Bepaling van zelf-(in)compatibiliteit en inter-(in)compatibiliteitsrelaties in citrusvruchten met behulp van handmatige bestuiving, microscopie en S-genotype-analyses

Deze techniek kan het S-genotype efficiënt identificeren en de zelfincompatibiliteit van citrusvruchten nauwkeurig identificeren, wat de nodige informatie oplevert voor het selecteren van geschikte stuifbomen. Dit is een tijdbesparende, eenvoudige en betrouwbare techniek om de juiste ouderbomen in veredelingsprogramma's te selecteren. Deze techniek is eenvoudig en gemakkelijk te doen en het doen van experimenten voor de eerste keer vereist geduld en zorg.

De S-genotype-identificatie en S-specifieke primerontwerpen hebben meer aandacht en zorg nodig. Yu Hu, een masterstudent uit mijn laboratorium, demonstreert de procedure. Begin met het verzamelen van stuifmeel door de Majia pomelo, Citrus maxima, bloemen naar het laboratorium te brengen.

Verzamel de helmknoppen met een pincet en plaats ze in een petrischaaltje met filterpapier. Droog de stuifmeelkorrels door de petrischalen met de helmknoppen 24 uur in een oven van 28 graden Celsius te plaatsen. Bewaar het stuifmeel na het drogen in een Micro Centron luchtdichte ziplock-zak met kleurveranderende silicagel.

Sluit de zak en label de zak met de naam van de stuifmeelsoort en de datum van opslag. Giet 300 microliter van het vloeibare medium in de dop van een centrifugebuis van twee milliliter en strooi het stuifmeel gelijkmatig met behulp van een bestuivingsborstel. Doe het stuifmeel in een bevochtigde zwarte doos en incubeer gedurende 12 uur bij 28 graden Celsius.

Snijd na incubatie de bovenste punt van een millimeter van een pipetpunt van 1.000 microliter en zuig het stuifmeel op met een kleine hoeveelheid kweekoplossing. Plaats het stuifmeel in het midden van de microscoopglaasje en bedek het met een afdekslip. Als u klaar bent, observeert u het monster met een omgekeerde microscoop met behulp van een 10X-objectief.

Voer drie onafhankelijke replicaties uit met ongeveer dezelfde pollendichtheid voor elke replicatie. Gebruik voor bestuiving een bestuivingsborstel om een voldoende hoeveelheid levensvatbaar stuifmeel op het oppervlak van het stigma te verspreiden, zodat de stamper niet wordt beschadigd. Bedek de bestoven bloemen met een papieren sulfaatzak en voorkom bestuiving door genotypisch verschillende pollen door de zak af te sluiten met een paperclip.

Schrijf de naam van de soort en het aantal en het tijdstip van bestuiving op het etiket. Hang het etiket op de takken bij de bestoven bloemen. Verwijder de bestuivingszakken ongeveer drie tot vier dagen na de bestuiving en verzamel de bestoven bloemen in ritssluitingszakken.

Verwijder onmiddellijk de bloemblaadjes, recipiënten en eierstokken van de bloemen en dompel het stigma dat is samengesmolten in een centrifugebuis met een vers bereide fixatieve oplossing. Incubeer het stigma en de stijl in de fixatieve oplossing 's nachts bij vier graden Celsius. Gooi de volgende dag de fixatieve oplossing weg voordat je het stigma wast en stijl twee tot drie keer in 95% ethanol.

Voeg vervolgens 70% ethanoloplossing toe aan de stijl, zodat het monster volledig in de oplossing is ondergedompeld. De stijlen in dit stadium kunnen één tot twee maanden bij vier graden Celsius worden bewaard. Voor anilineblauwe kleuring wast u de stijlmonsters die zijn opgeslagen in 70% ethanol drie tot vier keer met gedestilleerd water.

Dompel het onder in een natriumhydroxideoplossing met vier molken en sluit het af voordat u het gedurende 60 minuten in een waterbad van 65 graden Celsius incubeert. Tijdens deze stap verandert de kleur van de stijl van geel-wit naar oranje-rood. Week vervolgens de stijlen in gedestilleerd water.

Gooi na 30 minuten het gedestilleerde water weg en was de stijlen drie tot vier keer met gedestilleerd water of totdat de kleur van de stijl geel wordt. Voeg vervolgens het anilineblauw toe totdat het monster is ondergedompeld en incuber gedurende 12 uur in het donker. Observeer de groei van de stuifmeelbuis onder de fluorescentiemicroscoop.

Plaats de dia op een vlakke tafel. Verdeel de stijl in twee helften langs de lengteas met behulp van een scalpel. Plaats de ene helft van de stijl op een glazen dia en voeg twee tot drie druppels polyethyleenglycol toe aan het oppervlak van de dia.

Bedek het vervolgens met een afdekbrief. Als u klaar bent, plaatst u de dia op het microscooppodium boven het diafragma en visualiseert u met behulp van een 10X-objectief. Gebruik het DAPI-filter en observeer de groei van de pollenbuis.

Observeer vijf stijlen voor elk type bestuiving. De levensvatbaarheid van citrusmaxima en kiemsnelheden werden gekwantificeerd met behulp van fluorescerende microscopie. Het compatibele stuifmeel ontkiemde met succes op het oppervlak van het stigma en produceerde een normale stuifmeelbuis, die groeide en uiteindelijk leidde tot bevruchting in de eierstok.

Incompatibele stuifmeelbuizen daarentegen groeiden door ongeveer 2/3 van de stijl en stopten vervolgens met groeien. Agarose-gel-elektroforese detecteerde het DNA-product versterkt met behulp van de S-locus-specifieke primers. Het toonde de amplificatie van het DNA-product tussen 500 en 1.000 basenparen.

Het overeenkomstige S-genotype werd geïdentificeerd. 21 S-haplotypen in verschillende citrussoorten werden geïdentificeerd met behulp van deze methode. De bestuivingsstap is van cruciaal belang.

Alleen de succesvolle bestuiving kan zorgen voor de daaropvolgende observatie van stuifmeelbuizen. De techniek werd gebruikt om de zelfincompatibiliteitskenmerken te analyseren en om de vrouwelijke determinanten van de zelfincompatibiliteit te onderzoeken en te identificeren. Deze methode is belangrijk voor zelfincompatibiliteitsonderzoek en fokprogramma's.

Het kan ook de boerengemeenschap vergemakkelijken bij het selecteren van stuifmeelbomen voor hun boomgaarden.