Name: Concentratie van virusdeeltjes uit milieuwater- en afvalwatermonsters met behulp van magere melkflocculatie en ultrafiltratie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Leer het concentreren van virussen uit milieuwater en afvalwater met behulp van magere melkflocculatie. Deze kosteneffectieve methode biedt een eenvoudig alternatief voor ultrafiltratie en ondersteunt efficiënt virale monitoring.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NSERC Alliance Covid-19 Grant (Award No. 431401363, 2020-2021, Drs. Yuan en Uyaguari-Díaz). MUD wil graag het University Research Grants Program (Award No. 325201) bedanken. Zowel JF als JZA worden ondersteund door het Visual and Automated Disease Analytics (VADA) graduate trainingsprogramma. KY en JF ontvingen beide beurzen van het Mitacs Accelerate-programma. MUD en zijn laboratoriumleden (KY, JF, JZA) worden ondersteund door NSERC-DG (RGPIN-2022-04508) en de Research Manitoba New Investigator Operating grant (nr. 5385). Speciale dank aan de stad Winnipeg, Manitoba. Dit onderzoek werd uitgevoerd aan de Universiteit van Manitoba. We willen graag erkennen dat de campussen van de Universiteit van Manitoba zich bevinden op de oorspronkelijke landen van Anishinaabeg, Cree, Oji-Cree, Dakota en Dene-volkeren en op het thuisland van de Métis Nation.

1. Vergelijking van seriële ultrafiltratie en mageremelkflocculatie om virussen in afvalwatermonsters te concentreren
<ol><li>Monstervoorbereiding<ol><li>Verzamel 2 L van 24 h flow-proportionele samengestelde ruwe (influent) afvalwatermonsters. In de zomer en herfst van 2020 werden monsters verzameld van de drie grote afvalwaterzuiveringsinstallaties (RWZI's) in Winnipeg, Canada (tabel 1).</li>
		<li>Transporteer de monsters naar het laboratorium in lichtdichte flessen in een ijskast en verwerk ze binnen 24 uur. Verzamel gegevens over fysisch-chemische en biologische kenmerken van afvalwater.</li>
	</ol></li>
	<li>Virusconcentratietests OPMERKING: Een sequentiële ultrafiltratiemethode en een organische flocculatiemethode, namelijk mageremelkflocculatie (SMF), werden toegepast om de totale herstelefficiëntie van elke methode te beoordelen met behulp van gepantserd RNA als testvirus23. Andere onderzoekers hebben ook gepantserd RNA gebruikt als een controlevirus voor het beoordelen van het herstel van concentratiemethoden voor omhulde virussen, zoals de familie Coronaviridae22,24,25,26.<ol><li>Voor de toevoeging van gepantserd RNA stelt u de afvalwatertestvolumes voor de ultrafiltratie- en SMF-methoden in op respectievelijk 140 ml en 500 ml. Met behulp van een pipettor, spike 5 x 104 kopieën van gepantserd RNA in zes verse afvalwatermonsters verzameld op een datum en zes verse afvalwatermonsters op een andere datum, voor elke ultrafiltratiemethode; verder worden spike zes opgeslagen (bij 4 °C) afvalwatermonsters verzameld op een derde, latere datum en dagen later verwerkt voor SMF. OPMERKING: Elk van de zes monstersets die op verschillende data werden verzameld, bestond uit twee monsters van elk van de drie RWZI's. In onze studie werden de eerste reeks zoete afvalwatermonsters verzameld op 8 juli 2020, de tweede op 30 september 2020 en de afvalwatermonsters worden opgeslagen voor SMF op 14 oktober 2020.</li>
		<li>Roer gedurende 30 minuten bij 4 °C om het gepantserde RNA in de monsters te enten en te homogeniseren met behulp van een magnetische roerder.</li>
		<li>Verwijder alle deeltjes of cellen groter dan 0,2 μm en voer ultrafiltratie uit.<ol><li>Filter de puntige afvalwatermonsters (120 ml van elk 140 ml spiked monster) door kaasdoek en eiwitarme binding, respectievelijk 0,45 μm en 0,2 μm, 47 mm membraanschijffilters, om grote deeltjes, sedimenten, eukaryoten en bacteriën te verwijderen27. Verwerk de gefilterde monsters met behulp van de hieronder beschreven ultrafiltratiemethoden. OPMERKING: De afvalwatermonsters verzameld op 8 juli en 30september werden gebruikt voor ultrafiltratiemethoden met respectievelijk 3.000 x g en 7.500 x g.</li>
			<li>Concentreer voor sequentiële ultrafiltratie bij 3.000 x g (UF-3k x g) in totaal 120 ml van het testmonster dat op de eerste datum is verzameld op 3.000 x g gedurende 30 minuten door 60 ml van het monster tweemaal tot ongeveer 5 ml te laden met behulp van een centrifugaalapparaat van het merk A, 30 kDa. Concentreer vervolgens het volume van 5 ml gedurende 30 minuten op 3.000 x g met behulp van een merk B-centrifugaalapparaat, 30 kDa, tot 500-1.200 μl.</li>
			<li>Voor sequentiële ultrafiltratie bij 7.500 x g (UF-7,5k x g), wijzigt u de centrifugatiesnelheid voor het centrifugaalapparaat van merk B van 3.000 x g naar 7.500 x g om kleinere eindvolumes te verkrijgen, volgens de aanbevelingen van de fabrikant, en houdt u de centrifugatiesnelheid van het merk A-centrifugaalapparaat hetzelfde. OPMERKING: De tests werden uitgevoerd met de monsters verzameld op 30september.</li>
		</ol></li>
		<li>Voer voor SMF de onderstaande stappen uit.</li>
		<li>Spike de afvalwatermonsters (elk 500 ml) om zich direct te concentreren met behulp van het SMF-protocol16,18, zonder voorfiltratie met kaasdoek en eiwitarme membraanschijffilters, zoals hieronder beschreven.</li>
		<li>Los 0,5 g mageremelkpoeder op in 50 ml synthetisch zeewater om een 1% (m/v) mageremelkoplossing te verkrijgen en stel de pH van de oplossing voorzichtig in op 3,5 met behulp van 1 N HCl. OPMERKING: Verzuring zorgt ervoor dat virussen aggregeren en neerslaan uit water als gevolg van de verandering in hun iso-elektrische punt16 en verbetert de oplosbaarheid van melkpoeder28.</li>
		<li>Voeg 5 ml mageremelkoplossing toe aan 500 ml ruwe afvalwatermonsters om een uiteindelijke concentratie magere melk van 0,01% (m/v) te verkrijgen.</li>
		<li>Roer de monsters gedurende 8 uur op gemiddelde snelheid en laat de gevormde vlokken nog eens 8 uur bezinken bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Verwijder de supernatanten voorzichtig met serologische pipetten zonder de bezonken vlokken te verstoren. Breng een eindvolume van 50 ml met de vlokken over in centrifugebuizen en centrifugeer gedurende 30 minuten bij 8.000 x g bij 8 °C.</li>
		<li>Schraap de pellets voorzichtig met een gesteriliseerde spatel en resuspensie de resterende pellets in de buizen in 250 μL van 0,2 M natriumfosfaatbuffer (pH 7,5) nadat het supernatant is verwijderd. Breng de geschraapte en geresuspendeerde pellets over naar dezelfde 1,5 ml minicentrifugebuizen.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer virale RNA-extractie uit virale concentraten van afvalwatermonsters en herstelefficiëntietests uit met behulp van een RNA-extractiekit met een 25: 24: 1-verhouding van fenol: chloroform: isoamylalcohol en β-mercaptoethanol, volgens de instructies van de fabrikant, om de extractie-efficiëntie te verbeteren. Elueer ten slotte het RNA in 50 μL elutiebuffer.</li>
	<li>Real-time-kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR) analyse<ol><li>Kwantificeer gepantserd RNA met behulp van tienvoudige verdunningen (7,8 x 10,4 tot 7,8 genkopieën) van een synthetisch enkelstrengs DNA of gBlock-construct. Zie tabel 2 voor de primers en probe sets die het gepantserde RNA detecteren en kwantificeren.</li>
		<li>Ontwerp primer- en probe-sets met behulp van de primer-ontwerptool29 en richt je op een 95 bp-gebied (gBlock-construct) binnen het gepantserde RNA-genoom.</li>
		<li>Verkrijg kalibratiecurven voor elke RT-qPCR-run. Neem negatieve besturingselementen op in elke qPCR-run. Voer standaarden, voorbeelden en niet-sjabloonbesturingselementen in drievoud uit.</li>
		<li>Bereid elk 10 μL RT-qPCR-mengsel in de volgende volgorde: 2,5 μL 4x mastermix, 400 nM van elke primer, 200 nM-sonde en 2,5 μL sjabloon, evenals ultrapuur DNAse / RNAse-vrij gedestilleerd water.</li>
		<li>Voer thermische cyclusreacties uit bij 50 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door 45 cycli van 95 °C gedurende 10 s en 60 °C gedurende 30 s op een real-time PCR-systeem. Als de CT <40 was, overweeg dan het monster gepantserd RNA-positief.</li>
		<li>Voer qPCR- en RT-qPCR-tests uit met runderserumalbumine met ruwe rioolwatermonsters om de mogelijkheid van remmers of verontreinigingen zoals humuszuren te beoordelen24. Er werden geen significante verschillen waargenomen tussen monsters met en zonder het enzym.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereken de concentraties uit de standaardcurve. Bereken het efficiëntiepercentage van de terugwinning door de teruggewonnen concentratie te delen door de piekconcentratie.</li>
	<li>Transformeer genkopienummers met behulp van de log10-functie voor analyse. Voer een algemeen lineair model uit met behulp van een statistische analysetool op de qPCR-gegevens. Pas de test van Tukey toe om verschillen tussen de methoden en behandelingen te detecteren. Neem een p-waarde van 0,05 als minimaal significantieniveau voor de test.</li>
</ol>2. Filtratie en concentratie van DNA- en RNA-virussen voor epidemiologie op waterbasis
<ol><li>Voor het verzamelen van oppervlaktewater in het milieu, verzamelt u 10 L oppervlaktewatermonsters en gebruikt u 10 L gedeïoniseerde watermonsters voor achtergrondcontrole. Bewaar alle monsters in een ruimte van 4 °C totdat ze binnen 24 uur na de monsterneming zijn verwerkt.</li>
	<li>Voer de concentratie van virussen uit omgevingsmonsters uit met SMF met behulp van de onderstaande stappen.<ol><li>Voer capsule- en vacuümfiltratie uit met behulp van grondwaterbemonsteringscapsules met hoge capaciteit en membraanschijffilters van 0,45 μm, 0,2 μm en 0,1 μm om ruis tijdens metagenomische sequencing te minimaliseren, van grotere fracties zoals micro-eukaryoten en bacteriën tot kleinere zoals virussen.</li>
		<li>Bereid een voorgevlokte mageremelkoplossing van 1% gewicht per volume in 1,32 l synthetisch zeewater met 13,2 g mageremelkpoeder. Stel de pH van deze suspensie in op 3,5 met behulp van 1 N HCl.</li>
	</ol></li>
	<li>Stel de pH van de omgevingsoppervlaktewatermonsters in op 3,5 met behulp van 1 N HCl.</li>
	<li>Breng 100 ml van de voorgevlokte aangezuurde mageremelkoplossing over in 10 L aangezuurde (pH 3,5) milieuwatermonsters (uiteindelijke mageremelkconcentratie van 0,01% [g/v]).</li>
	<li>Roer met behulp van een magneetroerder en een magneetroerstaaf de monsters gedurende 8 uur bij kamertemperatuur en laat de vlokken door de zwaartekracht nog eens 8 uur bezinken. Zonder de vlokken te storen, verwijdert u het supernatant voorzichtig met behulp van een vacuümpomp.</li>
	<li>Aliquoteer en balanceer de resterende vlokken volgens het gewicht in centrifugebuizen van 50 ml en draai ze gedurende 30 minuten bij 4 °C naar beneden bij 8.000 x g .</li>
	<li>Gooi het supernatant weg en los de resulterende pellet (die theoretisch interessante virussen bevat) op in 200 μL natriumfosfaatbuffer.</li>
	<li>Behandel de opgeloste pellet met DNase I en RNase A, volgens de instructies van de fabrikant, om vrij DNA en RNA te verwijderen dat samen kan worden neergeslagen als gevolg van de kit die wordt gebruikt voor nucleïnezuurextractie. Deactiveer de DNase I en RNase A volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Extraheer totale nucleïnezuren uit de opgeloste pellet met behulp van een DNA / RNA-extractiekit, volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Kwantificeer de totale hoeveelheid geëxtraheerd DNA en RNA uit effluentmonsters met behulp van een fluorometer. Monsters met concentraties >1 ng/μL worden als optimaal beschouwd voor DNA-kwantificering en -sequencing.</li>
	<li>Voer qPCR-analyse uit om enterische virussen van belang te targeten en high-throughput sequencing om de virale gemeenschapsstructuur te identificeren.</li>
</ol>3. Directe precipitatie en concentratie van microbiële fracties voor epidemiologie op waterbasis
<ol><li>Verzamel 2 L watermonsters van beschermde en getroffen waterwegen. Als het monster een aanzienlijke hoeveelheid vuil bevat, gebruik dan een kaasdoek om ze te verwijderen. OPMERKING: Het verzamelen van een biologisch duplicaat per monster wordt ten zeerste aanbevolen.</li>
	<li>Bereid een 1% (m/v) magere melkoplossing door 4,4 g mageremelkpoeder op te lossen in 440 ml synthetisch zeewater. Stel de pH van deze suspensie in op 3,5 met 1 N HCl.</li>
	<li>Stel de pH van de zoetwatermonsters in op 3,5 met behulp van 1 N HCl.</li>
	<li>Voeg 20 ml mageremelkoplossing toe aan de eerder voor de pH gecorrigeerde zoetwatermonsters van 2 l (uiteindelijke mageremelkconcentratie van 0,01% [g/v]). Roer de monsters gedurende 8 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Laat de vlokken nog 8 uur door de zwaartekracht bezinken. Verwijder de supernatanten voorzichtig met een peristaltische pomp. Breng de gesedimenteerde vlokken over in een centrifugebuis van 50 ml en draai ze gedurende 30 minuten op 8.000 x g naar beneden.</li>
	<li>Gooi het supernatant weg en resuspensie van de pellets met 200 μL natriumfosfaatbuffer van 0,2 M. Bewaar de monsters bij -20 °C of selecteer ~ 0,5 g van de vlok voor microbiële DNA-extractie met behulp van de nucleïnezuurisolatiekit naar keuze, volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Bepaal de DNA-nucleïnezuurconcentratie en -zuiverheid met een hooggevoelige fluorometer. Monsters met concentraties >1 ng/μL moeten optimaal zijn voor DNA-kwantificering en -sequencing.</li>
</ol>

<ol><li>Kumblathan, T., Liu, Y., Uppal, G. K., Hrudey, S. E., Lix, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wastewater-based+epidemiology+for+community+monitoring+of+SARS-CoV-2%3A+progress+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Environmental+Au%22%5BJournal%5D)">Wastewater-based epidemiology for community monitoring of SARS-CoV-2: progress and challenges.</a> ACS Environmental Au. 1, 18-31 (2021).</li>
<li>Lu, D., Huang, Z., Luo, J., Zhang, X., Sha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+concentration-The+critical+step+in+implementing+the+wastewater+based+epidemiology+for+the+COVID-19+pandemic%3A+A+mini-review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+The+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Primary concentration-The critical step in implementing the wastewater based epidemiology for the COVID-19 pandemic: A mini-review.</a> The Science of The Total Environment. 747, 141245(2020).</li>
<li>Bi, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+household+transmission+of+SARS-CoV-2+from+a+population-based+serological+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Insights into household transmission of SARS-CoV-2 from a population-based serological survey.</a> Nature Communications. 12, 3643(2021).</li>
<li>Day, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covid-19%3A+identifying+and+isolating+asymptomatic+people+helped+eliminate+virus+in+Italian+village%5BTitle%5D)+AND+%22British+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Covid-19: identifying and isolating asymptomatic people helped eliminate virus in Italian village.</a> British Medical Journal. 368, 1165(2020).</li>
<li>Ing, A. J., Cocks, C., Green, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COVID-19%3A+in+the+footsteps+of+Ernest+Shackleton%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">COVID-19: in the footsteps of Ernest Shackleton.</a> Thorax. 75 (8), 693-694 (2020).</li>
<li>Bivins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wastewater-based+epidemiology%3A+global+collaborative+to+maximize+contributions+in+the+fight+against+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Wastewater-based epidemiology: global collaborative to maximize contributions in the fight against COVID-19.</a> Environmental Science & Technology. 54 (13), 7754-7757 (2020).</li>
<li>Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+SARS-Coronavirus-2+RNA+in+sewage+and+correlation+with+reported+COVID-19+prevalence+in+the+early+stage+of+the+epidemic+in+the+Netherlands%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology+Letters%22%5BJournal%5D)">Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands.</a> Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).</li>
<li>Thompson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+waves%3A+Wastewater+surveillance+of+SARS-CoV-2+for+population-based+health+management%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Making waves: Wastewater surveillance of SARS-CoV-2 for population-based health management.</a> Water Research. 184, 116181(2020).</li>
<li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+RNA+concentrations+in+wastewater+foreshadow+dynamics+and+clinical+presentation+of+new+COVID-19+cases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 RNA concentrations in wastewater foreshadow dynamics and clinical presentation of new COVID-19 cases.</a> The Science of the Total Environment. 805, 150121(2022).</li>
<li>Kantor, R. S., Nelson, K. L., Greenwald, H. D., Kennedy, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+measuring+the+recovery+of+SARS-CoV-2+from+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Challenges in measuring the recovery of SARS-CoV-2 from wastewater.</a> Environmental Science & Technology. 55 (6), 3514-3519 (2021).</li>
<li>Chik, A. H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+approaches+to+quantify+SARS-CoV-2+in+wastewater+using+RT-qPCR%3A+Results+and+implications+from+a+collaborative+inter-laboratory+study+in+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Environmental+Sciences%22%5BJournal%5D)">Comparison of approaches to quantify SARS-CoV-2 in wastewater using RT-qPCR: Results and implications from a collaborative inter-laboratory study in Canada.</a> Journal of Environmental Sciences. 107, 218-229 (2021).</li>
<li>Hjelmsø, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+methods+for+the+concentration+and+extraction+of+viruses+from+sewage+in+the+context+of+metagenomic+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of methods for the concentration and extraction of viruses from sewage in the context of metagenomic sequencing.</a> PLoS One. 12 (1), e0170199(2017).</li>
<li>Philo, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+SARS-CoV-2+wastewater+concentration+methods+for+environmental+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">A comparison of SARS-CoV-2 wastewater concentration methods for environmental surveillance.</a> The Science of the Total Environment. 760, 144215(2021).</li>
<li>Ahmed, W., Harwood, V. J., Gyawali, P., Sidhu, J. P. S., Toze, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+concentration+methods+for+quantitative+detection+of+sewage-associated+viral+markers+in+environmental+waters%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of concentration methods for quantitative detection of sewage-associated viral markers in environmental waters.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (6), 2042-2049 (2015).</li>
<li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+classic+and+emerging+viruses+by+skimmed-milk+flocculation+and+PCR+in+river+water+from+two+geographical+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas.</a> Water Research. 47 (8), 2797-2810 (2013).</li>
<li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).</li>
<li>Cashdollar, J. L., Wymer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+primary+concentration+of+viruses+from+water+samples%3A+a+review+and+meta-analysis+of+recent+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies.</a> Journal of Applied Microbiology. 115 (1), 1-11 (2013).</li>
<li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+methods+for+the+concentration+of+viruses+from+urban+sewage+using+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">New methods for the concentration of viruses from urban sewage using quantitative PCR.</a> Journal of Virological Methods. 187 (2), 215-221 (2013).</li>
<li>Gonzales-Gustavson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+efficiency+and+uncertainty+of+skimmed+milk+flocculation+for+the+simultaneous+concentration+and+quantification+of+water-borne+viruses%2C+bacteria+and+protozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa.</a> Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).</li>
<li>Assis, A. S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+skimmed-milk+flocculation+method+for+recovery+of+adenovirus+from+sludge%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Optimization of the skimmed-milk flocculation method for recovery of adenovirus from sludge.</a> The Science of the Total Environment. 583, 163-168 (2017).</li>
<li>Goncharova, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+quantitative+RT-PCR+assay+with+armored+RNA+controls+for+detection+of+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">One-step quantitative RT-PCR assay with armored RNA controls for detection of SARS-CoV-2.</a> Journal of Medical Virology. 93 (3), 1694-1701 (2021).</li>
<li>Yu, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+armored+RNA+as+a+control+for+multiplex+real-time+reverse+transcription-PCR+detection+of+influenza+virus+and+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Preparation of armored RNA as a control for multiplex real-time reverse transcription-PCR detection of influenza virus and severe acute respiratory syndrome coronavirus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 46 (3), 837-841 (2008).</li>
<li>Alygizakis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methodologies+for+the+detection+of+SARS-CoV-2+in+wastewater%3A+Protocols+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analytical methodologies for the detection of SARS-CoV-2 in wastewater: Protocols and future perspectives.</a> Trends in Analytical Chemistry. 134, 116125(2021).</li>
<li>Garcia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+human+enteric+viruses+as+alternative+indicators+of+fecal+pollution+to+evaluate+wastewater+treatment+processes%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Quantification of human enteric viruses as alternative indicators of fecal pollution to evaluate wastewater treatment processes.</a> PeerJ. 10, e12957(2022).</li>
<li>Gonzalez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COVID-19+surveillance+in+Southeastern+Virginia+using+wastewater-based+epidemiology%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">COVID-19 surveillance in Southeastern Virginia using wastewater-based epidemiology.</a> Water Research. 186, 116296(2020).</li>
<li>Hietala, S. K., Crossley, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Armored+RNA+as+virus+surrogate+in+a+real-time+reverse+transcriptase+PCR+assay+proficiency+panel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Armored RNA as virus surrogate in a real-time reverse transcriptase PCR assay proficiency panel.</a> Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 67-70 (2006).</li>
<li>Uyaguari-Diaz, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+method+for+amplicon-based+and+metagenomic+characterization+of+viruses%2C+bacteria%2C+and+eukaryotes+in+freshwater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">A comprehensive method for amplicon-based and metagenomic characterization of viruses, bacteria, and eukaryotes in freshwater samples.</a> Microbiome. 4 (1), 20(2016).</li>
<li>Meena, G. S., Singh, A. K., Gupta, V. K., Borad, S., Parmar, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+change+in+pH+of+skim+milk+and+ultrafiltered%2Fdiafiltered+retentates+on+milk+protein+concentrate+%28MPC70%29+powder+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Effect of change in pH of skim milk and ultrafiltered/diafiltered retentates on milk protein concentrate (MPC70) powder properties.</a> Journal of Food Science and Technology. 55 (9), Geneious. https://www.geneious.com. 3526-3537 (2018).</li>
<li>Geneious. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.geneious.com">https://www.geneious.com</a> (2021).</li>
<li>Ye, Y., Ellenberg, R. M., Graham, K. E., Wigginton, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survivability%2C+partitioning%2C+and+recovery+of+enveloped+viruses+in+untreated+municipal+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Survivability, partitioning, and recovery of enveloped viruses in untreated municipal wastewater.</a> Environmental Science & Technology. 50 (10), 5077-5085 (2016).</li>
<li>Philo, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+the+skimmed+milk+pellet+extraction+protocol+for+SARS-CoV-2+wastewater+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Environmental+Virology%22%5BJournal%5D)">Development and validation of the skimmed milk pellet extraction protocol for SARS-CoV-2 wastewater surveillance.</a> Food and Environmental Virology. 14 (4), 355-363 (2022).</li>
<li>Monteiro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+SARS-CoV-2+from+large+volumes+of+raw+wastewater+is+enhanced+with+the+inuvai+R180+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journalof+Environmental+Management%22%5BJournal%5D)">Recovery of SARS-CoV-2 from large volumes of raw wastewater is enhanced with the inuvai R180 system.</a> Journalof Environmental Management. 304, 114296(2022).</li>
<li>Yanaç, K., Adegoke, A., Wang, L., Uyaguari, M., Yuan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+SARS-CoV-2+RNA+throughout+wastewater+treatment+plants+and+a+modeling+approach+to+understand+COVID-19+infection+dynamics+in+Winnipeg%2C+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+The+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Detection of SARS-CoV-2 RNA throughout wastewater treatment plants and a modeling approach to understand COVID-19 infection dynamics in Winnipeg, Canada.</a> The Science of The Total Environment. 825, 153906(2022).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen bekende concurrerende financiële belangen of persoonlijke relaties hebben die van invloed lijken te zijn geweest op het werk dat in dit artikel wordt gerapporteerd.

Een van de kritische stappen in deze studie is de eliminatie van vaste deeltjes door het toepassen van een voorfiltratiestap met membraanfilters van 0,2 μm en 0,45 μm. Gezien de verdeling van virussen in vaste deeltjes, met name omhulde virussen, kan voorfiltratie een aanzienlijk verlies in viraal herstel veroorzaken30. Hoewel een voorfiltratiestap voor ultrafiltratiemethoden bijna altijd nodig is voor milieu- en afvalwatermonsters om te voorkomen dat ultrafiltratie-apparaten verstopt raken, kan v...

Het bepalen van de effectieve concentratie van micro-organismen in oppervlakte- en afvalwatermonsters voor microbiële gemeenschapsanalyse en epidemiologische studies, is een van de belangrijke stappen voor het monitoren en voorspellen van het verloop van uitbraken in gemeenschappen 1,2. De COVID-19-pandemie ontvouwde het belang van het verbeteren van concentratiemethoden. COVID-19 dook eind 2019 op en vormt vanaf maart 2023 nog steeds een bedreiging voor de menselijke gezondheid, het sociale leven en de economie. Effectieve surveillance- en controlestrategieën om de gevolgen van COVID-19-uitbraken in gemeenschappen te verlichten, zijn een belangrijk onderzoeksonderwerp geworden, aangezien nieuwe golven en varianten van COVID-19 zijn ontstaan naast de snelle overdracht en verspreiding van het virus, evenals niet-gemelde en niet-gediagnosticeerde asymptomatische gevallen 3,4,5. Het gebruik van op afvalwater gebaseerde epidemiologie voor COVID-19 door maatschappelijke organisaties, overheidsinstanties en openbare of particuliere nutsbedrijven is nuttig geweest bij het verstrekken van snelle uitbraakgerelateerde informatie en het beperken van de gevolgen van COVID-19-uitbraken 6,7,8,9. De concentratie van SARS-CoV-2, een omhuld RNA-virus, in afvalwatermonsters vormt echter nog steeds een uitdaging10. Een van deze uitdagingen is bijvoorbeeld de verdeling van SARS-CoV-2 in vaste stoffen in afvalwater, wat van invloed kan zijn op het herstel wanneer de vaste stoffen worden geëlimineerd tijdens concentratie11. Als dit het geval is, moet de kwantificering/beoordeling gericht zijn op zowel vaste als waterige fasen van milieuwatermonsters, in plaats van alleen op de waterige fase. Bovendien kan de keuze van de concentratiemethode worden gewijzigd op basis van downstreamtests en -analyses. De concentratie van virusdeeltjes en pathogenen uit omgevingsmonsters is een urgent onderzoeksonderwerp geworden met ontwikkelingen op het gebied van sequencing en microbioom.
Op het gebied van virusconcentratie uit omgevingswater- en afvalwatermonsters zijn verschillende virusconcentratiemethoden toegepast. Enkele veelgebruikte methoden zijn filtratie, magere melkflocculatie (SMF), adsorptie / elutie en polyethyleenglycolprecipitatie12-17. Onder hen is SMF beschouwd als een goedkope en effectieve methode, met succes getest en toegepast voor het herstellen van virussen, waaronder SARS-CoV-2, uit afvalwater en oppervlaktewateren12,15,16,18. De SMF-procedure is een relatief nieuwe benadering die in veel milieustudies steeds meer erkenning heeft gekregen als een geschikte methode om tegelijkertijd een breed scala aan micro-organismen zoals virussen, bacteriën en protozoën terug te winnen uit alle soorten watermonsters, namelijk slib, ruw afvalwater, afvalwater en effluentmonsters19. In vergelijking met andere bekende methoden om virussen te herstellen uit omgevingsmonsters zoals ultrafiltratie en glycine-alkalische elutie, op lyofilisatie gebaseerde benadering of ultracentrifugatie en glycine-alkalische elutie, is SMF gerapporteerd als de meest efficiënte methode met hogere virale herstel- en detectiepercentages18,20. In de huidige studie gebruikten we gepantserd RNA als testvirus om de herstelefficiëntie van virusconcentratiemethoden te beoordelen, inclusief tests voor het beoordelen van SARS-CoV-2-herstel21,22.
Hier hebben we afvalwater- en milieuwatermonsters getest om het nut van SMF aan te tonen en een sequentiële ultrafiltratiemethode om microbiële fracties te concentreren voor kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR), sequentiegebaseerde metagenomica en diepe ampliconsequencing. SMF is een relatief goedkopere methode en optimaal voor een groter volume monsters in vergelijking met ultrafiltratiemethoden. Het idee om een sequentiële ultrafiltratiemethode te gebruiken, kwam voort uit de noodzaak om het uiteindelijke volume van de virale concentraten te verminderen tijdens de COVID-19-pandemie, toen het aanbod van de veelgebruikte ultrafiltratie-apparaten beperkt was en er behoefte was aan de ontwikkeling van alternatieve virale concentratiemethoden.

<table><tbody><tr><td>0.2 M sodiumfosfaat buffer met een pH van 7.5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62041AP</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA</td></tr><tr><td>0.2 &mu;m 47-mm Supor-200 membraan schijffilters</td><td>VWR</td><td>66234</td><td>Pall Corporation, Ann Arbor, MI</td></tr><tr><td>0.45 &mu;m 47-mm Supor-200 membraan schijffilters</td><td>VWR</td><td>60043</td><td>Pall Corporation, Ann Arbor, MI</td></tr><tr><td>4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4444432</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td></tr><tr><td>Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control</td><td>Asuragen</td><td>49650</td><td>Asuragen, Austin, TX, USA</td></tr><tr><td>Merk A, Jumbosep Centrifugaal Apparaat, 30-kDa</td><td>Pall&nbsp;</td><td>OD030C65</td><td>Pall Corporation, Ann Arbor, MI</td></tr><tr><td>Merk B, Microsep Advance Centrifugaal Apparaat, 30-kDa</td><td>Pall</td><td>MCP010C46</td><td>Pall Corporation, Ann Arbor, MI</td></tr><tr><td>Centrifuge buizen (50 ml)&nbsp;</td><td>Nalgene</td><td>3119-0050PK</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Invitrogen</td><td>18047019</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Dyna Mag-2</td><td>Invitrogen</td><td>12027</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>GWV Hoge Capaciteit Grondwater Bemonstering Capsules - 0.45 &micro;m</td><td>Pall</td><td>12179</td><td>Pall Corporation, Ann Arbor, MI</td></tr><tr><td>Zoutzuur, 1N standaardoplossing</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AC124210025</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA</td></tr><tr><td>MagMAX Microbioom Ultra Nucleïnezuur Isolatiekit</td><td>Applied biosystems</td><td>A42358</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Nuclease vrij water</td><td>Promega</td><td>P1197</td><td>Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA</td></tr><tr><td>Peristaltiek pomp</td><td>Masterflex, Cole-Parmer instrument</td><td>7553-20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>pH meter&nbsp;</td><td>Denver instrument</td><td>RK-59503-25</td><td>Cole-Parmer. Dit product is niet meer verkrijgbaar</td></tr><tr><td>Fenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1</td><td>Invitrogen</td><td>15593031</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA</td></tr><tr><td>Primers en probe sets</td><td>IDT</td><td></td><td>Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA</td></tr><tr><td>Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA</td></tr><tr><td>QuantStudio 5 Real-Time PCR Systeem</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A34322</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td></tr><tr><td>Qubit 1X dsDNA Hoge Gevoeligheid (HS) assay kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q33231</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Qubit 4 Fluorometer, met WiFi</td><td>Invitrogen</td><td>Q33238</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Qubit RNA Hoge Gevoeligheid (HS) assay kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32855</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>Invitrogen</td><td>EN0531</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>RNeasy PowerMicrobiome Kit</td><td>Qiagen</td><td>26000-50</td><td>Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA</td></tr><tr><td>Melkpoeder</td><td>Difco (BD Life Sciences)</td><td>DF0032173</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA</td></tr><tr><td>Natriumfosfaat buffer</td><td>Alfa Aesar</td><td></td><td>Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada</td></tr><tr><td>Synthetisch zeewater</td><td>VWR&nbsp;</td><td>RC8363-1</td><td>RICCA chemical company</td></tr><tr><td>Synthetisch enkelstrengs DNA gBlock</td><td>IDT</td><td></td><td>Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA</td></tr><tr><td>VacuCap 90 Vacuüm Filtratie Apparaten - 0.1 &micro;m, 90 mm, gamma-bestraald</td><td>Pall</td><td>4621</td><td>Pall Corporation, Ann Arbor, MI</td></tr><tr><td>VacuCap 90 Vacuüm Filtratie Apparaten - 0.2 &micro;m, 90 mm, gamma-bestraald</td><td>Pall</td><td>4622</td><td>Pall Corporation, Ann Arbor, MI</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA</td></tr></tbody></table>

concentratie van virusdeeltjes uit milieuwater- en afvalwatermonsters met behulp van magere melkflocculatie en ultrafiltratie

Concentration of Virus Particles from Environmental Water and Wastewater Samples Using Skimmed Milk Flocculation and Ultrafiltration

Op water en afvalwater gebaseerde epidemiologie zijn naar voren gekomen als alternatieve methoden om het verloop van uitbraken in gemeenschappen te volgen en te voorspellen. Het terugwinnen van microbiële fracties, waaronder virussen, bacteriën en microeukaryoten uit afvalwater en milieuwatermonsters is een van de uitdagende stappen in deze benaderingen. In deze studie hebben we ons gericht op de herstelefficiëntie van sequentiële ultrafiltratie en magere melk flocculatie (SMF) -methoden met behulp van gepantserd RNA als een testvirus, dat ook wordt gebruikt als een controle door sommige andere studies. Voorfiltratie met 0,45 μm en 0,2 μm membraanschijffilters werden toegepast om vaste deeltjes te elimineren vóór ultrafiltratie om de verstopping van ultrafiltratie-apparaten te voorkomen. Testmonsters, verwerkt met de sequentiële ultrafiltratiemethode, werden met twee verschillende snelheden gecentrifugeerd. Een verhoogde snelheid resulteerde in lagere herstel- en positiviteitspercentages van gepantserd RNA. Aan de andere kant resulteerde SMF in relatief consistente herstel- en positiviteitspercentages van gepantserd RNA. Aanvullende tests uitgevoerd met milieuwatermonsters toonden het nut aan van SMF om andere microbiële fracties te concentreren. De verdeling van virussen in vaste deeltjes kan van invloed zijn op de algehele terugwinningspercentages, gezien de voorfiltratiestap die wordt toegepast vóór de ultrafiltratie van afvalwatermonsters. SMF met voorfiltratie presteerde beter wanneer toegepast op milieuwatermonsters vanwege lagere vaste concentraties in de monsters en dus lagere verdelingssnelheden naar vaste stoffen. In de huidige studie ontstond het idee om een sequentiële ultrafiltratiemethode te gebruiken uit de noodzaak om het uiteindelijke volume van de virale concentraten te verminderen tijdens de COVID-19-pandemie, toen het aanbod van de veelgebruikte ultrafiltratie-apparaten beperkt was en er behoefte was aan de ontwikkeling van alternatieve virale concentratiemethoden.

Evaluatie van virale RNA-concentratiemethoden Alle zes monsters verwerkt met UF-3k x g waren positief en resulteerden in een herstel van 13,38% ± 8,14% (figuur 1). Slechts één monster was positief wanneer de monsters werden verwerkt met UF-7,5k x g. Alle met SMF verwerkte monsters waren positief en resulteerden in een herstel van 15,27% ± 2,65% (figuur 1). De gemiddelde herstelpercentages van UF-3K x g en SMF waren significa...

Virusconcentratie uit milieuwater- en afvalwatermonsters is een uitdagende taak, voornamelijk uitgevoerd voor de identificatie en kwantificering van virussen. Hoewel er verschillende virusconcentratiemethoden zijn ontwikkeld en getest, tonen we hier de effectiviteit aan van ultrafiltratie en magere melkvlokking voor RNA-virussen met verschillende monstertypen.

Concentratie van virusdeeltjes uit milieuwater- en afvalwatermonsters met behulp van magere melkflocculatie en ultrafiltratie

Water and wastewater-based epidemiology have emerged as alternative methods to monitor and predict the course of outbreaks in communities.&#160;The ...

Epidemiologie op basis van water en afvalwater is naar voren gekomen als een alternatieve methode om het verloop van uitbraken in gemeenschappen te volgen en te voorspellen. De mageremelkflocculatiemethode is een alternatieve benadering van concentratiemicroben. Magere melk flocculatiemethode vertegenwoordigt een veelzijdige, goedkope en gemakkelijke hands-off methode om microbiële fracties te concentreren zonder significante verschillen in vergelijking met ultrafiltratie of tangentiële stroomfiltratiebenaderingen.Deze aanpak wordt gebruikt voor metagenomics of gerichte PCR-studies. Zodra de microbiële fracties zijn geconcentreerd, kan nucleïnezuurextractie worden uitgevoerd met behulp van commerciële extractiekits of een intern protocol. De mageremelkflocculatiemethode is relatief eenvoudiger voor grote of kleine hoeveelheden water of afvalwatermonsters.Een achtergrondcontrole met Milli-Q-water moet als onderdeel van deze methode worden opgenomen. Kadir Yanac, Jhannelle Francis en Jocelyn Zambrano-Alvarado, afgestudeerde studenten van het laboratorium van Miguel Uyaguari, zullen de procedure demonstreren. Verzamel om te beginnen twee liter 24-uurs stroomproportionele samengestelde ruwe afvalwatermonsters.Transporteer de monsters naar het laboratorium in lichtdichte flessen in een ijskast en verwerk ze binnen 24 uur. Haal de gegevens over afvalwaterkenmerken op van het technisch personeel van de afvalwaterzuiveringsinstallatie. Piek voor elke ultrafiltratiemethode vijf keer 10 tot de vierde kopieën van gepantserd RNA in 140 milliliter van elk van de zes verse afvalwatermonsters die op één datum zijn verzameld en zes verse afvalwatermonsters op een andere datum.Homogeniseer het gepantserde RNA in het monster door gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius te roeren op een magnetische roerbeurt. Voor mageremelkflocculatie of SMF bereidt u 1% mageremelkoplossing door 0,5 gram mageremelkpoeder op te lossen in 50 milliliter synthetisch zeewater. Stel de pH van SMF in op 3,5 met één normaal zoutzuur.Voeg vijf milliliter magere melkoplossing toe aan 500 milliliter rauw afvalwatermonster. Roer het monster acht uur en laat de gevormde koppels nog acht uur bezinken bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant met behulp van een serologische pipet zonder de bezonken koppels te storen.Breng een eindvolume van 50 milliliter met de koppels over naar een centrifugebuis en centrifugeer gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius bij 8.000 G. Verwijder het supernatant en schraap de pellet voorzichtig met een gesteriliseerde spatel. Resuspensie van de resterende pellet in 250 microliter 0,2 molaire natriumfosfaatbuffer.Breng de geschraapte en geresuspendeerde pellets over naar dezelfde 1,5 milliliter minicentrifugebuis. Voer virale RNA-extractie uit virale concentraten van afvalwatermonsters en herstelefficiëntietests uit met behulp van een RNA-extractiekit met een 25: 24: 2: 1-verhouding van fenol tot chloroform tot isoamylalcohol en bèta-mercaptoethanol volgens de instructies van de fabrikant. Elueer ten slotte het RNA in 50 microliter elutiebuffer.Voor RT-qPCR-analyse, kwantificeer gepantserd RNA met behulp van tienvoudige verdunningen van een synthetisch enkelstrengs DNA of gBlock-construct. Verkrijg kalibratiecurven voor elke RT-qPCR-run. Neem negatieve controles op en voer de monsters in drievoud uit.Verzamel 10 liter oppervlaktewatermonster. Inclusief 10 liter gedeïoniseerd water voor achtergrondcontrole. Voer capsule- en vacuümfiltratie uit met behulp van membraanschijffilters van 0,45, 0,2 en 0,1 micron om ruis tijdens metagenomics-sequencing te minimaliseren.Stel na filtratie de pH van het watermonster in op 3,5 met behulp van één normaal zoutzuur. Bereid een 1% voorgevlokte magere melkoplossing en stel de pH in op 3,5. Voeg 100 milliliter van de aangezuurde magere melkoplossing toe aan 10 liter aangezuurd milieuwatermonster.Roer het monster gedurende acht uur bij kamertemperatuur op een magnetische schudder en laat de koppels nog eens acht uur door de zwaartekracht bezinken. Verwijder na het bezinken voorzichtig het supernatant met behulp van een vacuümpomp zonder de koppels te storen. Aliquoteer en balanceer de resterende koppels volgens het gewicht in een centrifugebuis van 50 milliliter en centrifuge.Verwijder het supernatant en los de pellet op in 200 microliter 0,2 molaire natriumfosfaatbuffer. Behandel de opgeloste pellets met DNase I en RNase A volgens de instructies van de fabrikant om vrij DNA en RNA te verwijderen dat tijdens het extractieproces is neergeslagen. Na incubatie, inactiveer DNase I en RNase A.Extraheer nucleïnezuren uit de opgeloste pellet met behulp van een DNA- of RNA-extractiekit.Kwantificeer de totale hoeveelheid geëxtraheerd DNA of RNA uit het omgevingsmonster, oppervlaktewatermonster met behulp van een fluorometer. Voer qPCR-analyse uit om enterische virussen van belang te targeten en Illumina-sequencing om de virale gemeenschapsstructuur te identificeren. Verzamel twee liter watermonsters van beschermde en getroffen waterwegen.Als het monster veel vuil bevat, gebruik dan een kaasdoek om ze te verwijderen. Voeg 20 milliliter 1% magere melkoplossing toe aan het eerder pH-aangepaste zoetwatermonster van twee liter. Roer het monster acht uur bij kamertemperatuur en laat de koppels door de zwaartekracht nog eens acht uur bezinken.Verwijder na het bezinken voorzichtig het supernatant met behulp van een peristaltische pomp. Breng de gesedimenteerde koppels over in een centrifugebuis van 50 milliliter en centrifugeer ze gedurende 30 minuten bij 8.000 G bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg en resuspensie van de pellets in 200 microliter 0,2 molaire natriumfosfaatbuffer.Selecteer ongeveer 0,5 gram van het koppel voor DNA-extractie met behulp van de nucleïnezuurisolatiekit van keuze volgens de instructies van de fabrikant. Bepaal de DNA-concentratie en zuiverheid met behulp van een fluorometer. Alle zes monsters verwerkt met ultrafiltratie bij 3.000 G waren positief.Daarentegen was slechts één monster positief wanneer de monsters werden verwerkt met ultrafiltratie bij 7.500 G.Alle monsters die met SMF werden verwerkt, waren positief en resulteerden in een beter herstel. De gemiddelde terugwinningspercentages van 3.000 G en SMF waren significant en consistent hoger dan ultrafiltratie bij 7.500 G.Waterkwaliteitsparameters in beïnvloede monsters en nucleïnezuren geëxtraheerd uit milieuwatermonsters verzameld in Winnipeg gedurende drie seizoenen worden hier samengevat. Monsters verzameld van april tot oktober 2022 uit het water van de Assiniboine-rivier leverden de hoogste DNA-concentratie op van Forested 1 en de laagste concentratie werd teruggevonden van landbouwsite drie.Het is erg belangrijk om de juiste concentratie magere melk te gebruiken en het monster voor gebruik te verzuren. Deze techniek kan een snelle screening bieden van verschillende microbiële pathogenen die aanwezig zijn in omgevingsmonsters zoals water en afvalwater. Aanvullende modificaties kunnen worden uitgevoerd met behulp van vaste matrices zoals grond of sedimenten.

concentration-virus-particles-from-environmental-water-wastewater

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

De omloopsnelheid van virussen in zee-en zoetwater-systemen kan worden geschat door een reductie en herhaling techniek. De gegevens kunnen de onderzoekers om de tarieven van de virus-gemedieerde microbiële sterfte in aquatische systemen af ​​te leiden.

Het schatten van Virus Productie tarieven in aquatische systemen

De studie beschrijft een kosteneffectieve methode voor de identificatie van de bron van fecale / urine besmetting of verontreiniging door nitraten in het water met behulp van qPCR voor de specifieke kwantificering van de mens / varkens / rund DNA-virussen, adenovirussen en polyomavirussen, voorgesteld als MST tools.

Kosteneffectieve methode voor Microbiële Source Tracking Met behulp van specifieke menselijke en dierlijke virussen

Glaswol filters zijn gebruikt om virussen te water te concentreren door een aantal onderzoeksgroepen over de hele wereld. Hier laten we een eenvoudige aanpak voor het construeren van glaswol filters en demonstreren van de filters zijn ook effectief te concentreren op waterbasis virale, bacteriële en protozoa ziekteverwekkers.

Glaswol Filters voor Concentreren op waterbasis Virussen en Landbouw zoönotische pathogenen

Er werd een benadering ontwikkeld voor het identificeren van optimale virale concentratiecondities voor kleine watermonsters met behulp van spikes van humaan adenovirus. De hier beschreven technieken worden gebruikt om concentratieparameters voor andere virale doelen te identificeren en worden toegepast op grootschalige virale concentratie-experimenten.

Een klein volume Procedure voor Virale Concentratie van het Water

EPA-methode 1615 gebruikt een elektropositieve filter om enterovirussen en norovirusessen te concentreren in milieu- en drinkwater. Dit manuscript beschrijft de procedure voor het verzamelen van monsters voor analyse volgens Methode 1615.

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in water per cultuur en RT-qPCR. I. Het verzamelen van Virus Samples

Hier presenteren we een procedure om totale cultiveerbare virussen te meten met behulp van de Buffalo Green Monkey niercel lijn. De procedure biedt een gestandaardiseerd hulpmiddel voor het meten van het voorkomen van infectieuze virussen in milieu- en drinkwater.

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in Water per cultuur en RT-qPCR. II. Totaal kweekbare Virus Assay

We beschrijven hier de laatste ontwikkelingen in virale isolatie voor de karakterisering van nieuwe genotypen van Faustovirus, een nieuw asfarvirus-gerelateerd lijn van gigantische virussen. Dit protocol kan worden toegepast op de isolatie van virussen met hoge doorvoer, met name gigantische virussen die amoeben infecteren.

Een snelle strategie voor de isolatie van nieuwe Faustoviruses van milieumonsters gebruiken<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

Hier presenteren we VirWaTest, wat een eenvoudige, betaalbare en draagbare methode is voor de concentratie en detectie van virussen uit watermonsters op het punt van gebruik.

VirWaTest, een gebruiksmethode voor het opsporen van virussen in water monsters

Bacteriën scheiden nanometergrote extracellulaire blaasjes (EV's) af die bioactieve biologische moleculen dragen. EV-onderzoek richt zich op het begrijpen van hun biogenese, rol in microbe-microbe en gastheer-microbe interacties en ziekte, evenals hun potentiële therapeutische toepassingen. Een workflow voor schaalbare isolatie van EV's van verschillende bacteriën wordt gepresenteerd om standaardisatie van EV-onderzoek te vergemakkelijken.

Schaalbare isolatie en zuivering van extracellulaire blaasjes van Escherichia coli en andere bacteriën

Hier beschrijven we methoden voor bemonstering uit de eufotische zones van mariene en zoetwaterecosystemen om cyanofagen (en hun gastheren) te isoleren en post-bemonsteringsprocessen die afzonderlijke genotypen verrijken en de dynamiek van virus-gastheerinteractie karakteriseren.

Milieubemonstering van fotosynthetische microben en hun virussen: van veld tot laboratorium

Leer het concentreren van virussen uit milieuwater en afvalwater met behulp van magere melkflocculatie. Deze kosteneffectieve methode biedt een eenvoudig alternatief voor ultrafiltratie en ondersteunt efficiënt virale monitoring.

Concentratie van virusdeeltjes uit milieuwater- en afvalwatermonsters met behulp van magere melkflocculatie en ultrafiltratie

Meer video's verkennen