Name: Bepaling van zelf-(in)compatibiliteit en inter-(in)compatibiliteitsrelaties in citrusvruchten met behulp van handmatige bestuiving, microscopie en S-genotype-analyses (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Leer hoe u zelf-(in)compatibiliteit in Citrus maxima bepaalt met handmatige bestuiving, microscopie en S-genotype-analyse. Deze methode helpt fokkers bij het selecteren van geschikte bestuiversbomen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project werd financieel ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (32122075, 32072523).

1. Voorbereiding voor anilineblauwe kleuring
<ol><li>Bereid de volgende reagentia en hulpmiddelen voor het experiment voor: een bestuiverborstel, een pincet, een potlood, sulfaatpapier, een bestuivingszak, zakken met ritssluiting, paperclips, formaldehyde, ijsazijn, absolute ethanol, centrifugebuizen, tang, lijmdruppels, glasglaasjes, coverslips, scalpels en polyethyleenglycol.</li>
	<li>Bereid in vitro kiemkracht met 0,02% MgSO4, 0,01% KNO 3, 0,03% Ca(NO 3)2, 0,01% H 3 BO 3, 20% PEG-4000 en 15% sucrose. Stel de pH in op 6,0-6,2 met KOH. Gebruik een magneetroerder omdat PEG-4.000 moeilijk op te lossen is.</li>
	<li>Bereid de fixatieve oplossing van Carnoy, die absolute ethanol en ijsazijn is, gemengd in een verhouding van 3: 1. Bereid FAA-fixatieoplossing, die bestaat uit 40% formaldehyde, 80% ethanol en ijsazijn (1:8:1). Bereid 4 M natriumhydroxide (NaOH) en anilineblauwe oplossing, die 0,1% anilineblauw is in 0,1 M K3PO4. Gebruik een amberkleurige fles om de anilineblauwe oplossing te bewaren omdat deze lichtgevoelig is.</li>
</ol>2. Stuifmeel verzamelen
<ol><li>Ken de bloeiperiode van de experimentele bomen (Ma jia pummelo in deze studie) van tevoren. Verzamel volwassen ongeopende bloemen vanaf het begin van de bloeiperiode tot de piekbloeifase en doe ze in een zak met ritssluiting. De bloemen kunnen 24 uur bij 4 °C in de koelkast bewaard worden.</li>
	<li>Neem de bloemen mee naar het lab. Gebruik een pincet om de helmknoppen te verzamelen en plaats ze in een petrischaaltje met filterpapier. Verzamel helmknoppen van 20 tot 30 bloemen.</li>
	<li>Plaats de petrischaal met de helmknoppen gedurende 24 uur in een oven van 28 °C tot de stuifmeelkorrels droog zijn. Voor de gedetailleerde bloemorganisatie, zie Hu et al.9.</li>
	<li>Doe het gedroogde stuifmeel in een centrifugebuis van 1,5 ml. Bewaar het stuifmeel in een luchtdichte zak met ritssluiting met kleurveranderende silicagel (droogmiddel). Sluit de zak en label de zak met de naam van de stuifmeelsoort en de datum van opslag. Het gedroogde stuifmeel kan 96 weken in een koelkast van −20 °C worden bewaard16.</li>
</ol>3. In vitro stuifmeelkiemingstest
<ol><li>Giet 300 μL vloeibaar medium in een celkweekschaal of de dop van een centrifugebuis van 2 ml en strooi het stuifmeel gelijkmatig met behulp van een bestuivingsborstel. Incubeer het stuifmeel bij 28 °C in een bevochtigde donkere omgeving gedurende 12 uur.</li>
	<li>Verwijder de bovenste 1 mm van de punt van een pipetpunt van 1.000 μL. Gebruik de pipet om het stuifmeel te absorberen met een kleine hoeveelheid kweekoplossing en verplaats het naar het midden van de microscoopglaas. Bedek het met een coverslip. Observeer het monster met een omgekeerde microscoop met behulp van een 10x objectief.</li>
	<li>Voer drie onafhankelijke replicaties uit met ongeveer dezelfde pollendichtheid voor elke replicatie17. Beheer visueel de hoeveelheid stuifmeel, zorg ervoor dat de hele petrischaal bedekt is met stuifmeel en dat elke petrischaal een bijna gelijke hoeveelheid stuifmeel bevat.</li>
	<li>Het gekiemde stuifmeel produceert een stuifmeelbuis met een lengte van ongeveer twee keer de diameter. Bereken de kiemkracht uit 20 visuele velden, wat het percentage gekiemd stuifmeel in alle stuifmeelvelden geeft.</li>
</ol>4. Bestuiving
<ol><li>Kies een zonnige dag zonder wind voor bestuiving. Selecteer 10 volledig ontwikkelde knoppen die op het punt staan te openen, pel de bloemblaadjes voorzichtig terug en zorg ervoor dat ze niet worden gekneusd.</li>
	<li>Gebruik een bestuivingsborstel om een voldoende hoeveelheid levensvatbaar stuifmeel op het oppervlak van het stigma te verspreiden en zorg ervoor dat u de stamper niet beschadigt. Gebruik voor zelfbestuiving het stuifmeel van dezelfde plant/cultivar. Gebruik voor kruisbestuiving het stuifmeel van een plant met een ander genotype.</li>
	<li>Bedek de bestoven bloemen met een papieren sulfaatzak. Gebruik een paperclip om de zak af te sluiten en bestuiving door genotypisch verschillende pollen te voorkomen.</li>
	<li>Schrijf de naam van de soort en het aantal en het tijdstip van bestuiving op het etiket. Hang het etiket op de takken bij de bestoven bloemen.</li>
</ol>5. Bemonstering, fixatie en conservering
<ol><li>Verwijder de bestuivingszakken ongeveer 3-4 dagen na de bestuiving en verzamel de bestoven bloemen in zakken met ritssluiting.</li>
	<li>Verwijder onmiddellijk de bloemblaadjes, recipiënten en eierstokken van de bloemen en dompel de stigma's die tot stijlen zijn versmolten onder in een centrifugebuis met een vers bereide fixatieve oplossing. Incubeer de stigma's en stijlen in de fixatieve oplossing 's nachts bij 4 °C.</li>
	<li>Gooi de volgende dag de fixatieve oplossing weg en was de stigma's en stijlen twee tot drie keer in 95% ethanol.</li>
	<li>Breng de stijlen over naar een 70% ethanoloplossing. Zorg ervoor dat het monster volledig is ondergedompeld in de oplossing. De stijlen in dit stadium kunnen 1-2 maanden bij 4 °C worden bewaard.</li>
</ol>6. Aniline blauwe kleuring
<ol><li>Was de stijlmonsters die zijn opgeslagen in 70% ethanol met gedestilleerd water drie tot vier keer. Dompel onder in 4 M NaOH-oplossing, sluit af en incubeer gedurende 60 minuten in een waterbad van 65 °C. Tijdens deze stap verandert de kleur van de stijl van geel-wit naar oranje-rood.</li>
	<li>Week de stijlen in gedestilleerd water gedurende 30 minuten. Gooi het gedestilleerde water weg en was de stijlen drie tot vier keer met gedestilleerd water of totdat de kleur van de stijl geel wordt.</li>
	<li>Plaats het monster in een buis van 10 ml, voeg het anilineblauw toe totdat het monster is gedompeld en verf gedurende 12 uur in het donker.</li>
	<li>Observeer de groei van de stuifmeelbuis met een fluorescentiemicroscoop.</li>
</ol>7. Fluorescentiemicroscopie
<ol><li>Voordat u de monsters observeert, plaatst u de dia op een platte tafel en voegt u twee tot drie druppels polyethyleenglycol toe aan het oppervlak van de dia.</li>
	<li>Was de in acht te nemen stijl met gedestilleerd water. Gebruik een scalpel om het in twee helften langs de lengteas te verdelen. Plaats de ene helft van de stijl op de glazen plaat en dek af met een coverslip.</li>
	<li>Plaats de dia op het podium van de microscoop boven het diafragma en visualiseer met behulp van een objectief van 10x. Gebruik het DAPI-filter (excitatie: 325-375 nm; emissie: 435-485 nm). Observeer vijf stijlen voor elk type bestuiving. Observeer de groei van de stuifmeelbuis.</li>
</ol>8. PCR-gebaseerde S-genotype-identificatie
<ol><li>Extraheer het genomische DNA uit het stigmamonster met behulp van de CTAB-methode18.<ol><li>Doe de verzamelde bladeren in een centrifugebuis van 2 ml en vries ze in vloeibare stikstof. Bereid HCl:EDTA:NaCl:H2O-buffer in een verhouding van 1:1:3:5 en een chloroform isoamylalcoholmengsel in een verhouding van 24:1</li>
		<li>Voeg 10 ml van de bereide buffer, 0,2 g CTAB en 200 μl mercaptoethanol toe aan een centrifugebuis van 50 ml en doe ze gedurende 5 minuten in een waterbad bij 65 °C totdat de oplossing helder en transparant wordt.</li>
		<li>Doe de messen in een vijzel, voeg de bevroren monsters toe, voeg vloeibare stikstof toe en maal. Doe het gemalen monster in een centrifugebuis van 2 ml, voeg 600 μL CTAB-mengsel toe, doe het gedurende 60 minuten in een waterbad bij 65 °C en meng het elke 30 minuten ondersteboven.</li>
		<li>Voeg 700 μL van het chloroform isoamylalcoholmengsel (24:1) toe en meng ondersteboven gedurende 10 minuten. Centrifugeer bij 24 °C bij 12.000 x g gedurende 10 minuten, pipetteer het supernatant en breng over in een centrifugebuis van 1,5 ml.</li>
		<li>Voeg 60 μL 5 M NaCl-oplossing en 1 ml absolute ethanol toe en meng ondersteboven. Invriezen bij −20 °C gedurende 30 minuten en centrifugeren bij 24 °C en 9.000 x g gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Gooi het supernatant weg, voeg 1 ml 70% ethanoloplossing toe en laat 1-2 uur op kamertemperatuur staan. Centrifugeer bij 24 °C, 9.000 x g gedurende 5 minuten, gooi het supernatant weg, zuig de overtollige ethanoloplossing aan en droog gedurende 5 minuten aan de lucht.</li>
		<li>Voeg 100 μL steriel water toe om op te lossen, meet de DNA-concentratie met een spectrofotometer en vries in in een vriezer van -4 °C voor langdurige opslag.</li>
		<li>Configureer het RT-PCR-reactiesysteem. Bereid het volgende reactiemengsel voor 10 μL met 5 μL 2x PCRMix, 0,25 μL elk van voorwaartse en omgekeerde primer, 1 μL DNA (100 ng / μL) en 3,5 μL van H2O.</li>
	</ol></li>
	<li>Stel het PCR-programma in volgens tabel 1. Het PCR-programma voor alle isovormen was 95 °C gedurende 5 min 32x (95 °C gedurende 30 s, 55 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 1 min) en 72 °C gedurende 5 min. Scheid de producten op 1,5% TAE-agarose gels en fotografeer9. Controleer het gespecificeerde S-genotype met behulp van genomisch DNA.</li>
</ol>

<ol><li>Matsumoto, D., Tao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+S-RNases+by+an+S+locus+F-box+like+protein+and+an+S+haplotype-specific+F-box+like+protein+in+the+Prunus-specific+self-incompatibility+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Recognition of S-RNases by an S locus F-box like protein and an S haplotype-specific F-box like protein in the Prunus-specific self-incompatibility system.</a> Plant Molecular Biology. 100 (4-5), 367-378 (2019).</li>
<li>Goldberg, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+selection+maintains+self-incompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Species selection maintains self-incompatibility.</a> Science. 330 (6003), 493-495 (2010).</li>
<li>Zhang, L., Wang, R., Zhao, G., Wang, A., Lin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+on+fruit+quality+of+Guangfeng+Ma+jia+pummelo+and+Pinghe+red+pummelo%5BTitle%5D)+AND+%22China+Agricultural+Science+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Comparative study on fruit quality of Guangfeng Ma jia pummelo and Pinghe red pummelo.</a> China Agricultural Science Bulletin. 37 (22), 126-130 (2021).</li>
<li>Min, H. E., Chao, G. U., Juyou, W. U., Shaoling, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+on+self-incompatibility+mechanism+in+fruit+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Horticulturae+Sinica%22%5BJournal%5D)">Recent advances on self-incompatibility mechanism in fruit trees.</a> Acta Horticulturae Sinica. 48 (4), 759-777 (2021).</li>
<li>Fujii, S., Kubo, K., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-self-+and+self-recognition+models+in+plant+self-incompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Non-self- and self-recognition models in plant self-incompatibility.</a> Nature Plants. 2 (9), 2-9 (2016).</li>
<li>Meng, X., Sun, P., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-RNase-based+self-incompatibility+in+Petunia+inflata%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">S-RNase-based self-incompatibility in Petunia inflata.</a> Annals of Botany. 108 (4), 637-646 (2011).</li>
<li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+self-compatibility+by+a+mutant+Sm-RNase+in+citrus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Evolution of self-compatibility by a mutant Sm-RNase in citrus.</a> Nature Plants. 6 (2), 131-142 (2020).</li>
<li>Thomas, S. G., Franklin-Tong, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-incompatibility+triggers+programmed+cell+death+in+Papaver+pollen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-incompatibility triggers programmed cell death in Papaver pollen.</a> Nature. 429, 305-309 (2004).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulated+expression+of+S2-RNase+attenuates+self-incompatibility+in+%26%2334%3BGuiyou+No.+1%26%2334%3B+pummelo%5BTitle%5D)+AND+%22Horticulture+Research%22%5BJournal%5D)">Downregulated expression of S2-RNase attenuates self-incompatibility in &#34;Guiyou No. 1&#34; pummelo.</a> Horticulture Research. 8 (1), 199(2021).</li>
<li>Guo, H., Halitschke, R., Wielsch, N., Gase, K., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mate+selection+in+self-compatible+wild+tobacco+results+from+coordinated+variation+in+homologous+self-Incompatibility+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Mate selection in self-compatible wild tobacco results from coordinated variation in homologous self-Incompatibility genes.</a> Current Biology. 29 (12), 2020-2030 (2019).</li>
<li>Sun, P., Li, S., Lu, D., Williams, J. S., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pollen+S-locus+F-box+proteins+of+petunia+involved+in+S-RNase-based+self-incompatibility+are+themselves+subject+to+ubiquitin-mediated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Pollen S-locus F-box proteins of petunia involved in S-RNase-based self-incompatibility are themselves subject to ubiquitin-mediated degradation.</a> The Plant Journal. 83 (2), 213-223 (2015).</li>
<li>Hua, Z., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+components+of+a+putative+petunia+S-locus+F-box-containing+E3+ligase+complex+involved+in+S-RNase-based+self-incompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of components of a putative petunia S-locus F-box-containing E3 ligase complex involved in S-RNase-based self-incompatibility.</a> Plant Cell. 18 (10), 2531-2553 (2006).</li>
<li>Entani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-proteasome-mediated+degradation+of+S-RNase+in+a+solanaceous+cross-compatibility+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-proteasome-mediated degradation of S-RNase in a solanaceous cross-compatibility reaction.</a> The Plant Journal. 78 (6), 1014-1021 (2014).</li>
<li>Abdallah, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+self-incompatibility+and+genetic+diversity+in+diploid+and+hexaploid+plum+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Analysis of self-incompatibility and genetic diversity in diploid and hexaploid plum genotypes.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 896(2019).</li>
<li>Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+production+in+the+new+generation+of+apricot+cultivars%3A+self-incompatibility%2C+S-RNase+allele+identification%2C+and+incompatibility+group+assignment.+%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. </a> Frontiers in Plant Science. 9, 527(2018).</li>
<li>Yuan, S. C., Chin, S. W., Lee, C. Y., Chen, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phalaenopsis+pollinia+storage+at+sub-zero+temperature+and+its+pollen+viability+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Botanical+Studies%22%5BJournal%5D)">Phalaenopsis pollinia storage at sub-zero temperature and its pollen viability assessment.</a> Botanical Studies. 59 (1), 1(2018).</li>
<li>Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+evolution+of+genes+related+to+self-incompatibility+in+citrus%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Identification and evolution of genes related to self-incompatibility in citrus.</a> , Huazhong Agricultural University. Wu'han, China. PhD Thesis (2019).</li>
<li>Cheng, Y. J., Guo, W. W., Yi, H. L., Pang, X. M., Deng, X. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+protocol+for+genomic+DNA+extraction+from+Citrus+species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Reporter%22%5BJournal%5D)">An efficient protocol for genomic DNA extraction from Citrus species.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 21 (2), 177-178 (2003).</li>
<li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+S-genotypes+of+63+pummelo+germplasm+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Horticulturae+Sinica%22%5BJournal%5D)">Identification of S-genotypes of 63 pummelo germplasm resources.</a> Acta Horticulturae Sinica. 49 (5), 1111-1120 (2021).</li>
<li>de Nettancourt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incompatibility+in+angiosperms%5BTitle%5D)+AND+%22Sexual+Plant+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Incompatibility in angiosperms.</a> Sexual Plant Reproduction. 10, 185-199 (1997).</li>
<li>Igic, B., Lande, R., Kohn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+self-incompatibility+and+its+evolutionary+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Plant+Sciences%22%5BJournal%5D)">Loss of self-incompatibility and its evolutionary consequences.</a> International Journal of Plant Sciences. 169 (1), 93-104 (2008).</li>
<li>Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+pollination+requirements+in+Japanese+plum+by+phenological+monitoring%2C+hand+pollinations%2C+fluorescence+microscopy+and+molecular+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishing pollination requirements in Japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping.</a> Journal of Visualized Experiments. (165), e61897(2020).</li>
<li>Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+self-+and+inter-%28in%29compatibility+relationships+in+apricot+combining+hand-pollination%2C+microscopy+and+genetic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e60241(2020).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze niets te onthullen hebben.

In fruitgewassen zijn zowel parthenocarpie als SI belangrijke eigenschappen omdat ze de weg vrijmaken voor pitloos fruit - een eigenschap die zeer wordt gewaardeerd door consumenten. Zelfincompatibiliteit bevordert de afwijzing van zelfpollen en voorkomt zo inteelt20. Onder citrusvruchten is pummelo een zelfincompatibele variëteit7. Bijna 40% van alle angiospermsoorten vertonen SI21. Deze eigenschap voorkomt het zetten van fruit, verlaagt de opbrengs...

Zelfincompatibiliteit (SI) is een genetisch gecontroleerd mechanisme dat aanwezig is in ongeveer 40% van de angiospermsoorten. In dit proces stoot de stamper stuifmeel af van een plant met hetzelfde SI-genotype en voorkomt zo zelfbevruchting 1,2. Ma jia pummelo is een lokale variëteit in de provincie Jinagsu, China, met de uitstekende kwaliteiten van groot, roze fruit, een rijk sapgehalte, een zoetzure smaak en een dikke schil3. Hoewel SI outcrossing bevordert, heeft het een negatieve invloed op de opbrengst en kwaliteit van fruit4 en vereist het geschikte bestuiverbomen met verschillende SI-genotypen voor betrouwbare vruchtzettingssnelheden en hoge opbrengsten. Op dit moment zijn er twee hoofdtypen SI, sporofytische zelfincompatibiliteit (SSI), vertegenwoordigd door Brassicaceae, en gametofytische zelfincompatibiliteit (GSI), vertegenwoordigd door Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae en Solanaceae 5,6,7,8.
Citrus is een van de belangrijkste fruitgewassen ter wereld. Het op S-RNase gebaseerde GSI-systeem is te vinden in veel citrustoetredingen en heeft een negatieve invloed op de vruchtzettingssnelheid9. In dit systeem wordt SI gecontroleerd door de S-locus, een enkele polymorfe locus met twee complexe allelen die stamper S-determinanten en stuifmeel S-determinanten 7 dragen. De vrouwelijke determinant is de S ribonuclease (S-RNase), en de mannelijke determinant is de S locus F-box (SLF)7. De cellen van de stamper scheiden S-RNase-eiwitten af. De niet-zelf S-RNases worden herkend door de SLF-eiwitten, wat leidt tot de ubiquitinatie en afbraak van de niet-zelf S-RNases door de 26S proteasoomroute. Daarentegen zijn de zelf S-RNases in staat om de groei van stuifmeelbuis (PT) te accumuleren en te remmen omdat ze de SLF-eiwitten ontwijken en daarom worden voorkomen van ubiquitinzatie10,11,12,13.
Hier rapporteren we een in vivo techniek die nuttig is voor het identificeren van S-genotypen en graden van pollencompatibiliteit en incompatibiliteit. Het protocol omvat het extraheren van totaal DNA uit bladeren en het voorspellen van het S-genotype met behulp van S-specifieke primers. Bovendien leveren anilineblauwe kleuring en fluorescentiemicroscopie gevolgd door handbestuiving bewijs voor de mate van compatibiliteit en incompatibiliteit. De semi-in vivo bestuivingsprocedure, waarbij bloemen handmatig worden bestuifd in het laboratorium14,15, is ook aangepast om de mate van zelfcompatibiliteit en incompatibiliteit te beoordelen. We hebben echter ook veldbestuiving gebruikt, gevolgd door het zakken van bloemen om besmetting door ongewenst stuifmeel te voorkomen, zodat de stuifmeelbuizen zich in natuurlijke omstandigheden kunnen ontwikkelen. Dit protocol is eenvoudig en duidelijk en biedt de informatie die nodig is voor de succesvolle selectie van geschikte bestuiverbomen.

<table><tbody><tr><td>absolute ethanol</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Aniline blauw</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boorzuur, H3BO3</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10004818</td><td></td></tr><tr><td>Bruine fles</td><td>Labgic Technology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calciumnitraat tetrahydraat, Ca(NO3 )2</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>80029062</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeerbuis</td><td>Labgic Technology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrifugebuizen</td><td>Labgic Technology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CTAB</td><td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td><td>57-09-0(CAS)</td><td></td></tr><tr><td>Druppel</td><td>Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur, EDTA</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10009617</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10010018</td><td></td></tr><tr><td>Volledig automatische snelle molen voor monsters</td><td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd</td><td>Tissuelyser-96</td><td></td></tr><tr><td>IJsazijnzuur</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10000218</td><td></td></tr><tr><td>Slijpbuis</td><td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoamyl alcohol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10003218</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>80109218</td><td></td></tr><tr><td>Label</td><td>M&amp;G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DMi8</td><td>Shanghai Leica Co.,Ltd</td><td>21903797</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat heptahydraat, MgSO4</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10013018</td><td></td></tr><tr><td>MICROSCOPE Dekglazen</td><td>Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10019318</td><td></td></tr><tr><td>papierclips</td><td>M&amp;G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potlood</td><td>M&amp;G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bestuivende borstel</td><td>Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleenglycol, PEG 6000</td><td>Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd</td><td>DH229-1</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleenglycol, PEG-4000</td><td>Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd</td><td>1521GR500</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxide, KOH</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10017008</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumnitraat, KNO3</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10017218</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diapositiva</td><td>Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide, NAOH</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10021418</td><td></td></tr><tr><td>Sulfaatpapier</td><td>Taizhou Jinnong Mesh Factory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermostaat waterbad</td><td>Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd</td><td>L-909193</td><td></td></tr><tr><td>Trichloormethaan</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10006818</td><td></td></tr><tr><td>Tripotassiumfosfaat tribasis trihydraat, K3PO4</td><td>Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>20032318</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td><td>1185-53-1</td><td></td></tr><tr><td>Ziplock-zakken</td><td>M&amp;G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td><td>60-24-2(CAS)</td><td></td></tr></tbody></table>

bepaling van zelf-(in)compatibiliteit en inter-(in)compatibiliteitsrelaties in citrusvruchten met behulp van handmatige bestuiving, microscopie en s-genotype-analyses

Determination of Self-(In)compatibility and Inter-(In)compatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses

Citrus maakt gebruik van op S-RNase gebaseerde zelfincompatibiliteit om zelfpollen af te wijzen en vereist daarom nabijgelegen bestuiverbomen voor succesvolle bestuiving en bevruchting. Het identificeren van geschikte variëteiten om als bestuivers te dienen, is echter een tijdrovend proces. Om dit probleem op te lossen, hebben we een snelle methode ontwikkeld voor het identificeren van bestuivingscompatibele citruscultivars die gebruik maakt van agarose-gel-elektroforese en anilineblauwe kleuring. Pollencompatibiliteit wordt bepaald op basis van de identificatie van S-genotypen door het totale DNA te extraheren en PCR-gebaseerde genotyperingstests uit te voeren met specifieke primers. Bovendien worden stijlen 3-4 dagen na handmatige bestuiving verzameld en wordt anilineblauwe kleuring uitgevoerd. Ten slotte wordt de groeistatus van de pollenbuizen waargenomen met een fluorescentiemicroscoop. Pollencompatibiliteit en -incompatibiliteit kunnen worden vastgesteld door te observeren of de groei van de stuifmeelbuis respectievelijk normaal of onderdrukt is. Vanwege zijn eenvoud en kosteneffectiviteit is deze methode een effectief hulpmiddel voor het bepalen van de stuifmeelcompatibiliteit en incompatibiliteit van verschillende citrusvariëteiten om incompatibiliteitsgroepen en incompatibiliteitsrelaties tussen verschillende cultivars vast te stellen. Deze methode levert informatie die essentieel is voor de succesvolle selectie van geschikte bestuiverbomen en vergemakkelijkt zo de oprichting van nieuwe boomgaarden en de selectie van geschikte ouders voor fokprogramma's.

Voor de experimenten die hier werden gedaan, werden volwassen bloemen geselecteerd, de helmknoppen verzameld, gedroogd in een oven en het stuifmeel werd gedurende 12 uur ontkiemd bij 28 °C. De levensvatbaarheid van stuifmeel en de kiemkracht werden gekwantificeerd zoals weergegeven in figuur 1.
Citrus werd handmatig bestoven en de pollencompatibiliteit en incompatibiliteit werden beoordeeld met behulp van anilineblauwe kleuring en fluorescentiemicroscopie. Het com...

Dit protocol biedt een snelle methode voor het bepalen van stuifmeelcompatibiliteit en incompatibiliteit in citruscultivars.

Bepaling van zelf-(in)compatibiliteit en inter-(in)compatibiliteitsrelaties in citrusvruchten met behulp van handmatige bestuiving, microscopie en S-genotype-analyses

Citrus uses S-RNase-based self-incompatibility to reject self-pollen and, therefore, requires nearby pollinizer trees for successful pollination and ...

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/65056.jpg

Deze techniek kan het S-genotype efficiënt identificeren en de zelfincompatibiliteit van citrusvruchten nauwkeurig identificeren, wat de nodige informatie oplevert voor het selecteren van geschikte stuifbomen. Dit is een tijdbesparende, eenvoudige en betrouwbare techniek om de juiste ouderbomen in veredelingsprogramma's te selecteren. Deze techniek is eenvoudig en gemakkelijk te doen en het doen van experimenten voor de eerste keer vereist geduld en zorg.De S-genotype-identificatie en S-specifieke primerontwerpen hebben meer aandacht en zorg nodig. Yu Hu, een masterstudent uit mijn laboratorium, demonstreert de procedure. Begin met het verzamelen van stuifmeel door de Majia pomelo, Citrus maxima, bloemen naar het laboratorium te brengen.Verzamel de helmknoppen met een pincet en plaats ze in een petrischaaltje met filterpapier. Droog de stuifmeelkorrels door de petrischalen met de helmknoppen 24 uur in een oven van 28 graden Celsius te plaatsen. Bewaar het stuifmeel na het drogen in een Micro Centron luchtdichte ziplock-zak met kleurveranderende silicagel.Sluit de zak en label de zak met de naam van de stuifmeelsoort en de datum van opslag. Giet 300 microliter van het vloeibare medium in de dop van een centrifugebuis van twee milliliter en strooi het stuifmeel gelijkmatig met behulp van een bestuivingsborstel. Doe het stuifmeel in een bevochtigde zwarte doos en incubeer gedurende 12 uur bij 28 graden Celsius.Snijd na incubatie de bovenste punt van een millimeter van een pipetpunt van 1.000 microliter en zuig het stuifmeel op met een kleine hoeveelheid kweekoplossing. Plaats het stuifmeel in het midden van de microscoopglaasje en bedek het met een afdekslip. Als u klaar bent, observeert u het monster met een omgekeerde microscoop met behulp van een 10X-objectief.Voer drie onafhankelijke replicaties uit met ongeveer dezelfde pollendichtheid voor elke replicatie. Gebruik voor bestuiving een bestuivingsborstel om een voldoende hoeveelheid levensvatbaar stuifmeel op het oppervlak van het stigma te verspreiden, zodat de stamper niet wordt beschadigd. Bedek de bestoven bloemen met een papieren sulfaatzak en voorkom bestuiving door genotypisch verschillende pollen door de zak af te sluiten met een paperclip.Schrijf de naam van de soort en het aantal en het tijdstip van bestuiving op het etiket. Hang het etiket op de takken bij de bestoven bloemen. Verwijder de bestuivingszakken ongeveer drie tot vier dagen na de bestuiving en verzamel de bestoven bloemen in ritssluitingszakken.Verwijder onmiddellijk de bloemblaadjes, recipiënten en eierstokken van de bloemen en dompel het stigma dat is samengesmolten in een centrifugebuis met een vers bereide fixatieve oplossing. Incubeer het stigma en de stijl in de fixatieve oplossing 's nachts bij vier graden Celsius. Gooi de volgende dag de fixatieve oplossing weg voordat je het stigma wast en stijl twee tot drie keer in 95% ethanol.Voeg vervolgens 70% ethanoloplossing toe aan de stijl, zodat het monster volledig in de oplossing is ondergedompeld. De stijlen in dit stadium kunnen één tot twee maanden bij vier graden Celsius worden bewaard. Voor anilineblauwe kleuring wast u de stijlmonsters die zijn opgeslagen in 70% ethanol drie tot vier keer met gedestilleerd water.Dompel het onder in een natriumhydroxideoplossing met vier molken en sluit het af voordat u het gedurende 60 minuten in een waterbad van 65 graden Celsius incubeert. Tijdens deze stap verandert de kleur van de stijl van geel-wit naar oranje-rood. Week vervolgens de stijlen in gedestilleerd water.Gooi na 30 minuten het gedestilleerde water weg en was de stijlen drie tot vier keer met gedestilleerd water of totdat de kleur van de stijl geel wordt. Voeg vervolgens het anilineblauw toe totdat het monster is ondergedompeld en incuber gedurende 12 uur in het donker. Observeer de groei van de stuifmeelbuis onder de fluorescentiemicroscoop.Plaats de dia op een vlakke tafel. Verdeel de stijl in twee helften langs de lengteas met behulp van een scalpel. Plaats de ene helft van de stijl op een glazen dia en voeg twee tot drie druppels polyethyleenglycol toe aan het oppervlak van de dia.Bedek het vervolgens met een afdekbrief. Als u klaar bent, plaatst u de dia op het microscooppodium boven het diafragma en visualiseert u met behulp van een 10X-objectief. Gebruik het DAPI-filter en observeer de groei van de pollenbuis.Observeer vijf stijlen voor elk type bestuiving. De levensvatbaarheid van citrusmaxima en kiemsnelheden werden gekwantificeerd met behulp van fluorescerende microscopie. Het compatibele stuifmeel ontkiemde met succes op het oppervlak van het stigma en produceerde een normale stuifmeelbuis, die groeide en uiteindelijk leidde tot bevruchting in de eierstok.Incompatibele stuifmeelbuizen daarentegen groeiden door ongeveer 2/3 van de stijl en stopten vervolgens met groeien. Agarose-gel-elektroforese detecteerde het DNA-product versterkt met behulp van de S-locus-specifieke primers. Het toonde de amplificatie van het DNA-product tussen 500 en 1.000 basenparen.Het overeenkomstige S-genotype werd geïdentificeerd. 21 S-haplotypen in verschillende citrussoorten werden geïdentificeerd met behulp van deze methode. De bestuivingsstap is van cruciaal belang.Alleen de succesvolle bestuiving kan zorgen voor de daaropvolgende observatie van stuifmeelbuizen. De techniek werd gebruikt om de zelfincompatibiliteitskenmerken te analyseren en om de vrouwelijke determinanten van de zelfincompatibiliteit te onderzoeken en te identificeren. Deze methode is belangrijk voor zelfincompatibiliteitsonderzoek en fokprogramma's.Het kan ook de boerengemeenschap vergemakkelijken bij het selecteren van stuifmeelbomen voor hun boomgaarden.

determination-self-compatibility-inter-compatibility-relationships

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We hebben een methode voor het uitvoeren van kruisen in Setaria viridis (S. viridis) ontwikkeld. Bij deze methode wordt het snoeien van de pluim voorafgaand aan een warm water behandeling om levensvatbare pollen doden. Kruisen worden uitgevoerd na een goed gecontroleerde groei regime en meestal tot gevolg dat het herstel van 1-7 kruisbestuiving zaad / s per pluim.

Methoden voor het uitvoeren van Kruisen in<em&gt; Setaria viridis</em&gt;, Een Nieuw Model Systeem voor de Grassen

Bestuiver de effectiviteit van een bepaalde plantensoort openbaren, zijn meerdere methoden veldexperimenten ontwikkeld. Deze studie toont de fundamentele methoden van veldexperimenten voor bestuiving ecologie gebruik van de case study van Lycoris sanguinea var. Sanguinea en de roman bestuiving mechanisme, het breken-knop bestuiving.

Veldexperimenten van Bestuiving Ecologie: De zaak van<em&gt; Lycoris sanguinea</em&gt; Var.<em&gt; sanguinea</em

In dit protocol, worden methoden voor het uitvoeren van inteelt kruisen, en voor de beoordeling van het succes van deze kruisen, beschreven voor de mier Vollenhovia emeryi. Deze protocollen zijn belangrijk voor experimenten gericht op het begrijpen van de genetische basis van geslacht bepaling systemen in de Hymenoptera (Vliesvleugeligen).

Inductie en evaluatie van inteelt kruisen met behulp van de mier, Vollenhovia Emeryi

Hier presenteren we een protocol om te dwingen bloei in mandarin bomen onder Fytotron omstandigheden. Water stress, hoge verlichtingssterkte en een gesimuleerde voorjaar fotoperiode toegestaan levensvatbare bloemen kunnen worden verkregen in een korte periode van tijd. Deze methodologie kan onderzoekers hebben meerdere bloei-perioden in 1 jaar.

Gedwongen bloei in Mandarin bomen onder Fytotron voorwaarden

We demonstreren een methode om de succesvolle of mislukte bevruchting te bepalen op basis van de sperma nucleaire morfologie in Arabidopsis dubbele bevruchting met behulp van een epifluorescentie Microscoop.

Evaluatie van de bemesting staat door het traceren van de sperma nucleaire morfologie in Arabidopsis dubbele bevruchting

We presenteren een methodologie om de bestuivingsvereisten van abrikoos(Prunus armeniëca L.) cultivars vast te stellen die de bepaling van zelf-(in)compatibiliteit door fluorescentiemicroscopie combineren met de identificatie van het S-genotype door PCR-analyse.

Bepaling van zelf- en inter-(in)compatibiliteitsrelaties in abrikoos die handbestuiving, microscopie en genetische analyses combineren

Een methodologie voor de bepaling van bestuivingsvereisten in Japanse pruimentype hybriden wordt beschreven, die veld- en laboratoriumbestuivingen en waarnemingen van pollenbuizen onder de fluorescentiemicroscopie combineert met de identificatie van S-genotypen door PCR en de monitoring van de bloei voor de selectie van bestuiver.

Het vaststellen van bestuivingsvereisten in Japanse pruim door fenologische monitoring, handbestuivingen, fluorescentiemicroscopie en moleculaire genotypering

In dit werk wordt een robuuste methode beschreven voor de kwantificering van de paringsefficiëntie in de gist Saccharomyces cerevisiae . Deze methode is met name nuttig voor de kwantificering van pre-zygote barrières in soortvormingsstudies.

Bepaling van de paringsefficiëntie van haploïden in Saccharomyces cerevisiae

Een verbeterde methode om pollenhydratatieprofielen in Arabidopsis thaliana te meten wordt hier beschreven. De nieuwe methode biedt een hogere resolutie, is niet-invasief en is zeer reproduceerbaar. Het protocol vertegenwoordigt een nieuw hulpmiddel voor een fijnere ontleding van de processen die de vroege stadia van bestuiving reguleren.

Een hoge resolutie, enkelkorrelig, in vivo pollenhydratatiebioassay voor Arabidopsis thaliana

Hierin wordt beschreven de procedure geïmplementeerd in de Caffrey Membrane Structurele en Functionele Biologie Groep handmatig in te stellen tot kristallisatie onderzoeken van membraaneiwitten in lipide mesofasen.

Kristalliseren membraaneiwitten voor structuurbepaling met behulp van lipide mesofasen

Leer hoe u zelf-(in)compatibiliteit in Citrus maxima bepaalt met handmatige bestuiving, microscopie en S-genotype-analyse. Deze methode helpt fokkers bij het selecteren van geschikte bestuiversbomen.

Bepaling van zelf-(in)compatibiliteit en inter-(in)compatibiliteitsrelaties in citrusvruchten met behulp van handmatige bestuiving, microscopie en S-genotype-analyses (Video) | JoVE Journal

Bepaling van zelf-(in)compatibiliteit en inter-(in)compatibiliteitsrelaties in citrusvruchten met behulp van handmatige bestuiving, microscopie en S-genotype-analyses

Meer video's verkennen