Name: Het meten van de embryonale levensvatbaarheid en broedgrootte bij Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Leer embryonale levensvatbaarheid en broedgrootte meten bij Caenorhabditis elegans. Deze gestandaardiseerde methode helpt beginnende onderzoekers genetische factoren in ontwikkeling te identificeren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk in het Jaramillo-Lambert-lab wordt ondersteund door de National Institutes of Health NIGMS R35GM142524. Alle C. elegans-stammen werden geleverd door het Caenorhabditis Genetics Center, dat wordt gefinancierd door de National Institutes of Health, P40 OD010440. Figuur 1D is gemaakt met behulp van Biorender.com.

OPMERKING: Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen die in dit protocol worden gebruikt.
1. Experimentele platen voorbereiden
<ol><li>Bereid petrisalen met een diameter van 35 mm met gemodificeerde Youngren's, alleen Bacto-pepton (MYOB) media. Om MYOB-platen te maken, voegt u 20 g Bacto-agar, 2 g NaCl, 0,55 g Trizma-HCl, 0,24 g Trizma-OH, 3,1 g Bacto-pepton en 1,6 ml cholesterol toe aan 1 L ddH2O en autoclaaf gedurende 40 minuten bij 121 °C. Laat het afkoelen tot 55 °C en giet met behulp van steriele techniek 4 ml van de gesmolten media in elke petrischaal van 35 mm. OPMERKING: Een liter MYOB maakt ~ 250 platen, die tot 6 maanden bij 4 °C kunnen worden bewaard. We raden een minimum van 10 personen per replicatie aan met drie replicatiesets voor elke stam.</li>
	<li>Met behulp van steriele techniek, zaai de platen met een kleine vlek (ongeveer 50 μL) van OP50-bacteriën in het midden van de plaat. OPMERKING: Kleine gazons zijn vooral belangrijk voor het beoordelen van kruisbestuiving, omdat de kleinere plek leidt tot verhoogde ontmoetingen tussen mannetjes en hermafrodieten, waardoor de kans op paring toeneemt.</li>
</ol>2. Embryonale levensvatbaarheidstests (hermafrodiete zelfbevruchting)
<ol><li>Dag 1<ol><li>Label de achterkant van elk bord. Zorg ervoor dat u elke plaat en hun respectieve wormen tijdens het experiment bijhoudt. OPMERKING: Voorkeursetiketteringstechniek-Dag 1: worm 1, Dag 1: worm 2, ... enz.</li>
		<li>Breng een individuele L4-fase hermafrodiet over op elke plaat. Zorg ervoor dat er geen embryo's of andere wormen op de plaat worden overgebracht. Laat de wormen zich ontwikkelen tot volwassenen en leg gedurende 24 uur zelfvoorzienend bij de standaard kweektemperatuur van 20 °C. Scoor deze borden op dag 3. OPMERKING: De temperatuur van experimenten kan worden gewijzigd in het geval van temperatuurgevoelige mutaties. Voor temperatuurgevoelige mutaties moeten embryonale levensvatbaarheidstests worden uitgevoerd bij zowel de permissieve (15-16 °C) als de niet-permissieve temperatuur (24-26 °C).</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 2<ol><li>Label een set nieuwe platen-Dag 2: worm 1, Dag 2: worm 2, ... enz.</li>
		<li>Breng dag 1 individuele wormen over op de nieuwe platen. OPMERKING: Deze wormen moeten de volwassen leeftijd hebben bereikt en wilde wormen moeten al zijn begonnen met het leggen van embryo's.</li>
		<li>Laat de wormen gedurende 24 uur embryo's leggen bij 20 °C of een andere geschikte temperatuur. Scoor deze borden op dag 4.</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 3<ol><li>Label een set nieuwe platen. Dag 3: worm 1, Dag 3: worm 2, ... enz.</li>
		<li>Breng dag 2 individuele wormen over op nieuwe platen. Laat ze 24 uur nageslacht leggen bij 20 °C of een andere geschikte temperatuur. Scoor deze borden op dag 5. OPMERKING: In geval van lagere temperaturen worden de broedtijden verlengd. Pas dienovereenkomstig aan.</li>
		<li>Teken een rasterpatroon op een deksel van 35 mm met een fijne stift. Plaats het gerasterde deksel onder de testplaat om te tellen om de eerder getelde wormen bij te houden (figuur 1A-B).<ol><li>Scoor met behulp van een differentiële celteller de dag 1-platen voor de aan- of afwezigheid van nakomelingen. Tel de levende larven en niet-gehate embryo's. OPMERKING: Op dit punt is er voldoende tijd verstreken zodat alle levensvatbare embryo's moeten zijn uitgekomen. Alle niet-gehate embryo's worden verondersteld dood te zijn.</li>
			<li>Tel binnen een individueel vierkant de niet-gehate embryo's en levende larven die zich volledig binnen het vierkant bevinden (figuur 1C-F).</li>
			<li>Voor wormen die zich op de vierkante randen bevinden, telt u op basis van de locatie van de wormkop. Tel wormen met koppen die de boven- en linkerrand van het vierkant raken (tel niet degenen die de onder- of rechterrand raken; Figuur 1D). Tel onbevruchte eicellen niet mee voor deze test (figuur 1F).</li>
		</ol></li>
		<li>Noteer het aantal levende larven en niet-gehate embryo's in een laboratoriumnotitieboek.</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 4<ol><li>Scoor de dag 2 platen door de levende larven en niet-gehate embryo's te tellen, zoals beschreven in stap 2.3.3.1. Noteer het aantal levende larven en niet-gehate embryo's in een laboratoriumnotitieboek.</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 5<ol><li>Scoor de dag 3 platen door de levende larven en niet-gehate embryo's te tellen, zoals beschreven in stap 2.3.3.1. Noteer het aantal levende larven en niet-gehate embryo's in een laboratoriumnotitieboek. Analyseer de verkregen gegevens met behulp van de methode die wordt beschreven in de gegevensanalyse. OPMERKING: Sommige genetische mutanten kunnen een vertraagde of uitgebreide voortplantingscyclus hebben. Controleer individuele stammen voor het blijven leggen van embryo's na de dag 3-platen. Als de embryoproductie op dag 4 niet is gestopt, ga dan door met het overbrengen van volwassenen naar nieuwe platen.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Embryonale levensvatbaarheidstests (kruisbestuiving tussen mannen en hermafrodiet)
<ol><li>Dag 1<ol><li>Label de achterkant van elk bord. Zorg ervoor dat u elke plaat en hun respectieve wormen tijdens het experiment bijhoudt.</li>
		<li>Breng een individuele L4 hermafrodiet worm over op elke plaat. Zorg ervoor dat er geen embryo's of andere wormen op de plaat worden overgebracht. OPMERKING: Gefeminiseerde stammen, zoals mist-2 verlies-van-functie mutanten, die geen sperma produceren, kunnen worden gebruikt in plaats van hermafrodieten.</li>
		<li>Breng een enkele L4-mannelijke worm over op elke gelabelde plaat met een L4-hermafrodiet. Zorg ervoor dat er geen embryo's of andere wormen op de plaat worden overgebracht. OPMERKING: Stammen zoals plg-1-variant mannetjes kunnen worden gebruikt om te identificeren of er paring heeft plaatsgevonden, omdat deze mannetjes na de paring een copulatorische plug op de hermafrodiete vulva afzetten.</li>
		<li>Laat de wormen paren en leg het nageslacht gedurende 24 uur bij 20 °C, of een andere geschikte temperatuur. Scoor deze platen voor levende larven versus niet-gehate embryo's op dag 3.</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 2<ol><li>Label een set nieuwe platen en breng de wormen over, zoals op dag 2 hierboven. Zorg er in dit geval voor dat u zowel de hermafrodiet als het mannetje op nieuwe platen overbrengt. Zorg ervoor dat de hermafrodiet de volwassen leeftijd heeft bereikt.</li>
		<li>Laat de hermafrodieten gedurende 24 uur bij 20 °C of een andere geschikte temperatuur nakomelingen leggen. Scoor deze platen voor levende larven versus niet-gehate embryo's op dag 4.</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 3<ol><li>Label een set nieuwe platen en breng de wormen over, zoals op dag 3 hierboven. Zorg ervoor dat u zowel de hermafrodiet als het mannetje op nieuwe platen overbrengt.</li>
		<li>Laat het nageslacht 24 uur leggen bij 20 °C of een andere geschikte temperatuur. Scoor deze platen voor levende versus niet-gehate embryo's op dag 5.</li>
		<li>Tel met behulp van een differentiële celteller de levende larven en niet-gehate embryo's vanaf de dag 1-platen, zoals beschreven in stap 2.3.3.1. OPMERKING: Gooi de platen niet weg, omdat ze nodig zijn voor dag 4.</li>
		<li>Noteer het aantal levende larven en niet-gehate embryo's in een laboratoriumnotitieboek.</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 4<ol><li>Tel de levende nakomelingen en niet-gehate embryo's van de dag 2 platen, zoals beschreven in stap 2.3.3.1. Noteer het aantal levende larven en niet-gehate embryo's in een laboratoriumnotitieboek.</li>
		<li>Controleer de dag 1 borden voor mannen. Als de paring heeft plaatsgevonden, moet de verwachte genetische verhouding van hermafrodieten tot mannetjes 50:50 zijn. Als dag 1-platen geen mannetjes bevatten, vond paring tussen het mannetje en hermafrodiet niet plaats. Gooi dit paringspaar weg en noteer deze waarneming in het laboratoriumnotitieboekje.</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 5<ol><li>Tel de levende larven en niet-gehate embryo's van de dag 3-platen, zoals beschreven in stap 2.3.3.1. Noteer het aantal levende larven en niet-gehate embryo's in een laboratoriumnotitieboek. Analyseer de verkregen gegevens met behulp van de methoden die worden beschreven in de gegevensanalyse.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Data-analyse
<ol><li>Bereken het embryonale levensvatbaarheidspercentage van een gegeven biologische replicatie van een stam met behulp van vergelijking (1). OPMERKING: Het aantal levende nakomelingen en niet-gehate embryo's wordt verkregen door de dagelijkse telling over de experimentele periode op te tellen. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65064/65064eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)</li>
	<li>Bereken de broedgrootte per worm van een bepaalde stam door het aantal nakomelingen (niet-gehate embryo's en larven) geproduceerd door de ouder hermafrodiet op te tellen. Bereken de gemiddelde broedgrootte met behulp van vergelijking (2). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/65064/65064eq02.jpg" style="margin: auto;">(2)</li>
	<li>Rapporteer het embryonale levensvatbaarheidspercentage en de gemiddelde broedgrootte met de gemiddelde en standaardafwijking tussen biologische replicaties. Voer de t-test van de student uit door de controle- en experimentele gegevens te vergelijken.</li>
</ol>

<ol><li>Hillers, K., Jantsch, V., Martinez-Perez, E., Yanowitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Meiosis.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , (2017).</li>
<li>O'Connor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+abnormalities%3A+aneuploidies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Education%22%5BJournal%5D)">Chromosomal abnormalities: aneuploidies.</a> Nature Education. 1 (1), 172(2008).</li>
<li>Marcello, M. R., Singaravelu, G., Fertilization Singson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Fertilization.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 321-350 (2013).</li>
<li>Marcello, M. R., Singson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+and+the+oocyte-to-embryo+transition+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Reports%22%5BJournal%5D)">Fertilization and the oocyte-to-embryo transition in C. elegans.</a> BMB Reports. 43 (6), 389-399 (2010).</li>
<li>Robertson, S., Lin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oocyte-to-embryo+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">The oocyte-to-embryo transition.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 351-372 (2013).</li>
<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transparent+window+into+biology%3A+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">A transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-31 (2015).</li>
<li>Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondisjunction+mutants+of+the+nematode+CAENORHABDITIS+ELEGANS%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Nondisjunction mutants of the nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.</a> Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).</li>
<li>Chu, D. S., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Spermatogenesis.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 171-203 (2013).</li>
<li>Dernburg, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+recombination+in+C.+elegans+initiates+by+a+conserved+mechanism+and+is+dispensable+for+homologous+chromosome+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Meiotic recombination in C. elegans initiates by a conserved mechanism and is dispensable for homologous chromosome synapsis.</a> Cell. 94 (3), 387-398 (1998).</li>
<li>Bhandari, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+suppressors+of+top-2+embryonic+lethality+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Identification of suppressors of top-2 embryonic lethality in Caenorhabditis elegans.</a> G3. 3 (4), 1183-1191 (2020).</li>
<li>Jaramillo-Lambert, A., Fabritius, A. S., Hansen, T. J., Smith, H. E., Golden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+a+novel+mutant+allele+of+topoisomerase+II+in+Caenorhabditis+elegans+reveals+a+unique+role+in+chromosome+segregation+during+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The identification of a novel mutant allele of topoisomerase II in Caenorhabditis elegans reveals a unique role in chromosome segregation during spermatogenesis.</a> Genetics. 204 (4), 1407-1422 (2016).</li>
<li>Jaramillo-Lambert, A., Golden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C-terminus+of+SPE-11+is+required+for+proper+embryonic+development+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22microPublication+Biology%22%5BJournal%5D)">The C-terminus of SPE-11 is required for proper embryonic development in C. elegans.</a> microPublication Biology. , (2020).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Voortplanting van seksuele reproducerende soorten vereist de vorming van haploïde gameten (d.w.z. eieren en sperma) door meiose, die vervolgens worden verenigd bij de bevruchting, waardoor het diploïde chromosoomnummer wordt hersteld en de embryonale ontwikkeling wordt geïnitieerd. Fouten in een van deze processen kunnen leiden tot onvruchtbaarheid, embryonale letaliteit en / of geboorteafwijkingen. C. elegans is een krachtig modelsysteem om seksuele voortplanting te bestuderen. De effecten van genmutaties of genexpressie knockdown (bijv. RNA-interferentie) kunnen relatief snel en gemakkelijk worden beoordeeld met behulp van de embryonale levensvatbaarheid en broedgroottetests die hierboven zijn beschreven. We hebben deze methoden gebruikt voor de initiële karakterisering van genen die betrokken zijn bij meiotische chromosoomsegregatie en bevruchting / eicelactivering10,11,12. Een waargenomen vermindering van de embryonale levensvatbaarheid of broedgrootte duidt op een verstoring van meiose, gametogenese, bevruchting of embryogenese.
Omdat de embryonale levensvatbaarheid en broedgrootte relatief eenvoudig worden beoordeeld door het tellen van nakomelingen en een eenvoudige wiskundige berekening, zijn dit optimale inleidende experimenten voor beginnende onderzoeksners in het laboratorium of in de klas. Het gemak van de C. elegans-houderij en de economische voordelen maken ze bijzonder geschikt voor experimentele biologielessen. De studenten doen waardevolle onderzoekservaring op via C. elegans houderij, leren ontleedmicroscopen te gebruiken en kunnen biologische vragen stellen in een ontwikkelingssysteem die in een relatief korte tijd (ongeveer 5 dagen met het protocol beschreven in dit artikel) kunnen worden beantwoord.
De timing van het aantal nakomelingen is erg belangrijk voor embryonale levensvatbaarheidstests. Bij 20 °C duurt de embryogenese ongeveer 16 uur en reproductief volwassen volwassenen beginnen ongeveer 60 uur na het uitkomen eieren te leggen als L1-larven. Omdat de levenscyclus snel is, is het belangrijk om nakomelingen binnen het juiste venster te tellen, waardoor embryo's voldoende tijd hebben om uit te komen, maar voordat de nakomelingen zelf eieren beginnen te leggen. Het is ook belangrijk op te merken dat groeiperioden variëren afhankelijk van de temperatuur. De groei is ongeveer 2,1 keer sneller bij 24-25 °C dan 15-16 °C en ongeveer 1,3 keer sneller bij 20 °C dan 15-16 °C13. In dit protocol raden we aan dat tellingen 48 uur nadat de volwassenen op een vers bord zijn geplaatst, plaatsvinden. Dit tijdsbestek zorgt ervoor dat alle embryo's met een wildtype ontwikkeling voldoende tijd hebben om uit te komen (>16 uur), maar niet verouderen tot het punt van voortplantingsvermogen. Tests die worden uitgevoerd bij temperaturen lager dan 20 °C moeten mogelijk worden uitgebreid (dieren gedurende 4 dagen terugplaatsen) voordat embryo's uitkomen en voor uitgekomen nakomelingen larvale stadia bereiken die gemakkelijker waarneembaar zijn tussen de bacteriën op de MYOB-platen (L3-L4-stadia).
Een beperking van embryonale levensvatbaarheidstests en broedgrootte is dat het specifieke ontwikkelingsproces dat wordt verstoord niet direct duidelijk is. Deze initiële testen kunnen echter worden gevolgd met cytologische technieken om te bepalen welk proces wordt beïnvloed. Bijvoorbeeld, dissectie van de volwassen wormen om de gonade vrij te geven, gevolgd door 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) kleuring en zorgvuldige analyse van DNA-morfologie in de kiembaan kan onthullen of meiotische processen worden verstoord. Bovendien kan DAPI-kleuring van embryo's onthullen in welk stadium embryogenese stopt.
Tot slot hebben we een protocol beschreven voor het bepalen van het aantal geproduceerde embryo's (broed) en het percentage embryo's dat levensvatbaar is voor verschillende C. elegans-mutanten. Deze test kan worden gebruikt voor zowel zelfbevruchtende hermafrodieten als voor mannelijke / hermafrodiete kruisingen. Met de korte levenscyclus van C. elegans kan dit protocol in minder dan 1 week worden voltooid. Embryonale levensvatbaarheidstests en broedgroottes kunnen worden gebruikt als eerste analyses van genen die betrokken zijn bij meiose, bevruchting of embryonale ontwikkeling, en zijn geschikte protocollen voor meer geavanceerde onderzoekers en onderzoeksbeginners (niet-gegradueerde en eerstejaars afgestudeerde studenten).

Seksuele voortplanting in eukaryote organismen vereist de productie van functionele gameten die samensmelten tot een embryo door het proces van bevruchting. Maternale en vaderlijke gameten, eicellen en sperma worden gemaakt door de gespecialiseerde celdelings- en differentiatieprocessen van meiose en gametogenese1. Meiose begint met een enkele diploïde cel en eindigt met de vorming van dochtercellen die de helft van het aantal chromosomen van de oorspronkelijke oudercel bevatten. Van het verminderen van ploïdie tot het schuifelen van genetisch materiaal via onafhankelijk assortiment en crossover-recombinatie, meiose heeft meerdere belangrijke functies1. Fouten in meiose kunnen leiden tot aneuploïdie, waarbij er te veel of te weinig chromosomen in een gameet zitten. Incidenties van aneuploïdie hebben enorme gevolgen voor de menselijke gezondheid, omdat chromosomale onevenwichtigheden een belangrijke oorzaak zijn van miskramen en ontwikkelingsstoornissen zoals het syndroom van Down en het syndroom van Edwards2.
Bevruchting is het proces waarbij de maternale en vaderlijke gameten samensmelten om een nieuw organismete genereren 3. Gameten-gametenherkenning wordt vergemakkelijkt door eiwitten op het gametenoppervlak3. Fouten met gametencompatibiliteit leiden tot onvruchtbaarheid omdat sperma- en eifusie niet kan doorgaan. De fusie van sperma met een eicel veroorzaakt een groot aantal gebeurtenissen die leiden tot de juiste vorming van een actief embryo dat de ontwikkelingsreis van een eencellig embryo naar een volledig functioneel meercellig organisme via mitotische delingen kan beginnen4. Gedurende de embryogenese moeten moleculaire gebeurtenissen die de ontwikkeling reguleren strak worden gereguleerd en nauwkeurig worden getimed om een goede groei van het organisme mogelijk te maken5. Een goede cellulaire differentiatie tijdens de vroege ontwikkeling is cruciaal omdat het organisme overgaat van een pluripotent embryo naar een volwaardig organisme. Vanwege de complexiteit van deze gebeurtenissen kunnen verstoringen leiden tot ontwikkelingsstoornissen die resulteren in embryonale letaliteit.
Caenorhabditis elegans is een uitstekend modelorganisme om meiose, bevruchting en embryonale ontwikkeling te bestuderen. C. elegans is een transparante nematode die twee geslachten heeft, mannetjes en hermafrodieten. C. elegans hermafrodieten, die in staat zijn tot zelfbevruchting, zijn het overheersende geslacht 6,7. De hermafrodiet gonade produceert eerst sperma tijdens het vierde larvale (L4) stadium, dat wordt opgeslagen in de spermatheca. Bij de overgang van L4 naar volwassenheid schakelt de kiembaan over op het produceren van eicellen, die vervolgens worden bevrucht via het opgeslagen sperma. Mannetjes, die voorkomen in hermafrodieten met een snelheid van minder dan 0,2%, produceren alleen sperma en kunnen paren met hermafrodieten. Bij kruisbestuiving overtreft mannelijk sperma hermafrodiet sperma bij de bevruchting van eicellen8. Dit maakt het relatief eenvoudig in stand houden van homozygote mutanten door zelfbevruchtende voorraden en voor genetische manipulaties door genetische kruisingen. De twee geslachten maken studies mogelijk die verschillen tussen meiose in mannelijke en vrouwelijke kiembanen onderzoeken. Verder, vanwege de transparante aard van C. elegans en zijn eieren, kunnen de processen van meiose, gametogenese, bevruchting en embryogenese worden bestudeerd in levende, intacte dieren met behulp van fluorescentiebeeldvormingstechnieken.
Bij het analyseren van nieuwe mutaties in genen die een rol kunnen spelen bij meiose, bevruchting en / of embryonale ontwikkeling in C. elegans, is een cruciale eerste stap het bepalen van de embryonale levensvatbaarheid en broedgrootte, omdat fouten in deze processen vaak leiden tot een mislukking of vermindering van de productie van levensvatbare nakomelingen. Dit artikel beschrijft een protocol voor het beoordelen van vruchtbaarheid, embryonale levensvatbaarheid en broedgrootte van zelfbevruchtende hermafrodieten of kruisingen tussen hermafrodieten en mannetjes. Hoewel deze klassieke test in veel C. elegans-onderzoeken is gebruikt, bieden we een gestandaardiseerd protocol voor het instellen en nauwkeurig kwantificeren. In dit protocol worden individuele wormen of mannelijke / hermafrodiete paren geïsoleerd om paring en nageslachtsproductie mogelijk te maken. De productie en levensvatbaarheid van het nageslacht worden gedurende een reeks dagen waargenomen om het aantal levensvatbare nakomelingen en niet-levensvatbare embryo's te bepalen. Aan het einde van het experiment worden individuele broedsels geanalyseerd om het embryonale levensvatbaarheidspercentage en de totale broedgrootte te berekenen.

<table><tbody><tr><td>Materialen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri schotels</td><td>Tritech research</td><td>T3501</td><td>Semi-stapelvaardig, niet-ventilerend.</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>214010</td><td>Voor MYOB</td></tr><tr><td>Bacto-Peptone</td><td>Gibco</td><td>211677</td><td>Voor MYOB</td></tr><tr><td>Cholestrol</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C8503</td><td>Voor MYOB</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>J.T. Baker</td><td>FW 58.440</td><td>Voor MYOB</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Voor MYOB</td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td>Voor MYOB</td></tr><tr><td>Stams</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C. elegans wild type stam</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>N2</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>him-5(e1490)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>DR466</td><td></td></tr><tr><td>spo-11(ok79)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>AV106</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur/software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Differentiële celteller</td><td>Fischer Scientific</td><td>02-670-12</td><td></td></tr><tr><td>MicroSoft Excel of Prism</td><td>MicroSoft of GraphPad</td><td></td><td>Voor het vastleggen en maken van grafische weergaven van gegevens.</td></tr><tr><td>platinadraad</td><td>Tritech research</td><td>PT9901</td><td>Voor het maken van worm pickers. 99,5% platina, 0,5% iridium. Dit komt als 3 ft/pakket, wat voldoende is voor het maken van 36 worm pickers (ongeveer 1 inch platinadraad per picker).</td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Nikon</td><td>SMZ-745</td><td>Diascopische basis met focusbevestiging, geïntegreerd LED-module, stroomkabel, 6,7x tot 50x Zoombereik [WD 115 mm], Widefield Eyepiece C-15x/17 (Opmerking: equivalente stereomicroscopen zijn verkrijgbaar bij andere fabrikanten.)</td></tr><tr><td>worm pick handvat</td><td>Tritech research</td><td>TWPH1</td><td>Voor het maken van worm pickers. Monteer ~1 inch platinadraad in worm pick handvat. Alternatief kunnen worm pickers worden gemaakt door platinadraad in een glazen Pasteur-pipet te monteren.</td></tr></tbody></table>

het meten van de embryonale levensvatbaarheid en broedgrootte bij caenorhabditis elegans

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is een uitstekend modelorganisme voor de studie van meiose, bevruchting en embryonale ontwikkeling. C. elegans bestaan als zelfbevruchtende hermafrodieten, die grote broedsels van nakomelingen produceren - wanneer mannetjes aanwezig zijn, kunnen ze nog grotere broedsels van kruisprogenageslacht produceren. Fouten in meiose, bevruchting en embryogenese kunnen snel worden beoordeeld als fenotypen van steriliteit, verminderde vruchtbaarheid of embryonale letaliteit. Dit artikel beschrijft een methode om de embryonale levensvatbaarheid en broedgrootte bij C. elegans te bepalen. We laten zien hoe je deze test kunt opzetten door een worm te plukken op een individuele Modified Youngren's, Only Bacto-peptone (MYOB) plaat, het juiste tijdsbestek vast te stellen om levensvatbare nakomelingen en niet-levensvatbare embryo's te tellen, en uitleggen hoe je levende wormmonsters nauwkeurig kunt tellen. Deze techniek kan worden gebruikt om de levensvatbaarheid te bepalen bij zelfbevruchtende hermafrodieten en kruisbestuiving door paringparingen. Deze relatief eenvoudige experimenten zijn gemakkelijk te adopteren voor nieuwe onderzoekers, zoals niet-gegradueerde studenten en eerstejaars afgestudeerde studenten.

We voerden embryonale levensvatbaarheids- en broedgroottetests uit op N2 (wild type) en op twee stammen met mutaties in genen die betrokken zijn bij meiose, him-5 (e1490) en spo-11 (ok79). Omdat zowel him-5 als spo-11 een rol spelen bij de vorming van meiotische crossovers, resulteren mutaties in deze twee genen in de vorming van aneuploïde gameten. Deze embryonale levensvatbaarheidstest voor N2 leverde een levensvatbaarheidspercentage van 98,9% op, terwijl zowel him-5(e1490) als spo-11(ok79) een vermindering van de levensvatbaarheid van het nageslacht lieten zien met een percentage van respectievelijk 74,9% en 0,8% (figuur 2A; blz < 0,0005). Deze resultaten komen overeen met eerder gepubliceerde resultaten 7,9. De gemiddelde broedgrootte van N2, him-5(e1490) en spo-11(ok79) werd bepaald op respectievelijk 217, 105 en 219 (figuur 2B). In overeenstemming met eerdere publicaties heeft him-5(e1490) een aanzienlijk kleinere broedgrootte in vergelijking met wild type, terwijl spo-11(ok79) niet 7,9 heeft.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65064/65064fig01.jpg"> Figuur 1: Demonstratie van telopstelling en embryomorfologie op platen . (A) Afbeelding van een deksel met een kruislings gearceerd rasterpatroon getekend met behulp van een fijne sharpie. (B) Een Myob-plaat van 35 mm met daaronder het deksel met patroon om te tellen. (C) Afbeelding met een laag vergrotingsveld (10x) met meerdere vakken van het raster. Witte pijlpunten wijzen op verschillende larven binnen dit gezichtsveld. Tellen moet worden gedaan met een hogere vergroting (slechts één vierkant in het veld) om zowel larven als embryo's te observeren. Schaalbalk = 1.000 μm. (D) Cartoon van het deksel met het rasterpatroon onder een plaat van 35 mm. De inzet geeft de juiste techniek aan om te bepalen welke larven in een bepaald vierkant worden geteld. Tel van boven naar beneden, van links naar rechts. Tel alle wormen die zich volledig binnen het vierkant bevinden. Wormen die de grens raken, moeten worden geteld op basis van de positie van de wormkop, niet de staart. Tel wormen die naar het huidige raster of rasters zijn gericht die eerder zijn geteld (d.w.z. boven- en linkerranden). Tel geen wormen met koppen die de onder- of rechterrand raken. Vanaf de inzet worden blauwe wormen geteld en rode wormen niet. (E) Representatief beeld van gezonde N2 L1 uitgekomen larven (witte pijlpunt). (F) Representatief beeld van een onbevruchte eicel (zwarte pijlpunt) en een niet-gehate embryo (rode pijlpunt). Onbevruchte eicellen mogen niet worden meegeteld voor deze test. Schaalstaven (E,F) = (100 μm). Opmerking: Beelden in C, E en F zijn gemaakt met een Zeiss AxioZoom-microscoop, met een camera bevestigd om het uiterlijk van larven, embryo's en eicellen op wormplaten aan te tonen. Voor embryonale levensvatbaarheidstests worden tellingen gedaan terwijl de platen worden geobserveerd met behulp van een stereomicroscoop (geen camera). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65064/65064fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65064/65064fig02.jpg"> Figuur 2: Representatieve grafieken met de resultaten van embryonale levensvatbaarheidstests en broedgroottes. (A) Embryonaal levensvatbaarheidspercentage van N2, him-5(e1490) en spo-11(ok79) bij 20 °C. (B) Broedgrootten van N2, him-5(e1490) en spo-11(ok79) bij 20 °C. De nakomelingen van ten minste 28 hermafrodieten werden gescoord voor elke stam. Het totale aantal niet-gehate embryo's plus gescoorde larven was N2 = 6302, him-5 (e1490) = 2.945 en spo-11 (ok79) = 7.230. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan over drie afzonderlijke afzonderlijke replicaties. Statistieken berekend met behulp van student's t-test, n.s. = niet significant, *p < 0,0005. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65064/65064fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Hier presenteren we een algemene methode om de embryonale levensvatbaarheid en het totale aantal geproduceerde embryo's (broed) te bepalen met behulp van het modelorganisme C. elegans.

Het meten van de embryonale levensvatbaarheid en broedgrootte bij Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as ...

Dit protocol voor het bepalen van de broedgrootte en embryonale levensvatbaarheid wordt door veel C.elegans-laboratoria gebruikt. Afname van brute grootte en embryonale levensvatbaarheid kan wijzen op defecten in belangrijke ontwikkelingsprocessen zoals myose, bevruchting en embryogenese. Deze techniek geeft duidelijke instructies voor beginnende C.elegans onderzoekers.Het is relatief eenvoudig in te stellen en uit te voeren en is een goed startpunt bij het werken met nieuwe mutante stammen. De grootste uitdaging voor deze techniek is embryo versus onbevruchte embryo identificatie. Nieuwe onderzoekers moeten de identificatie van embryo's, eicellen en de verschillende larvale stadia oefenen voordat ze met deze experimenten beginnen.Om te beginnen, label de achterkant van de plaat, breng een individuele L4-fase hermafrodiet over naar de plaat. Zorg ervoor dat er geen embryo's of andere wormen op de plaat worden overgebracht. Laat de wormen zich ontwikkelen tot volwassenen en leg 24 uur lang zelfvoorzienend bij de standaard kweektemperatuur van 20 graden Celsius.Scoor het bord op dag drie. Label de volgende dag een set nieuwe platen en breng de dag één individuele worm over op de nieuwe plaat. Laat de wormen 24 uur lang embryo's leggen bij 20 graden celsius.Scoor het bord op dag vier. Label op dag drie een set nieuwe platen en breng dag twee individuele wormen over op de nieuwe plaat. Laat de wormen 24 uur nageslacht leggen op 20 graden.Scoor het bord op dag vijf. Teken een rasterpatroon op een deksel van 35 millimeter met behulp van een fijne stift. Plaats het gerasterde deksel onder de testplaat om te tellen om de eerder getelde wormen bij te houden.Tel met behulp van een differentiële celteller de levende larven en niet-gehate embryo's binnen het individuele vierkant. Voor wormen op de vierkante randen tellen op basis van de locatie van de wormkop. Tel wormen met koppen die de boven- en linkerrand van het vierkant raken.Noteer het aantal levende larven en niet-gehate embryo's in een laboratoriumnotitieboek. Op dag vier scoor je de plaat van dag twee door de levende larven en niet-gehate embryo's te tellen en ze vast te leggen in een laboratoriumnotitieboekje. Op dag vijf scoor je de plaat van dag drie door de levende larven en niet-gehate embryo's te tellen en noteer je ze in een laboratoriumnotitieboekje.Nadat u de achterkant van de plaat hebt gelabeld, brengt u een individuele L4-hermafrodietworm over op de plaat. Zorg ervoor dat er geen embryo's of andere wormen op de plaat worden overgebracht. Breng een enkele L4 mannelijke worm over op de plaat met een L vier hermafrodiet.Laat de wormen paren en leg 24 uur na na 20 graden celsius. Scoor het bord voor levende larven versus niet-gehate embryo's op dag drie. Label de volgende dag een set nieuwe platen en breng de hermafrodiet en het mannetje over op het nieuwe bord.Zorg ervoor dat de hermafrodiet de volwassen leeftijd heeft bereikt. Laat de hermafrodieten 24 uur nageslacht leggen bij 20 graden celsius. Scoor de plaat voor levende larven versus niet-gehate embryo's op dag vier.Label op dag drie een set nieuwe platen en breng de hermafrodiet en het mannetje over op het nieuwe bord. Laat de wormen 24 uur nageslacht leggen op 20 graden. Scoor de plaat voor levende versus niet-gehate embryo's op dag vijf.Tel met behulp van een differentiële celteller de levende larven en niet-gehate embryo's vanaf de eerste dag en noteer ze in een laboratoriumnotitieboekje. Tel op dag vier de levende nakomelingen en niet-gehate embryo's van de plaat van dag twee en noteer ze in een laboratoriumnotitieboekje. Controleer de dag één plaat voor mannen.Als er paring heeft plaatsgevonden, is de verwachte genetische verhouding van hermafrodieten tot mannetjes 50 tot 50. Als de dag één plaat geen mannetjes bevat, vond er geen paring plaats tussen het mannetje en hermafrodiet. Gooi dit paringspaar weg en noteer de waarneming in het laboratoriumnotitieboekje.Tel op dag vijf de levende larven en niet-gehate embryo's van de plaat van dag drie en noteer ze in een laboratoriumnotitieboekje. De embryonale levensvatbaarheidstest voor N2 leverde een levensvatbaarheidspercentage van 98,9% op, terwijl zowel him-5(e1490)als spo-11(ok79) een vermindering van de embryonale levensvatbaarheid lieten zien met een percentage van respectievelijk 74,9% en 0,8%. De gemiddelde broedgrootte van N2, him-5(e1490)en spo-11(ok79)werd bepaald op respectievelijk 217, 105 en 219.Herkenning van de verschillende stadia van de ontwikkeling van C.elegans is belangrijk voor nauwkeurige en reproduceerbare gegevens. We raden aan om vertrouwd te raken met de ontwikkeling van wormen met behulp van foto's en een ontleedmicroscoop. Deze procedure is een geweldige eerste stap om te bepalen of een gen betrokken is bij een ontwikkelingsproces en kan worden gevolgd door cytologische analyses om te bepalen welk proces is verstoord.

measuring-embryonic-viability-and-brood-size-in-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Deze video beschrijft een traditionele, op platen gebaseerde methode om de levensduur van C. elegans te meten. Het voorbeeldprotocol meet de levensduur van wormen die met RNAi worden behandeld.

Levensduuranalyse: Het meten van de levensduur van C. elegans

C. elegans eierleggedrag kan belangrijke informatie bieden in ontwikkelings-, reproductieve en anatomische studies.  Deze video introduceert de belangrijke stappen van een eierlegtest en toont een monsterexperiment waarbij een medicijn wordt getest op reproductietoxiciteit.

Egg Laying Assay: Een methode om het eierleggedrag van C. elegans te kwantificeren

Hier beschrijven we protocollen die specifiek zijn ontworpen om morfogenetische defecten te monitoren die optreden tijdens de vroege en late fasen van embryonale verlenging van de rondworm Caenorhabditis elegans. Uiteindelijk zijn deze protocollen ontworpen om genen te identificeren die deze fasen reguleren en om hun differentiële vereisten langs de antero-posterior as van het embryo te karakteriseren.

Novel Metrics te karakteriseren Embryonale Verlenging van de nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Een basisprotocol te beoordelen van de giftigheid van chemische stoffen in een model dier, Caenorhabditis elegans, wordt beschreven. De methode is geschikt en nuttig is voor de ontwikkeling van geneesmiddelen, alsook wat betreft de risico-evaluatie van verschillende milieuverontreinigende stoffen.

Meten van het Effect van chemische stoffen op de groei en voortplanting van Caenorhabditis elegans

Hier beschrijven we de replicaset methode, een benadering tot kwantitatief maatregel C. elegans levensduur/overleving en de healthspan in een high-throughput en robuuste manier, waardoor screening van vele voorwaarden zonder in te boeten op kwaliteit van de gegevens. Dit protocol details van de strategie en biedt een software-instrument voor de analyse van gegevens van de replicaset.

De Replica Set, methode: Een High-throughput benadering van kwantitatief maatregel Caenorhabditis elegans levensduur

Mitochondriale ademhaling is van cruciaal belang voor de overleving van het organisch; Daarom is zuurstof verbruik tarief is een uitstekende indicator voor mitochondriale gezondheid. In dit protocol, beschrijven we het gebruik van een commercieel beschikbare respirometer voor het meten van basale en maximale zuurstof verbruik in leven, intact, en vrij-sporenvormende Caenorhabditis elegans.

Meting van zuurstof verbruik in Intact Caenorhabditis elegans

Het sperma moet met succes door de eileider navigeren om een eicel te bevruchten. Hier beschrijven we een assay voor het meten van sperma migratie binnen de C. hermafrodiet baarmoeder. Deze analyse kan kwantitatieve gegevens over sperma distributie binnen de baarmoeder na het koppelen, evenals op snelheid, richtings snelheid, en omkerings frequentie verstrekken.

Het meten van sperma begeleiding en beweeglijkheid binnen de Caenorhabditis van het hermafrodiet-reproductieve kanaal

Dit protocol is ontworpen om de levensvatbaarheid van Drosophila in elke ontwikkelingsfase, van embryo tot volwassene, te beoordelen. De methode kan worden gebruikt om de levensvatbaarheid van verschillende genotypen of groeiomstandigheden te bepalen en te vergelijken.

Een directe en eenvoudige methode om de levensvatbaarheid van Drosophila melanogasterte beoordelen van embryo tot volwassene

Dit werk beschrijft een semi-High-throughput protocol dat gelijktijdige 3D time-lapse beeldvorming van embryogenese in 80 – 100 C. elegans embryo's in een enkele nachtelijke run toestaat. Daarnaast worden tools voorbeeld verwerking en visualisatie meegeleverd om de gegevensanalyse te stroomlijnen. De combinatie van deze methoden met aangepaste reporter stammen maakt gedetailleerde controle van embryogenese.

Een semi-High-throughput imaging methode en data visualisatie Toolkit om C. elegans embryonale ontwikkeling te analyseren

Caenorhabditis elegans dienen als een uitstekend modelsysteem met robuuste en goedkope methoden voor het onderzoeken van de gezondheid, levensduur en veerkracht tegen stress.

Onderzoek naar goedkope methoden om levensduur en gezondheid te meten in Caenorhabditis elegans

Leer embryonale levensvatbaarheid en broedgrootte meten bij Caenorhabditis elegans. Deze gestandaardiseerde methode helpt beginnende onderzoekers genetische factoren in ontwikkeling te identificeren.

Het meten van de embryonale levensvatbaarheid en broedgrootte bij Caenorhabditis elegans

Meer video's verkennen