-analyse leverde vierde fragmentionen op bij m/z 344 en 273. Handmatige identificatie van de kernstructuur onthulde de moleculaire structuur van de verbinding bij m/z 617 en zijn splitsingspaden in MSn.

De productionenscan van het M H-ion van een andere onbekende verbinding werd uitgevoerd en de moleculaire structuur en het splitsingsmechanisme werden ook onthuld. Nadat de vacuümpomp is ingeschakeld, wacht u ten minste vijf uur om te zorgen voor voldoende vacuümgraad voor de experimentele omstandigheden. Statistische analyse kan worden gebruikt om de fragmenten met dezelfde of vergelijkbare massa-tot-ladingsverhouding te verzamelen.

Naarmate de massaspectrometrie-oplossing toeneemt, kan deze techniek onderzoekers helpen nieuwere verbindingen in natuurlijke geneesmiddelen te verkrijgen.