Name: Kwantificering van globale histon posttranslationele modificaties met behulp van intranucleaire flowcytometrie in geïsoleerde microglia in de hersenen van muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Leer hoe u globale histonmodificaties kwantificeert in geïsoleerde microglia uit muizenhersenen met intranucleaire flowcytometrie. Deze methode versnelt epigenetisch onderzoek naar hersenaandoeningen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Met dank aan Yanyang Bai voor zijn hulp bij de immunoblot in figuur 5. Dit werk werd ondersteund door de Canadian Institutes for Health Research [CRC-RS 950-232402 to AC]; Onderzoeksraad voor natuurwetenschappen en techniek van Canada [RGPIN-2019-04450, DGECR-2019-00069 naar AC]; Scottish Rite Charitable Foundation [21103 naar AC] en de Brain Canada Foundation [AWD-023132 naar AC]; Aboriginal Graduate Fellowship van de Universiteit van British Columbia (6481 tot MT); British Columbia Graduate Scholarship (6768 naar MT); Canadian Open Neuroscience Platform Student Scholar Award (10901 aan JK); Universiteit van British Columbia Vierjarige doctoraatsbeurs (6569 tot JK). De financiers hadden geen rol in de opzet van het onderzoek, het verzamelen en analyseren van gegevens, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.

Kwantificering van histonmodificatie in de hersenen van muizen met behulp van flowcytometrie

<ol><li>Miller, J. L., Grant, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+DNA+Methylation+and+Histone+Modifications+in+Transcriptional+Regulation+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%3A+Development+and+Disease%22%5BJournal%5D)">The Role of DNA Methylation and Histone Modifications in Transcriptional Regulation in Humans.</a> Epigenetics: Development and Disease. 61, 289-317 (2013).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Modifications+and+Their+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin Modifications and Their Function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li>
<li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li>
<li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li>
<li>Vogel Ciernia, A., LaSalle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+DNA+methylation+amid+a+perfect+storm+of+autism+aetiologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The landscape of DNA methylation amid a perfect storm of autism aetiologies.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 17 (7), 411-423 (2016).</li>
<li>Keiser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+HDAC3+inhibition+ameliorates+impairments+in+synaptic+plasticity+caused+by+simulated+galactic+cosmic+radiation+exposure+in+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Systemic HDAC3 inhibition ameliorates impairments in synaptic plasticity caused by simulated galactic cosmic radiation exposure in male mice.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 178, 107367(2021).</li>
<li>McQuown, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC3+is+a+critical+negative+regulator+of+long-term+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31 (2), 764-774 (2011).</li>
<li>Barrett, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+Focal+Knockout+of+CBP+Affects+Specific+Histone+Modifications%2C+Long-Term+Potentiation%2C+and+Long-Term+Memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Hippocampal Focal Knockout of CBP Affects Specific Histone Modifications, Long-Term Potentiation, and Long-Term Memory.</a> Neuropsychopharmacology. 36 (8), 1545-1556 (2011).</li>
<li>Datta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+Deacetylases+1+and+2+Regulate+Microglia+Function+during+Development%2C+Homeostasis%2C+and+Neurodegeneration+in+a+Context-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Histone Deacetylases 1 and 2 Regulate Microglia Function during Development, Homeostasis, and Neurodegeneration in a Context-Dependent Manner.</a> Immunity. 48 (3), 514.e6-529.e6 (2018).</li>
<li>Belhocine, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-dependent+transcriptional+regulation+of+microglial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Context-dependent transcriptional regulation of microglial proliferation.</a> Glia. 70 (3), 572-589 (2022).</li>
<li>Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGosselin%2C+D+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 356 (6344), eaal3222(2017).</li>
<li>Kettenmann, H., Hanisch, U. -K., Noda, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+Microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Physiology of Microglia.</a> Physiological Reviews. 91 (2), 461-553 (2011).</li>
<li>Sullivan, O., Ciernia, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Work+hard%2C+play+hard%3A+how+sexually+differentiated+microglia+work+to+shape+social+play+and+reproductive+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Work hard, play hard: how sexually differentiated microglia work to shape social play and reproductive behavior.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 16, 989011(2022).</li>
<li>Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> BioTechniques. 37 (6), 961-969 (2004).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+technique%2C+theory%2C+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22North+American+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
<li>Crowe, A., Yue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-quantitative+Determination+of+Protein+Expression+Using+Immunohistochemistry+Staining+and+Analysis%3A+An+Integrated+Protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BIO-PROTOCOL%22%5BJournal%5D)">Semi-quantitative Determination of Protein Expression Using Immunohistochemistry Staining and Analysis: An Integrated Protocol.</a> BIO-PROTOCOL. 9 (24), (2019).</li>
<li>Seligson, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+histone+modification+patterns+predict+risk+of+prostate+cancer+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global histone modification patterns predict risk of prostate cancer recurrence.</a> Nature. 435 (7046), 1262-1266 (2005).</li>
<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Histone+Modification+Patterns+as+Prognostic+Markers+to+Classify+Glioma+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiology%2C+Biomarkers+%26+Prevention%22%5BJournal%5D)">Global Histone Modification Patterns as Prognostic Markers to Classify Glioma Patients.</a> Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 19 (11), 2888-2896 (2010).</li>
<li>Pan, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+feedback+regulation+of+microglial+glucose+metabolism+by+histone+H4+lysine+12+lactylation+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Positive feedback regulation of microglial glucose metabolism by histone H4 lysine 12 lactylation in Alzheimer's disease.</a> Cell Metabolism. 34 (4), 634.e6-648.e6 (2022).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+of+gene+expression+by+histone+lactylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation.</a> Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).</li>
<li>Pösel, C., Möller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cells+from+the+Ischemic+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), 53658(2016).</li>
<li>Oblak, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Evaluation+of+the+5XFAD+Mouse+Model+for+Preclinical+Testing+Applications%3A+A+MODEL-AD+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Evaluation of the 5XFAD Mouse Model for Preclinical Testing Applications: A MODEL-AD Study.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 713726(2021).</li>
<li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), e70(2019).</li>
<li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+Conventional+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Flow+Cytometry+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiparameter Conventional Flow Cytometry.</a> Flow Cytometry Protocols. 1678, 139-150 (2018).</li>
<li>Marsh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+artifactual+and+confounding+glial+signatures+by+single-cell+sequencing+of+mouse+and+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dissection of artifactual and confounding glial signatures by single-cell sequencing of mouse and human brain.</a> Nature Neuroscience. 25 (3), 306-316 (2022).</li>
<li>Wang, L., Gaigalas, A. K., Marti, G., Abbasi, F., Hoffman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+quantitative+fluorescence+measurements+with+multicolor+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Toward quantitative fluorescence measurements with multicolor flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 73A (4), 279-288 (2008).</li>
<li>Rumbaugh, G., Miller, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+changes+in+the+brain%3A+measuring+global+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Epigenetic changes in the brain: measuring global histone modifications.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 670, 263-274 (2011).</li>
<li>Xavier, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+delineation+of+signaling+and+epigenomic+mechanisms+underlying+microglia+inflammatory+activity+in+acute+and+chronic+brain+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22BioRvix%22%5BJournal%5D)">Systematic delineation of signaling and epigenomic mechanisms underlying microglia inflammatory activity in acute and chronic brain pathologies.</a> BioRvix. , (2022).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het gepresenteerde protocol maakt kwantitatieve beoordeling van globale HPTM-niveaus mogelijk door middel van flowcytometrie. Hoewel dit protocol een nieuwe methode presenteert, hebben eerdere studies kwantitatieve beoordeling van eiwitten uitgevoerd met behulp van een vergelijkbare benadering26. Eerdere methoden die worden gebruikt om wereldwijde niveaus van HPTM's te beoordelen, zijn onder meer immunohistochemie en western blot 16,17,19,20. De gepresenteerde methode op basis van flowcytometrie is een gemakkelijk kwantificeerbare methode, terwijl western blot en immunohistochemie semi-kwantitatief zijn en een lagere doorvoer hebben. Western blot is afhankelijk van cellyse en vereist dus zowel eiwitnormalisatie als een belastingscontrole-eiwit waarvan wordt aangenomen dat het onveranderd is door de experimentele conditie27. Immunohistochemie is semikwantitatief en heeft een zeer lage doorvoer, omdat het moeilijk is om de hoeveelheid eiwit kwantitatief te beoordelen zonder op celniveau te onderzoeken16. Evenzo is er voor de geïsoleerde microglia een voordeel aan het gebruik van de flowcytometriemethode vanwege de beperkte opbrengst, aangezien western blot een veel grotere eiwitinvoer vereist19. De lage vereisten voor het aantal cellen maken het mogelijk om meerdere kleurplaten van hetzelfde dier te gebruiken.
Zoals bij elke andere methode, zijn er echter beperkingen aan deze techniek, waaronder de kosten en beschikbaarheid van antilichamen, aangezien niet alle antilichamen goed werken in een flowcytometrie-omgeving. Bovendien is de vereiste concentratie antilichaam in vergelijking met immunoblot veel hoger. Hoewel multiplexing het mogelijk maakt om meerdere antilichamen op hetzelfde cellenpaneel te gebruiken, kunnen cellen na analyse niet van het antilichaam worden ontdaan, waardoor het celgebruik wordt beperkt tot één per antilichaamsoort. Dit is anders dan immunoblot waarbij dezelfde blot herhaaldelijk kan worden gebruikt. Afhankelijk van de beschikbaarheid van antilichamen en het aantal detectiekanalen op een cytometer, zou het echter mogelijk zijn om tot een dozijn markeringen tegelijk te onderzoeken.
De huidige methode legt alleen globale niveaus van eiwitexpressie vast en niet de specifieke genomische locatie, en veranderingen in globale niveaus weerspiegelen mogelijk geen veranderingen op individuele genomische loci. Evenzo hoeft een gebrek aan verandering in de mondiale niveaus niet te betekenen dat er geen genomische loci veranderingen ondergaan, alleen dat de globale veranderingen samen geen verschillen tussen behandelingen opleveren. Als zodanig is deze techniek bedoeld om te worden gebruikt als een scherm om HPTM's te identificeren die van belang zijn voor genomische analyse. Bovendien maakt deze methode het niet mogelijk om verschillende eiwitmarkeringen te vergelijken, behalve wanneer deze wordt beoordeeld als een vouwverandering ter controle. Daarom is dit beperkt in vergelijking met een standaard curve-gebaseerde methode zoals ELISA voor eiwitbepaling.
Het gepresenteerde protocol biedt een strategie voor het isoleren van levende microglia in de hersenen. Dit protocol is gebaseerd op P2RY12-eiwitexpressie voor microglia-isolatie. P2RY12 is echter een homeostatische marker in microglia en kan worden gedownreguleerd in ziektemodellen, zoals 5XFAD22. Zorg er daarom voor dat u bij het gebruik van een ziektemodeldier andere markereiwitten kiest, zoals TMEM119, CD11b of CD45 om te helpen bij het isoleren van microglia23. Op dezelfde manier presenteren we dit protocol als isolatie van de hippocampus en/of de cortex. Dit protocol zou werken om microglia te isoleren van andere hersengebieden, waaronder witte stofgebieden, maar er kunnen meerdere dieren nodig zijn om voldoende microglia te verkrijgen, afhankelijk van de grootte van de interessegebieden.
Het gepresenteerde protocol kan levende microglia in de hersenen robuust isoleren, maar er zijn verschillende stappen, hieronder beschreven, in de isolatiefase die de celopbrengst kunnen verminderen als ze verkeerd worden uitgevoerd.
Perfusies voor dit protocol resulteren in een hoger percentage microglia in het immuunverrijkte fragment, wat de hoeveelheid tijd in de sorteerder zal verminderen. Perfusie is echter niet vereist en indien nodig kunnen andere euthanasiemethoden worden gebruikt.
Tijdens de isolatie van microglia moet myeline volledig worden verwijderd. Flowcytometers vertrouwen erop dat cellen in een snel tempo door smalle buizen kunnen reizen. Vanwege de viscositeit en de neiging om te klonteren, veroorzaakt myeline problemen met cytometers, waardoor vaak verstoppingen ontstaan die zowel de apparatuur kunnen beschadigen als het monster kunnen vernietigen, waardoor de opbrengst drastisch wordt verminderd. Wees voorzichtig met het verwijderen van alle myeline tijdens het verzamelen van immuunverrijkte fragmenten om stroomafwaarts problemen te voorkomen.
Plaatkleuring versus buiskleuring: In dit protocol hebben we twee opties beschreven voor het kleuren van cellen in buisjes van 1,5 ml of een plaat met 96 putjes. De use case voor elk hangt af van het experiment; Over het algemeen is buiskleuring echter een lager risico op het beïnvloeden van de opbrengst dan plaatkleuring, omdat de flick het risico loopt cellen te verliezen als het verkeerd wordt gedaan. Het kleuren van platen gaat veel sneller omdat het opzuigen van het supernatans voor elke buis tijdrovend is. Gebruik voorafgaand aan het fixeren (voor sorteren, enz.) buiskleuring om de opbrengst te maximaliseren en het risico op verlies te verminderen. Voor HPTM-analyse is de pellet echter stabieler als de cellen eenmaal zijn gefixeerd voor intranucleaire kleuring en is er minder risico op verlies bij flikkeren.
Vaststellen van de discontinue dichtheidsgradiënt: Bij het vaststellen van de gelaagdheid is het goed instellen van de lagen essentieel om de immuunverrijkte fractie te verkrijgen. Als de lagen verstoord of gemengd zijn en er troebel uitzien, zullen de cellen niet sorteren op de gewenste locatie en zal het moeilijk zijn om de immuunverrijkte celfractie te verkrijgen. Als dit gebeurt, draai dan met het dichtheidsmedium om myeline te verwijderen en verzamel vervolgens de volledige resterende fracties, verdun met 3 ml FACS-buffer tot 1 ml dichtheidsmedium en meng goed (hiervoor zijn meerdere buisjes nodig). Centrifugeer gedurende 10 minuten op 500 x g met de rem op 0. Gooi de supernatant weg en laat slechts ~300 μL oplossing over. Verzamel het volledige monster en beits. Dit levert lagere sorteerpercentages op en een hogere hoeveelheid tijd die aan de cytometer wordt doorgebracht, maar de opbrengst kan nog steeds vergelijkbaar zijn.
Bij gebruik van de isolatiemethode is het gunstig om cellen voor RNA en voor HPTM-evaluatie uit hetzelfde muizenbrein te kunnen verzamelen. In deze situatie kunnen cellen na het sorteren van de levende microglia worden gedeeld om een deel toe te wijzen aan RNA-evaluatie (minimaal aantal cellen om een fatsoenlijke RNA-opbrengst te verkrijgen is 75.000 cellen) en een deel voor verdere flowcytometrie-analyse (minimaal 10.000 cellen per putje voor een goede bepaling van MFI). In dit geval is het sorteren van de flowcytometer vereist. Wanneer u echter alleen van plan bent de cellen te gebruiken voor HPTM-analyse, is sorteren niet nodig en kan de immuunfractie worden gekleurd met het P2RY12-antilichaam en HPTM-antilichaam. Gating op de cytometer kan dan worden ingesteld voor P2RY12+ microglia, zoals zou worden gedaan voor flowsorting, om alleen het HPTM-signaal binnen microglia te analyseren. Door het elimineren van de sortering kan het protocol sneller en kosteneffectiever zijn. Bovendien is het bij de evaluatie van HPTM's uit gekweekte cellen voldoende om te beginnen bij het kleuringsprotocol en zijn er geen celmarkerantilichamen nodig, zoals aangetoond in figuur 6. Het HPTM-evaluatieprotocol kan worden gebruikt voor veel celtypen, waaronder gekweekte, primaire en IPSC-afgeleide cellen.
Ten slotte, hoewel we slechts twee mogelijke toepassingen van microglia stroomafwaarts van isolatie hebben gepresenteerd, zijn er nog vele andere, waaronder epigenetische technieken zoals ChIP, CUT&Tag en CUT&RUN. In het geval van genomische epigenetische technieken, waarbij het karakteriseren van veranderingen op specifieke loci van belang is, kies dan specifieke remmers voor schrijvers en gummen van chromatinemarkeringen11 die zijn afgestemd op de experimenten om ervoor te zorgen dat eventuele geprofileerde microgliale epigenetische modificaties geen technische artefacten zijn van stappen in de isolatieprocedure, zoals enzymatische spijsvertering. Bij het beoordelen van veranderingen in globale niveaus van epigenetische markeringen, zoals door gebruik te maken van kwantitatieve flowcytometrie, wordt niet verwacht dat eventuele door de procedure geïnduceerde veranderingen zo groot zijn dat ze op mondiaal niveau worden gedetecteerd.
Over het algemeen bieden de besproken methoden een nieuwe, eencellige methode voor het kwantificeren van globale niveaus van histonmodificaties en andere epigenetische veranderingen door middel van flowcytometrie. We toonden aan dat deze methode voldoende gevoelig is om globale veranderingen in de enhancer-marker H3K27ac in microglia te detecteren als reactie op LPS in vivo. Dit komt overeen met eerdere ChIP-sequencing van H3K27ac na LPS-stimulatie die een dramatische remodellering laat zien van enhancers die reageren op LPS28. Toepassingen van deze methode zullen het mogelijk maken om globale epigenetische veranderingen in verschillende hersenceltypen in ontwikkeling en ziekte te onderzoeken.

Epigenetica is de studie van de mechanismen die genexpressie reguleren zonder de onderliggende DNA-sequentie te veranderen. Epigenetische regulatie van genexpressie is dynamisch binnen cellen en kan snelle en gecoördineerde reacties op verschillende omgevingsstimuli mogelijk maken. De dynamische regulatie vindt gedeeltelijk plaats als gevolg van veranderingen in de chromatinestructuur op het niveau van het nucleosoom, dat bestaat uit histon-eiwitten (H2A, H2B, H3, H4) die zijn samengevoegd tot een octameerkern die strak is gewikkeld door DNA1. De interacties tussen de histon-eiwitten en het DNA kunnen de toegankelijkheid van DNA tot transcriptiemachines regelen, wat uiteindelijk de genexpressie en andere aspecten van de chromatinebiologie kan beheersen. Histon-eiwitten hebben ongestructureerde staarten met positief geladen residuen die elektrostatische interacties vormen met de negatief geladen DNA-ruggengraat. Deze interacties resulteren in een strakke opeenhoping van het DNA en verminderde toegankelijkheid van het DNA. Covalente modificaties aan de histonstaarten, histonposttranslationele modificaties (HPTM's) genoemd, kunnen deze interacties reguleren 3,4. Enkele van de meest goed gekarakteriseerde HPTM's zijn histonstaartacetylering en methylering, die de affiniteit van elektrostatische interacties tussen de histonstaarten en DNA kunnen veranderen, wat resulteert in differentiële toegankelijkheid van het onderliggende DNA en rekrutering van transcriptiefactoren die deze HPTM's op specifieke plaatsen herkennen. HPTM's worden gereguleerd door drie belangrijke klassen enzymen, lezers genaamd, die herkennen, schrijvers die deponeren en gummen, die HPTM's verwijderen. Zo kan de rekrutering of ontbinding van lezer-, schrijvers- of gumenzymen uiteindelijk het landschap van HPTM's veranderen en de structuur en functie van chromatine regelen, waardoor hun regulatie en uitlezing essentieel zijn voor het begrijpen van cellulaire biologie en functie 3,4.
De cellen in het centrale zenuwstelsel (CZS) zijn epigenetisch flexibel omdat ze hun transcriptoom veranderen om zich aan te passen aan omgevingsstimuli. Steeds meer bewijs suggereert dat veranderingen in het epigenoom, zoals DNA-methylering, niet-coderende RNA's en HPTM's, een essentiële rol spelen bij geheugenvorming en synaptischefunctie. Het verstoren van de HPTM-dynamiek door manipulatie van de relevante lezers, schrijvers of gummen kan associatief leren en potentiëring op lange termijn blokkeren of verbeteren 6,7,8. Microglia, de residente immuuncel van het CZS, reguleren snel hun transcriptoom als reactie op immuunstimulatie door dynamische veranderingen in hun epigenoom 9,10,11. Deze hoge mate van aanpassing aan hun lokale hersenomgeving maakt ze moeilijk te onderzoeken in een geïsoleerde context, aangezien studies hebben aangetoond dat het epigenoom en transcriptoom van microglia al na een paar uur in kweekmedia veranderen na verwijdering uit de hersenomgeving11. Bovendien, aangezien microglia slechts 10% van de hersencellen uitmaken, missen metingen die veranderingen op het niveau van het hele weefsel onderzoeken gevoeligheid en specificiteit 12,13. Als gevolg hiervan moeten microglia snel worden geïsoleerd om de epigenetische veranderingen zoals HPTM-niveaus ex vivo te onderzoeken.
De methoden die vaak worden gebruikt om HPTM's te onderzoeken, zijn onder meer chromatine-immunoprecipitatiesequencing (ChIP-seq) en splitsing onder doelen en tagmentatiesequencing (CUT&Tag-seq)4. Hoewel deze technieken zeer specifiek zijn voor een individuele HPTM en de aanwezigheid van HPTM's binnen een specifieke genomische context kunnen informeren, kunnen ze slechts één van de vele mogelijke HPTM's binnen een enkel experiment onderzoeken11,14 Daarom is het, alvorens verder te gaan met dergelijke experimenten, die een aanzienlijke investering in tijd en geld vergen, zeer waardevol om de lijst met potentieel interessante HPTM's voor verder onderzoek te verfijnen door eerst veranderingen in de wereldwijde wereld te onderzoeken niveaus van HPTM's. De twee belangrijkste benaderingen voor het onderzoeken van globale HPTM-niveaus zijn immunohistochemie en western blot-analyse, maar beide benaderingen zijn slechts semi-kwantitatief, hebben een lage doorvoer en vereisen grote aantallen weefselsecties of geïsoleerde cellen15,16. Daarom wilden we een zeer gevoelige, kwantitatieve methode ontwikkelen die kan worden gebruikt om de globale HPTM-niveaus snel en op celniveau te onderzoeken.
Het gepresenteerde protocol maakt het mogelijk om globale HPTM-niveaus snel te detecteren met behulp van intranucleaire flowcytometrie. Eerdere studies in kankercellen hebben het belang gerechtvaardigd van het onderzoeken van wereldwijde niveaus vanuit een klinisch perspectief17,18. Het is ook gebruikelijk dat studies wereldwijde niveaus gebruiken als screeningsmethode voordat de genomische locatie van specifieke HPTM's van belang wordt beoordeeld19,20. Voor microglia is het beoordelen van globale niveaus na isolatie een uitdaging vanwege de lage celopbrengst; Pan et al. presenteren globale HPTM-niveaus van geïsoleerde microglia, waarin microglia van drie dieren werden samengevoegd om detectie van eiwitniveaus door western blot19 mogelijk te maken. Met behulp van ons protocol zijn we in staat om globale veranderingen te detecteren met veel lagere celinputs, waardoor meerdere markeringen per dier kunnen worden gescreend en het niet meer nodig is om monsters samen te voegen.
Hier beschrijven we een protocol om HPTM-niveaus snel te detecteren via kwantitatieve intranucleaire flowcytometrie in geïsoleerde microglia. Hoewel we ons kortheidshalve specifiek richten op HPTM-kwantificering, kan dit protocol op dezelfde manier worden gebruikt om wereldwijde niveaus van lezer-, schrijvers- en gumenzymen te kwantificeren. Het protocol bestaat uit twee delen: ten eerste de isolatiemethode voor microglia en ten tweede de op flowcytometrie gebaseerde methode voor het bepalen van HPTM-niveaus. De isolatiemethode levert cellen op die kunnen worden gebruikt voor zowel RNA-isolatie als HPTM-niveaubeoordeling, waardoor genexpressie en HPTM-niveaus van hetzelfde monster kunnen worden geëvalueerd. Bovendien kan de methode voor HPTM-beoordeling worden gebruikt op andere celtypen zoals aangegeven in het protocol.

<table><tbody><tr><td>0.5M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>24-well Clear Not Treated Plates</td><td>Costar</td><td>3738</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Clear Polystyrene Microplate, clear round bottom, non treated surface</td><td>Corning</td><td>3788</td><td></td></tr><tr><td>Acetyl Histone 3 K9 (C5B11)</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>9649S</td><td>Dilution: 1:100</td></tr><tr><td>Acetyl Histone H4 K8 (2594)</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>2594S</td><td>Dilution: 1:100</td></tr><tr><td>Acetyl-Histone H3 K27 (D5E4)</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>8173S</td><td>Dilution: 1:100</td></tr><tr><td>Acetyl-Histone H3 Lys27 (MA523516)</td><td>Invitrogen</td><td>MA523516</td><td>Dilution: 1:100</td></tr><tr><td>Actinomycin D</td><td>New England Biolabs</td><td>15021S</td><td></td></tr><tr><td>Anisomycin</td><td>New England Biolabs</td><td>2222S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Histone H3 (tri methyl K4)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab213224</td><td>Dilution: 1:100</td></tr><tr><td>Anti-Lactyl-Histone H4 (Lys 12) Rabbit mAb</td><td>PTM Biolabs</td><td>PTM-1411RM</td><td>Dilution: 1:250</td></tr><tr><td>Anti-L-Lactyllysine Rabbit pAb</td><td>PRM Biolabs</td><td>PTM-1401RM</td><td>Dilution: 1:250</td></tr><tr><td>Apc anti-P2RY12 Antibody, Clone: S16007D</td><td>BioLegend</td><td>848006</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Tocris</td><td>5217</td><td></td></tr><tr><td>Cyto-Last Buffer</td><td>BioLegend</td><td>422501</td><td></td></tr><tr><td>dimethylsulfoxide, sterile</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>12611S</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07900</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti Mouse AlexaFluor488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-546-150</td><td>Dilution: 1:500</td></tr><tr><td>Donkey Anti Rabbit AlexaFluor488</td><td>ABclonal</td><td>AS035</td><td>Dilution: 1:500</td></tr><tr><td>Donkey Anti Rabbit AlexaFluor568</td><td>Invitrogen</td><td>A10042</td><td>Dilution: 1:500</td></tr><tr><td>Donkey Anti Rabbit Brilliant Violet 421</td><td>BioLegend</td><td>406410</td><td>Dilution: 1:500</td></tr><tr><td>Fisherbrand Disposable Graduated Transfer Pipettes</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Disposable PES Filter Unit, 250mL&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>FB12566502</td><td></td></tr><tr><td>H3K18ac Polyclonal Antibody</td><td>Invitrogen</td><td>720095</td><td>Dilution: 1:100</td></tr><tr><td>HBSS (10X), no calcium, no magnesium, no phenol red</td><td>Gibco</td><td>14185052</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td><td>Gibco</td><td>14175103</td><td></td></tr><tr><td>Histone 3 Trimethyl K27 (ab6002)</td><td>Abcam</td><td>ab6002</td><td>Dilution: 1:100</td></tr><tr><td>KONTES Dounce Tissue Grinders 125mm 7mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>885300-0007</td><td></td></tr><tr><td>Lactyl-Histone H3 (Lys 18) Rabbit mAb</td><td>PTM BIolabs</td><td>PTM-1406RM</td><td>Dilution: 1:250</td></tr><tr><td>Lipopolysacharide&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5418</td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads Compensation Beads</td><td>Invitrogen</td><td>01-1111-41</td><td></td></tr><tr><td>PDS Kit, Papain Vial - Worthington Biochemical</td><td>Cedarlane</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>VWR</td><td>RC57004</td><td></td></tr><tr><td>QIAshredder</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>79656</td><td></td></tr><tr><td>Rainbow Fluorescent Particles, 1 peak (3.0-3.4 uM - Mid Range Intensity</td><td>BioLegend</td><td>422905</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL</td><td>Invitrogen</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Plus Micro Kit</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>Round Bottom Polypropylene Tubes with Caps, 5 mL</td><td>Corning</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Triptolide</td><td>New England Biolabs</td><td>97539</td><td></td></tr><tr><td>True Nuclear Transcription Factor Buffer Set</td><td>BioLegend</td><td>424401</td><td></td></tr><tr><td>TruStain FcX PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody</td><td>BioLegend</td><td>156604</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>VWR</td><td>97063-702</td><td></td></tr><tr><td>Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td><td>BioLegend</td><td>423102</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantificering van globale histon posttranslationele modificaties met behulp van intranucleaire flowcytometrie in geïsoleerde microglia in de hersenen van muizen

Quantification of Global Histone Post Translational Modifications Using Intranuclear Flow Cytometry in Isolated Mouse Brain Microglia

Controle van genexpressie vindt gedeeltelijk plaats door modificaties in de chromatinestructuur, waaronder het toevoegen en verwijderen van posttranslationele modificaties aan histonstaarten. Histon posttranslationele modificaties (HPTM's) kunnen genexpressie of onderdrukking vergemakkelijken. Acetylering van histonstaartlysineresiduen neutraliseert bijvoorbeeld de positieve lading en vermindert interacties tussen de staart en negatief geladen DNA. De afname van histon-staart-DNA-interacties resulteert in een verhoogde toegankelijkheid van het onderliggende DNA, waardoor een betere toegang tot transcriptiefactoren mogelijk is. Het acetyleringsmerk dient ook als herkenningsplaats voor broomdomein-bevattende transcriptionele activatoren, wat samen resulteert in verbeterde genexpressie. Histon-markeringen kunnen dynamisch worden gereguleerd tijdens celdifferentiatie en als reactie op verschillende cellulaire omgevingen en stimuli. Hoewel sequencing-benaderingen van de volgende generatie zijn begonnen met het karakteriseren van genomische locaties voor individuele histonmodificaties, kan slechts één modificatie tegelijkertijd worden onderzocht. Gezien het feit dat er honderden verschillende HPTM's zijn, hebben we een kwantitatieve meting met hoge doorvoer van wereldwijde HPTM's ontwikkeld die kan worden gebruikt om histonmodificaties te screenen voordat uitgebreidere genoomsequencingbenaderingen worden uitgevoerd. Dit protocol beschrijft een op flowcytometrie gebaseerde methode om globale HPTM's te detecteren en kan worden uitgevoerd met behulp van cellen in kweek of geïsoleerde cellen uit in vivo weefsels. We presenteren voorbeeldgegevens van geïsoleerde microglia in de hersenen van muizen om de gevoeligheid van de test aan te tonen om globale verschuivingen in HPTM's te detecteren als reactie op een van bacteriën afgeleide immuunstimulus (lipopolysaccharide). Dit protocol maakt de snelle en kwantitatieve beoordeling van HPTM's mogelijk en kan worden toegepast op elke transcriptionele of epigenetische regulator die door een antilichaam kan worden gedetecteerd.

Volwassen muizen werden transcardiaal geperfundeerd en opgeofferd voor microglia-isolatie. Microglia werden geïsoleerd op ijs en gekleurd met P2RY12-APC en violet 525 levende dode antilichamen. Cellen waarvan werd vastgesteld dat ze positief waren voor P2RY12 en negatief voor violet 525 levende dode kleuring, werden gesorteerd als levende microglia. De gemiddelde opbrengst van microglia uit een ontlede muizenhersenen was 1,28 x 105 ± 0,05 (gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM), N=100). Er is geen verschil in de opbrengst van microglia van vrouwelijke (1,25 x 105 ± 0,09 [gemiddelde ± SEM, N=46]) en mannelijke (1,32 x 105 ± 0,07 [gemiddelde ± SEM, N=54]) muizen (t(98)=0,6365, p=0,526). Bij isolatie uit specifieke hersengebieden is de gemiddelde opbrengst van microglia uit muizencortex 8,3 x 104 ± 0,08 (gemiddelde ± SEM, N=15) en uit de hippocampus van muizen 4,1 x 104 ± 0,02 (gemiddelde ± SEM, N=16). Zoals verwacht is er een significant verschil in de opbrengst van microglia uit elk hersengebied (F(2, 128)=25,25, P<0,0001). Na microglia-isolatie werd RNA geëxtraheerd uit de geïsoleerde cellen met behulp van een low-input RNA-isolatiekit. Consequent was de RNA-integriteitsscore (RIN) hoger dan 9,0 (9,62 ± 0,05) en de gemiddelde opbrengst van RNA per cel was 0,25 ± 0,01 pg (gemiddelde ± SEM, N=32; Aanvullend bestand S2).
Volwassen muizen werden 24 uur voorafgaand aan het offeren intraperitoneaal geïnjecteerd met 1 mg/kg lipopolysaccharide (LPS). De muizen werden transcardieel geperfundeerd met HBSS en microglia geïsoleerd uit de hele hersenen volgens het beschreven protocol (Figuur 5A). Voor elke kleuring werden 20.000-30.000 cellen toegewezen aan elk panel van antilichamen. De globale niveaus van histon-3-lysine-27-acetylering (H3K27Ac) werden beoordeeld in geïsoleerde microglia via flowcytometrie. Voor mannelijke en vrouwelijke muizen induceerde LPS-behandeling een toename van H3K27Ac wanneer de MFI binnen het geslacht is genormaliseerd (t(6)=9.676, p<0.0001; Figuur 5B). Bij het onderzoeken van de histogrammen voor de gekleurde cellen, blijven de populaties normaal verdeeld met een vergelijkbare variatie; de cellen zijn echter verschoven naar verhoogde fluorescentie, wat resulteert in een toename van de MFI (figuur 5C). Bij onderzoek naar H3K9Ac in dezelfde behandeling is er een vergelijkbare toename van H3K9Ac (t(6)=7,299, p=0,0003; Figuur 5D,E) de vouwverandering van LPS ten opzichte van PBS van het H3K9Ac-signaal is echter kleiner dan het H3K27Ac-signaal.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65080/65080fig05.jpg"> Figuur 5: Globale veranderingen in histonacetylering in geïsoleerde microglia. (A) Muizen worden 24 uur voorafgaand aan het offeren intraperitoneaal geïnjecteerd met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of 1 mg/kg lipopolysaccharide (LPS). De microglia worden verzameld uit de immuunverrijkte fractie en gefixeerd voor flowcytometrie en globale histon na translationele modificatiebeoordeling. De mediane fluorescerende intensiteit wordt beoordeeld als een proxy voor eiwitexpressie. Gemaakt met BioRender.com. (B) Wereldwijde niveaus van H3K27Ac namen toe als reactie op LPS-behandeling. Vouw verandering naar PBS genormaliseerd binnen experiment en geslacht. Ongepaarde tweezijdige t-toets, t(6)=9.676, p<0.0001. Staafdiagram toont het gemiddelde ± SEM. N=8 dieren; 2 per aandoening in 2 onafhankelijke experimenten. (C) Voorbeeld van histogrammen die de verschuiving van de H3K27Ac fluorescerende intensiteit weergeven. Modal toont histogrammen van PBS-geïnjecteerde versus LPS-geïnjecteerde muizen. (D) Voorbeeld van histogrammen die de verschuiving van de H3K9Ac fluorescerende intensiteit weergeven. Modal toont histogrammen van PBS-geïnjecteerde versus LPS-geïnjecteerde muizen. (E) Wereldwijde niveaus van H3K9Ac stegen als reactie op LPS-behandeling. Vouw verandering naar PBS genormaliseerd binnen experiment en geslacht. Ongepaarde tweezijdige t-toets, t(6)=7.299, p=0.0003. Staafdiagram toont het gemiddelde ± SEM. N=8 dieren; 2 per aandoening in 2 onafhankelijke experimenten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/65080fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Om te bevestigen dat de beschreven methode vergelijkbaar was met andere eerder gebruikte methoden voor de kwantificering van globale histonmodificatie, wilden we immunoblot gebruiken als een vergelijkend hulpmiddel. De opbrengst van de geïsoleerde microglia is echter simpelweg te laag om een redelijke beoordeling mogelijk te maken. Daarom gebruikten we gekweekte BV2-cellen om de intracellulaire flowcytometriemethode te vergelijken met een Western blot (WB). BV2-cellen werden gekweekt in volledige media (DMEMF12, 10% FBS, 1x penicilline/streptamycine en 1x L-glutamine) bij 37 °C, 5% CO2. Cellen werden gepasseerd met 0,25% trypsine-EDTA en geplateerd met een dichtheid van 250.000 cellen/putje en behandeld in gereduceerde serummedia (DMEM F12, 2% FBS, 1x penicilline/streptamycine en 1x L-glutamine) en gedurende 12 uur laten herstellen bij 37 °C, 5% CO2. Cellen werden behandeld met 25 ng/ml LPS gedurende 24 uur voorafgaand aan fixatie zoals hierboven beschreven of lysis met een WB-lysisbuffer. Het signaal van H3K27Ac werd met beide methoden uitgevoerd, waarbij GAPDH werd gebruikt als belastingscontrole voor WB. Voor elke groep werd een analyse van de genormaliseerde fluorescentie-intensiteit in vergelijking met de PBS-controle bepaald (figuur 6A). Bij het onderzoeken van de verandering in het genormaliseerde H3K27Ac-signaal door WB, was er een 1.527-voudige toename van de met LPS behandelde aandoening ten opzichte van de H2O-controle, waarvan werd vastgesteld dat deze significant was door de ongepaarde t-test (t = 3.024, df = 5; p = 0.0293). Bij onderzoek van de verandering met behulp van flowcytometrie was er een 1,482-voudige toename van de met LPS behandelde aandoening die significant werd geacht (t=7,843, df=10; p<0,0001). Met behulp van een 2-weg ANOVA om de methoden te vergelijken, werd vastgesteld dat er een significant effect was van de behandeling (F(1,15)=45,21,p<0,0001), maar niet van de methode (F(1,15)=0,05545, p=0,8697) of interactie (F(1,15)=0,02785, p=0,8697). Bovendien verifiëren we hier dat er geen verandering is in histon H3-spiegels door zowel Western blot als flowcytometrie, aangezien 2-weg ANOVA geen significant effect aantoonde van de LPS-behandeling (F(1,7)=0,02170,p=0,8870), de methode (F(1,7)=0,01191, p=0,9162) of de interactie (F(1,7=0,01191, p=0,9162; Figuur 6B). Voorbeeldvlekken en histogramverschuivingen voor deze gegevens worden ook getoond (Figuur 6C,D).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65080/65080fig06.jpg"> Figuur 6: Methodevergelijking voor kwantificering van de globale histonmodificatieverandering tussen flowcytometrie en western blot. (A) BV2-cellen worden behandeld met 25 ng/ml lipopolysaccharide (LPS) of H2O gedurende 24 uur voorafgaand aan de analyse. De fluorescerende intensiteit van H3K27Ac wordt weergegeven als vouwverandering in de voertuigregeling, fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), voor zowel flowcytometrie als western blot. 2-weg ANOVA toonde een significant effect van de LPS-behandeling (F(1,15)=45,21, p<0,0001), maar niet van de methode (F(1,15)=0,05545, p=0,8697) of interactie (F(1,15)=0,02785, p=0,8697). Tukey's correctie voor het testen van meerdere hypothesen werd toegepast voor de residuen. * presenteert 0,0332, ** presenteert 0,0021. (B) De fluorescerende intensiteit voor histon H3 wordt weergegeven als vouwverandering naar PBS voor zowel flowcytometrie als western blot. 2-weg ANOVA toonde geen significant effect van de LPS-behandeling (F(1,7)=0,02170, p=0,8870) of de methode (F(1,7)=0,01191, p=0,9162) of de interactie (F(1,7=0,01191, p=0,9162). (C) Voorbeeldvlekken en (D) flowcytometrieverschuivingen worden afgebeeld. De histogramgrootte wordt genormaliseerd naar procenten op basis van het aantal cellen dat aanwezig is in de modus fluorescerende intensiteit. Staafdiagram toont de gemiddelde SEM. n=2 onafhankelijke experimenten, 2 per conditie per experiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/65080fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Alles bij elkaar laten deze resultaten zien dat deze techniek kan worden gebruikt om de globale HPTM-niveaus in geïsoleerde microglia kwantitatief te beoordelen. Bovendien bleek de methode vergelijkbaar te zijn met eerdere technieken, maar met veel lagere celinputs. Bovendien kan de huidige techniek, hoewel niet aangetoond, met de juiste compensatie worden gebruikt met meerdere antilichamen in hetzelfde panel dat verschillende HPTM's beoordeelt.
Aanvullend bestand S1: Voorbeeld analysebestanden. Dit bestand bevat een wsp-analysebestand en 7 fcs-bestanden, waaronder de niet-kleuring, P2RY12FMO, 568FMO, twee PBS-behandelde dieren en twee LPS-behandelde dieren gekleurd met H3K27Ac. Het doel van dit bestand is om de analyse en gating van een experiment te demonstreren dat zou kunnen weergeven hoe een succesvol experiment eruit zag. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/SupplementalS1.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand S2: Isolatiegegevens. Het bijgevoegde bestand bevat de relevante gegevens na microglia-sortering die de microglia- en RNA-opbrengst van het beschreven protocol bevat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/SupplementalFileS2.xlsx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>OMHEINDE BEVOLKING</td>
			<td>Frequentie van ouder</td>
			<td>Frequentie van de totale</td>
			<td>Tellen</td>
		</tr><tr><td>S1</td>
			<td>89.00%</td>
			<td>89.00%</td>
			<td>25672</td>
		</tr><tr><td>S2>S1</td>
			<td>88.73%</td>
			<td>78.97%</td>
			<td>22779</td>
		</tr><tr><td>APC+ > S2 > S1</td>
			<td>76.61%</td>
			<td>60.50%</td>
			<td>17452</td>
		</tr><tr><td>610+ > APC+ > S2 > S1</td>
			<td>99.56%</td>
			<td>60.24%</td>
			<td>17376</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 2: Een voorbeeld van een voorbeeldafstammingsdiagram toont het percentage en de gebeurtenisnummers die nodig zijn voor nauwkeurige eiwitdetectie.

Dit werk beschrijft een protocol voor de kwantificering van globale histonmodificaties met behulp van intranucleaire flowcytometrie in geïsoleerde hersenmicroglia. Het werk bevat ook het microglia-isolatieprotocol dat werd gebruikt voor het verzamelen van gegevens.

Kwantificering van globale histon posttranslationele modificaties met behulp van intranucleaire flowcytometrie in geïsoleerde microglia in de hersenen van muizen

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to ...

Ons onderzoek is gericht op het begrijpen van de fundamentele regulerende mechanismen die genexpressie in de hersenen regelen, en we zijn vooral geïnteresseerd in het begrijpen hoe verstoring van deze mechanismen bijdraagt aan neurologische ontwikkelings- en neuropsychiatrische aandoeningen. We richten ons op het begrijpen hoe genetische en omgevingsrisicofactoren gecombineerd worden om de cellulaire functie te veranderen en gedragsstoornissen te veroorzaken. Dit protocol omvat methoden voor high-throughput screening van histonmodificaties in geïsoleerde microglia, waardoor we tientallen verschillende epigenetische modificaties kunnen screenen voordat we ons committeren aan high-throughput sequencing en functionele follow-upstudies.Ons protocol biedt metingen van globale histo-modificaties die vergelijkbaar zijn met westerse plot. Onze techniek is echter zowel sneller, vereist minder invoercellen, is kwantitatiefer en kan worden gemultiplext.

quantification-global-histone-post-translational-modifications-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit protocol beschrijft een methode voor het cultiveren van primaire hippocampale neuronen uit embryonale muishersenen. De expressie van grote histocompatibiliteitscomplex klasse I op het extracellulaire oppervlak van gekweekte neuronen wordt vervolgens beoordeeld door flowcytometrische analyse.

Beoordeling van de expressie van major histocompatibiliteit complex klasse I op primaire murine hippocampale neuronen door flow cytometrie

Hier presenteren we twee protocollen om microgliale inslokking van vGLUT1-positieve synapsen en pHRodo Red-gelabelde ruwe synaptosomen te kwantificeren met behulp van flowcytometrie.

Kwantificering van microgliale inslokking van synaptisch materiaal met behulp van flowcytometrie

Dit protocol combineert flowcytometrie en eencellige RNA-sequencing om microgliale celtoestanden in het cerebellum van vroege postnatale muizenhersenen te isoleren en te karakteriseren. Het maakt gebruik van enzymatische dissociatie, Percoll-centrifugatie en immunokleuring om de heterogeniteit van microglia's te onthullen en het begrip van hun rol in de ontwikkeling en ziekte van cerebellaire patiënten te verbeteren.

Flowcytometrie en eencellige analyse voor het karakteriseren van microglia-activering bij vroege postnatale hersenontwikkeling bij muizen

Flowcytometrie is een krachtig instrument waarmee specifieke celpopulaties kunnen worden geïsoleerd en bestudeerd. Dit protocol beschrijft de stappen voor het isoleren van LacZ-expresserende cellen uit cochleaire weefsels van neonatale transgene muizen. Gedissocieerde cochleaire cellen werden gelabeld met fluorescentie-geconjugeerde substraten van β-galactosidase voorafgaand aan de scheiding via flowcytometrie.

Isoleren van LacZ-expressie Cellen van Mouse Inner Ear weefsels met behulp van flowcytometrie

Hier demonstreren we een techniek voor wijdverspreide neuronale transductie door intraventriculaire injectie van adeno-geassocieerd virus in de neonatale muisbrein. Deze methode biedt een snelle en eenvoudige manier om levenslange expressie van vireel aangeboden transgenen te bereiken.

Intracerebroventriculaire Viral Injectie van de Neonatale Mouse Brain voor persistent en wijdverbreide Neuronale Transduction

We beschrijven een protocol dat de zuivering van het vasculaire compartiment van de muizenhersenen mogelijk maakt. Geïsoleerde hersenvaten omvatten endotheelcellen die zijn verbonden door strakke verbindingen en omringd door een continue basale lamina, pericyten, vasculaire gladde spiercellen, evenals perivasculaire astrogliale membranen.

Zuivering van Mouse Brain Schepen

Het onderzoek naar membraanhandel is cruciaal voor het begrijpen van neuronale functies. Hier introduceren we een methode voor het kwantificeren van vesikelmotiliteit in neuronen. Dit is een handige methode die kan worden aangepast aan de kwantificering van membraanhandel in het zenuwstelsel.

Kwantificering van Endosome en Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Kwantitatieve analyse van de inhoud van de cel binnen de nervus ischiadicus lymfkliertest is moeilijk te wijten aan de schaarste van het weefsel. Dit protocol beschrijft een methode voor de vertering van het weefsel en voorbereiding waarmee voldoende cellen voor stroom cytometry analyse van individuele muizen immuun cel populaties van zenuwen.

Analyse van immuuncellen in één ischiadicus zenuwen en achterwortelganglia Ganglion uit een enkele muis met behulp van Stroom Cytometry

We presenteren een protocol om te isoleren van neuronen, macrofagen en microglia van larvale zebrafish hersenen onder fysiologische en pathologische omstandigheden. Op isolatie, wordt RNA gewonnen uit deze cellen te analyseren hun genexpressie profiel. Dit protocol voorziet voor de verzameling van kwalitatief hoogwaardige RNA downstream analyse zoals qPCR en transcriptomics uitvoeren.

Isolatie en RNA extractie van neuronen, macrofagen en Microglia van larvale Zebrafish hersenen

Het doel van dit artikel is om een uitgebreide, systematische handleiding voor de efficiënte reiniging van histones H3 en H4 en de kwantificering van residuen geacetyleerd Histon.

Zuivering van H3 en H4 Histone eiwitten en de kwantificering van geacetyleerd Histone merken in cellen en hersenweefsel

Leer hoe u globale histonmodificaties kwantificeert in geïsoleerde microglia uit muizenhersenen met intranucleaire flowcytometrie. Deze methode versnelt epigenetisch onderzoek naar hersenaandoeningen.

Kwantificering van globale histon posttranslationele modificaties met behulp van intranucleaire flowcytometrie in geïsoleerde microglia in de hersenen van muizen (Video) | JoVE Journal

Kwantificering van globale histon posttranslationele modificaties met behulp van intranucleaire flowcytometrie in geïsoleerde microglia in de hersenen van muizen

Meer video's verkennen