Karakterisering van epitheliale wondgenezing in vivo met behulp van het Cnidarische modelorganisme Clytia hemisphaerica

Dit protocol maakt de visualisatie van epitheelcellen mogelijk tijdens wondgenezing bij levende dieren. Het stelt ons in staat om te zien hoe cellen zich gedragen in hun natuurlijke complexe omgeving. Deze techniek introduceert reagentia in de extracellulaire matrix en het celcytoplasma om het effect van deze reagentia op celverspreiding en migratie tijdens wondgenezing bij levende dieren te bestuderen.

Epitheelwondgenezing en Clytia lijken opmerkelijk veel op genezing bij complexere dieren. Daarom kunnen we veel leren van dit systeem over de mechanismen van wondgenezing en hoe ze zijn ontstaan. Elizabeth Lee en onderzoekstechnicus Emily Watto zullen deze procedures demonstreren.

Om het proces voor het verwonden te beginnen, bereidt u een aangepaste transferpipet voor door de pipetpunt met een schaar te snijden, waardoor een vergrote opening met een diameter van ongeveer 0,5 tot 0,7 centimeter ontstaat. Plaats met behulp van de gemodificeerde transferpipet de medusa verzameld uit de gevestigde poliepkolonies op een depressieglaas, met de medusa X-paraplu naar boven gericht. Zorg ervoor dat net genoeg kunstmatig zeewater, of ASW, het dier bedekt.

Om microwonden in en tussen cellen te creëren, plaatst u een afdekslip over het dier. De afdekslip comprimeert de mesoglea en de rebound van het samengeperste weefsel dwingt de cellen iets uit elkaar. Stel het dier onmiddellijk voor om de gecreëerde microwonden te observeren.

Om kleine epitheliale wonden te creëren, plaatst u de medusa op een depressieglaasje met de medusa X-paraplu naar boven gericht, met behulp van een aangepaste transferpipet, zoals eerder gedemonstreerd. Krab met een pipetpunt van 200 microliter voorzichtig aan het oppervlak van de medusa. Zacht krassen kan scheuren in het keldermembraan veroorzaken.

Bedek het dier met een afdekstrook voor beeldvorming. Het plaatsen van de afdekslip is soms voldoende om kleine epitheelwonden te creëren, zelfs zonder krassen. Bereid een microinjectienaald voor, met behulp van een micropipetpilaar en een glazen capillaire buis, volgens de stappen die in de tekst worden beschreven.

Plaats de lege microinjectienaald in een micro-injectiehouder die op een micromanipulator is bevestigd en snijd de punt van de naald af, zodat de opening ongeveer 20 tot 40 micron is. Stel de hold-druk op de micro-injector in op nul en de uitwerpdruk op ongeveer 20 pond per vierkante inch. Stel de micro-injector in om een luchtpuls van twee seconden af te geven.

Om grote epitheelwonden te creëren, plaatst u de medusa op een depressieglaas, zoals eerder gedemonstreerd. Stel met behulp van de micromanipulator de punt van de micro-injectienaald in om net boven het water te blijven, door de punt voorzichtig in het water te dompelen en vervolgens zo in te trekken dat deze zich dicht bij het epitheeloppervlak van de medusa bevindt. Pulseer lucht door op start op de injector te drukken.

Herhaal de puls twee tot vier keer op dezelfde plek, afhankelijk van de breedte van de punt. Grotere tips vereisen minder pulsen. Bedek het gewonde dier met een afdekstrook voor het afbeelden van grote wonden.

Pas de focus aan op de x-paraplu. Hexagonale cellen moeten helder zijn. Identificeer handmatig een wond om deze in beeld te brengen.

Start een programma dat beelden verzamelt als een film in realtime, of een programma dat met regelmatige tussenpozen een reeks afbeeldingen verzamelt. Bewaak de voortgang om ervoor te zorgen dat het wondgebied niet uit het gezichtsveld verdwijnt en dat de cellen van belang in focus blijven. Voor het injecteren van kleurstoffen en medicijnen, maak een microinjectienaald volgens de stappen die in de tekst worden beschreven.

Vul de micro-injectienaald met een lange pipetpunt met een overtollig volume kleurstof of medicijn voor injectie in de medusa. Plaats met behulp van een aangepaste transferpipet een medusa met de subparaplu naar boven gericht in de polydimethylsiloxaan of PDMS-injectieschaal, met net genoeg ASW om het dier te bedekken. Plaats de schaal op een podium van een ontleedmicroscoop.

Concentreer je op de punt van de micro-injectienaald en breng deze in het water in de buurt van de medusa. Druk met de micromanipulator de naald in de schaal totdat deze buigt en breekt. Het creëren van een tipopening van ongeveer 10 tot 20 micron.

Gebruik de micromanipulator om de punt van de naald door de subparaplu in de mesoglea te steken zonder de X-paraplu te doorboren. Stel op de micro-injector de hold-druk in op nul en de injectiedruk lager dan of gelijk aan 20 pond per vierkante inch. Injecteer in een of twee kwadranten en vul elk met een vlek kleurstof of medicijn ongeveer een vierde van het gebied van dat kwadrant.

Afhankelijk van welke kleurstof of welk medicijn wordt geïnjecteerd, worden dieren in een bekerglas verse ASW geplaatst om kleurstof of medicijndiffusie en incubatie mogelijk te maken. Voor beeldvorming monteert u de medusa op een depressieglaasje met behulp van een aangepaste transferpipet, waarbij u het dier positioneert met de X-paraplu naar boven gericht. Dieren kunnen in dit stadium gewond raken om het effect van een geïnjecteerd reagens te testen.

De microwondjes in en tussen cellen vormden kleine lamellipodia tijdens wondsluiting. Dit werd gevolgd door samentrekking en de wonden genazen in minder dan een minuut. De kleine epitheliale wonden genazen ook door lamellipodia-vorming en uitbreiding van lamellipodia-contacten.

Snelle en progressieve wondsluiting ging vooraf aan weefselcontractie langs de nieuw gevormde wondnaad. De genormaliseerde genezingssnelheid van twee kleine wonden uitgedrukt als het percentage van het totale wondoppervlak in de loop van de tijd duidde op enige variabiliteit in de dynamiek van wondsluiting. Gegevens van 14 verschillende wonden werden gebruikt om een gemiddelde wondgenezingscurve bij onbehandelde dieren vast te stellen.

In een kleine wond met keldermembraanbeschadiging verspreidden de marginale cellen zich rond het beschadigde gebied en sloot de opening zich met een samentrekking van de portemonnee. Wanneer het weefsel uitgedroogd of te beschadigd was om te herstellen, konden celbewegingen stoppen of kon het hele vel cellen barsten. Grote wonden genazen in verschillende fasen.

Afvlakking van de rand na samentrekkingen aan de rand, lamellipodiavorming en uitbreiding van lamellipodia contacten collectieve celmigratie op, en verschillende cellagen verwijderd van, de marge sloot grote gaten. Nucleaire en membraankleuring werden bereikt door micro-injectering van de reagentia in de ECM. Micro-injectie van cytochalasine B remde de vorming van lamellipodia na verwonding.

Behandel de dieren voorzichtig. Zorg er bij het injecteren van reagentia voor dat de punt van de micro-injectienaald zich in de mesoglea bevindt en niet helemaal door het dier is gegaan. Momenteel worden transgene dieren gemaakt met fluorescerende tag-eiwitten, gecombineerde fluorescentie en differentiële interfererende contrastmicroscopie zullen een nog duidelijker beeld geven van de cellulaire gebeurtenissen in epitheliale wondgenezing.