Voorbereiding van 3D gedecellulariseerde matrices van foetale muis skeletspieren voor celkweek

Voor zover wij weten, is dit protocol het eerste dat gedecellulariseerde matrices uit foetale skeletspieren produceert, wat een nieuwe benadering biedt om myopathieën te bestuderen die zich in de baarmoeder beginnen te ontwikkelen. Dit protocol genereert een ontwikkelings- en weefselspecifieke metriek die kan worden gebruikt om spiercelgedrag en interacties met extracellulaire matrix in een gecontroleerde omgeving te bestuderen. LAMA2-CMD is een aangeboren spierdystrofie die zich bij de geboorte begint te manifesteren.

Dit model kan helpen bij het ontrafelen van de patroonmechanismen die betrokken zijn bij het begin ervan en leiden tot nieuwe doeltherapieën. Dit protocol kan worden aangepast aan verschillende weefsels en ziektemodellen. Verschillende complexiteitsniveaus kunnen worden bereikt, afhankelijk van matrix- en celtypen, wat de veelzijdigheid van het systeem aantoont.

Dit is een heel eenvoudig protocol. Het meest uitdagende onderdeel is het verzamelen en verwerken van de monsters. Maar met oefening kunnen technische vaardigheden gemakkelijk worden verbeterd.

Begin met het overbrengen van één geëuthanaseerde foetus per keer naar een petrischaal met ijskoude PBS. Na het exciteren van de huid en ledematen, snijdt u door de ventrale kant van de ribbenkast. Verwijder het borstbeen en de onderliggende organen.

Plaats de foetussen dorsale zijde omhoog en verwijder het cervicale deel van de wervelkolom. Verwijder vervolgens de dorsale vetafzettingen en het bindweefsel van de diepe rugspier. Veranker nu de ribbenkast met een chirurgische tang.

Schraap met een microscalpel voorzichtig om de diepe rugspieren los te maken van het omliggende weefsel. Bewaar de weefsels in PBS in een 12-well celkweekplaat bij vier graden Celsius voor toekomstig gebruik. Bewaar het weefsel voor een langere periode in een lege microcentrifugebuis bij min 80 graden Celsius.

Gebruik op de eerste dag hele epaxiale spiermassa's. Voeg drie milliliter hypotone buffer met 1% penicilline en streptomycine toe aan elk putje van een plaat met 12 putten. Voeg een spierweefselfragment toe aan elke put en incubeer 's nachts gedurende 18 uur met agitatie.

Verwijder op de tweede dag de buffer met een pipet met fijne punt. Was de monsters nu drie keer met drie milliliter PBS met telkens een uur roeren. Na het weggooien van de PBS, incubeer de monsters in drie milliliter 0,05% SDS-reinigingsmiddeloplossing gedurende 24 uur met roeren.

Gebruik op de derde dag een fijne tippipet om het SDS-wasmiddel te verwijderen en was de fragmenten driemaal met drie milliliter hypotone wasbuffer met telkens 20 minuten roeren. Vervang de oplossing van de putjes door twee milliliter DNase-oplossing en incubeer de weefselfragmenten bij 37 graden Celsius gedurende drie uur met roeren. Na het verwijderen van de DNase-oplossing, was de fragmenten driemaal met drie milliliter PBS met een roerbeurt van 20 minuten elke keer, waarbij de laatste was een nacht achterblijft.

Voeg aan een T-25-kolf bezaaid met subconfluente C2C12-cellen 500 microliter trypsine toe en resuspensie in één milliliter volledig medium. Meng 10 microliter van de suspensie met 10 microliter trypanblauwe kleurstof en laad in een hemocytometer om het celaantal te tellen en de levensvatbaarheid te schatten. Plaats in een laminaire stromingskap de gedecellulariseerde matrices, of dECM's, in een petrischaal met PBS met 1% penicilline en streptomycine.

Scheid met behulp van een microscalpel en een pincet de matrices in kleine stukjes. Breng de fragmenten over in de putten van een plaat met 96 putten en plaats drie tot vier stukken per put. Voeg 200 microliter voorverwarmd compleet kweekmedium toe aan elke put en incubeer de plaat gedurende twee uur bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.

Gooi het medium in de putplaat weg en voeg 200 microliter compleet kweekmedium met 50.000 levensvatbare C2C12-cellen toe aan elke put. Incubeer de putplaat gedurende twee dagen. Breng de dECM's met de cellen over naar een 48-putplaat met 400 microliter volledig kweekmedium.

Zuig het medium voorzichtig om de twee dagen aan om matrixloslating te voorkomen en vul het verse medium aan tot de achtste dag. Vervang voor differentiatie het volledige kweekmedium door een differentiatiemedium en incubeer gedurende vier dagen tot de 12e dag. Het spierweefsel was direct na de isolatie roodachtig en werd wit door cellyse na incubatie in hypotone buffer.

SDS zorgt ervoor dat de spieren transparant worden. Na DNase-behandeling werd een kleinere, transparante dECM verkregen. DNA-kwantificering onthult een afname van bijna 100% in de dECM's in vergelijking met het inheemse weefsel.

De dECM's en het inheemse weefsel vertoonden vergelijkbare buisvormige kleuring voor laminine alfa twee en laminine-eiwit. Western blot-analyse van het inheemse weefsel toonde twee banden voor de laminine alfa twee subeenheid, terwijl drie kleinere banden werden gedetecteerd in de dECM. Voor totale laminines vertoonden dECM-monsters eiwitfragmentatie in vergelijking met het inheemse weefsel.

Fibronectine en collageen I waren aanwezig in de interstitiële ruimte tussen cellen van het inheemse weefsel en de dECM's. Vergelijkbare fibronectinebanden waren aanwezig in beide monsters, wat aangeeft dat het niet wordt beïnvloed door decellularisatie. Minder collageen I-banden werden waargenomen in de dECM's.

Voor collageen IV vertoonden beide monsters vergelijkbare buisvormige kleuring. Het molecuulgewicht van de dECM-banden was echter lager. C2C12-cellen gekoloniseerd en geprolifereerd in de dECM's en gefuseerd tot myotubes met meerdere kernen.

Deze brachten myosine-zwaar keteneiwit tot expressie na vier dagen incubatie in differentiatiemedium. Intracellulaire en pericellulaire kleuring werd waargenomen voor laminine alfa twee keten, totale lamininen en fibronectine. Gedecellulariseerde foetale skeletsteigers van muizen kunnen worden gebruikt om cellen in co-kweeksystemen te laten groeien, waardoor het dichter bij de in vivo situatie komt en daarom bijdraagt aan het begrijpen van spierziekte.