Isolatie van extracellulaire blaasjes met een laag endotoxinegehalte afgeleid van kankercellijnen

Dit protocol biedt richtlijnen voor het voorkomen van besmetting met endotoxine tijdens de isolatie van extracellulaire blaasjes uit celkweeksupernatanten en hoe deze op de juiste manier kunnen worden geëvalueerd. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat elk laboratorium dat zich bezighoudt met EV's endotoxinebesmetting kan beperken door een aseptische procedure te volgen en eenvoudige en algemeen beschikbare apparatuur te gebruiken. Iedereen die deze techniek voor de eerste keer probeert, moet beginnen met nieuwe media, reagentia en plasticware die een laag endotoxine, niet-pyrogeen label hebben.

Gebruik voor dit protocol endotoxinevrije reagentia, water, kweekmedia, gefilterde PBS, ultra-low-endotoxine FBS en ultracentrifugebuizen. Om te beginnen verzamelt u het supernatant van eerder gekweekte SW480- en SW620-cellijnen in correct gelabelde buizen van 15 milliliter. Verwijder celresten door het supernatant gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur op 500 x g te centrifugeren.

Zonder het puin te verstoren, verzamelt u het supernatant in een nieuw gelabelde buis en centrifugeert u gedurende 12 minuten bij vier graden Celsius op 3.200 x g. Breng voorzichtig 45 milliliter van het supernatant over in een verticaal geplaatste steriele buis van 50 milliliter, zonder de randen van de buis nat te maken. Wikkel de dop van de buis met een steriele, transparante film en bewaar deze verticaal bij min 80 graden Celsius voor latere isolatie van extracellulaire blaasjes.

Begin met isoleren door spuitfilters, spuiten en buizen van 0,22 micrometer te bereiden die ongeveer 90 milliliter supernatant bevatten. Vul een spuit met het supernatant en bevestig het filter op de naaldadapter. Filtreer het supernatant door het filter in een buis van 50 milliliter.

Pipetteer zeven milliliter van het filtraat in een voorbereide ultracentrifugebuis en centrifugeer gedurende twee uur bij 100.000 x g bij vier graden Celsius. Gebruik een steriele Pasteurpipet om het supernatant weg te gooien. Trek de pellets in een ultracentrifugebuis met behulp van een lange gefilterde pipetpunt.

Spoel de extracellulaire blaasjes door zeven milliliter gefilterd endotoxinevrij PBS toe te voegen. Gooi na ultracentrifugatie het supernatant weg met een steriele Pasteurpipet en resuspensie de pellet in 200 microliter endotoxinevrije PBS. Breng de suspensie over in een steriele 1,5 milliliter eiwitarme reageerbuis.

Breng vervolgens 10 microliter suspensie over naar een nieuwe buis van 1,5 milliliter voor verdere analyse. Wikkel de dop van de buis en bewaar deze bij min 80 graden Celsius. Verdun nu in een nieuwe buis een microliter suspensie met behulp van gefilterde PBS in een verhouding van 1 tot 1000 voor analyse van nanodeeltjes.

Om een blottinganalyse uit te voeren, mengt u eerst 20 microgram van de monsters met een laadbuffer. Incubeer de monsters bij 70 graden Celsius gedurende 10 minuten. Laad vervolgens 20 microgram van het monster in elke put van een 10 tot 14% polyacrylamidegel met SDS en voer elektroforese uit gedurende 45 minuten op 150 volt, met lopende buffer.

Plaats vervolgens de gel in een transfermachine met Towbin-buffer en voer een semi-droge overdracht van eiwitten uit op een polyvinylideendifluoridemembraan bij 25 volt gedurende een uur. Blokkeer het membraan met 1%BSA door het een uur op een rocker te laten broeden. Voeg BSA verdunde antilichamen, anti-CD9 of anti-Alix, toe aan het membraan en incuber 's nachts bij vier graden Celsius op een rocker.

Na het verwijderen van de antilichamen, was het membraan driemaal met 10 milliliter TBST gedurende 10 minuten. Voeg nu geit anti-konijn of anti-muis secundair antilichaam toe en incubeer opnieuw op een rocker gedurende een uur bij kamertemperatuur. Gooi het antilichaam weg en was het membraan zoals eerder aangetoond.

Giet een milliliter van de oplossing met substraat en luminol in een gelijke verhouding op het membraan. Plaats het membraan onmiddellijk in een beeldvormingssysteem en visualiseer de eiwitbanden op het scherm. In de huidige studie bevestigde western blot-analyse de aanwezigheid van twee extracellulaire blaasjesmarkers, CD9 en Alix.

De gemiddelde grootte en concentraties van de blaasjes geïsoleerd uit zowel SW480 als SW620 waren vergelijkbaar. Stimulatie van monocyten met verschillende doses lipopolysaccharide, of LPS, toonde de laagste dosis LPS die de secretie van interleukine 10 mogelijk maakte en de tumornecrosefactor in monocyten was 50 picogram per milliliter. De chromogene LAL-test gaf aan dat LPS-besmetting van de extracellulaire blaasjes ongeveer 50 picogram per milliliter was voor beide cellijnen.

Het belangrijkste om te onthouden is het gebruik van LPS-vrije of uitgeputte reagentia en routinematige LPS-meting bij elke stap van de procedure. Het voorkomen van endotoxinebesmetting is gemakkelijker dan het elimineren ervan. Het voorgestelde protocol beperkt de mogelijkheid van valse resultaten als gevolg van de besmetting van EV's met endotoxine en maakt het mogelijk om de EV-activiteit per cel te beoordelen.

Het voorgestelde protocol is nuttig voor onderzoekers die werken met endotoxinegevoelige cellen, zoals monocyten, dendritische cellen en macrofagen.