Name: Dual-Dye optische mapping van harten van RyR2R2474S Knock-in muizen van catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T12:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Leer dual-dye optische mapping voor cardiale elektrofysiologie bij CPVT muizen. Deze methode registreert gelijktijdig membraanpotentiaal en calciumsignalen om aritmieën te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (81700308 tot XO en 31871181 tot ML, en 82270334 tot XT), Sichuan Province Science and Technology Support Program (CN) (2021YJ0206 tot XO, 23ZYZYTS0433 en 2022YFS0607 tot XT, en 2022NSFSC1602 tot TC) en State Key Laboratory for Chemistry and Molecular Engineering of Medicinal Resources (Guangxi Normal University) (CMEMR2017-B08 tot XO), MRC (G10031871181 tot ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE bij Oxford (ML) beurzen.

Voor de experimenten worden mannelijke 10 tot 14 weken oude wildtype muizen of RyR2-R2474S/+ muizen (C57BL/6 achtergrond) met een gewicht van 20-25 g gebruikt. Alle procedures zijn goedgekeurd door de commissie voor dierenverzorging en -gebruik van de Southwest Medical University, Sichuan, China (goedkeuring nr.20160930) in overeenstemming met de nationale richtlijnen waaronder de instelling opereert.
1. Voorbereiding
<ol><li>Voorraad oplossingen<ol><li>Blebbistatine-stockoplossing: Voeg 1 ml 100% dimethylsulfoxide (DMSO) toe aan de oorspronkelijke kolf met 2,924 mg (-) blebbistatinepoeder om een concentratie van 10 mM te bereiken.</li>
		<li>Spanningsindicator RH237 voorraadoplossing: Voeg 1 ml 100% DMSO toe aan de originele kolf met 1 mg RH237-poeder om een concentratie van 2,01 mM te bereiken.</li>
		<li>Calciumindicator Rhod-2 AM voorraadoplossing: Voeg 1 ml 100% DMSO toe aan 1 mg Rhod-2 AM-poeder om een concentratie van 0,89 mM te bereiken.</li>
		<li>Pluronic F127 stockoplossing: Voeg 1 ml 100% DMSO toe aan 200 mg Pluronic F127 om een concentratie van 20% w/v (0,66 mM) te bereiken.</li>
		<li>Aliquot de stockoplossingen in PCR-buisjes van 200 μl in 21-51 μl (21 μl RH237, 31 μl Rhod-2 AM en 51 μl blebbistatine) voor eenmalig of dubbel gebruik om herhaaldelijk bevriezen en ontdooien te voorkomen. Wikkel de oplossingen vervolgens in aluminiumfolie en bewaar ze bij -20 °C, behalve de Pluronic F127-voorraadoplossing die in een donkere kamer bij kamertemperatuur wordt geplaatst.</li>
	</ol></li>
	<li>Perfusie oplossing<ol><li>Krebs-oplossing (in mM): Bereid 1 L Krebs-oplossing (NaCl 119, NaHCO3 25, NaH 2 PO 4 1.0, KCl4.7, MgCl 2 1.05, CaCl2 1.35 en glucose 10).</li>
		<li>Filtreer de oplossing met een aseptisch naaldfilter van 0,22 μm en oxygeneer met 95% O 2/5% CO2.</li>
		<li>Neem 40 ml Krebs-oplossing in een centrifugaalbuis van 50 ml en bewaar deze bij 4 °C voor follow-up hartisolatie.</li>
	</ol></li>
	<li>Het Langendorff-perfusiesysteem en het optische kaartapparaat<ol><li>Stel het Langendorff-perfusiesysteem in.<ol><li>Zet het waterbad aan en stel de temperatuur in op 37 °C.</li>
			<li>Was het Langendorff-perfusiesysteem met 1 L gedeïoniseerd water.</li>
			<li>Perfuseer de oplossing uit het inlaatkanaal en stel het uitstroomdebiet in op 3,5-4 ml/min. Zuurstof het perfusaat vervolgens met O 2/CO2 (95%/5%) gas bij 37 °C. OPMERKING: Een luchtbel is nooit toegestaan in het perfusiesysteem.</li>
		</ol></li>
		<li>Bereid het optische mappingsysteem voor.<ol><li>Installeer de EMCCD-camera (Electron Multiplying Charge-Coupled Device) (512 × 512 pixels), lens (40x vergroting), golflengtesplitter light-emitting diodes (LED's), elektrocardiogram (ECG)-monitor en stimulatie-elektrode (Afbeelding 1).</li>
			<li>Stel de juiste werkafstand van de lens naar de hartpositie in.</li>
			<li>Plaats twee LED's op de diagonale positie van het thermostatische bad voor een gelijkmatige verlichting, waardoor een golflengte van 530 nm ontstaat voor het genereren van excitatielicht. Gebruik een ET525/50 sputterfilter om out-of-band licht voor de LED's te verwijderen.</li>
			<li>Pas de handgreepschakelaar aan om een gelijk vierkant van het doeloppervlak te bereiken, waardoor de spannings- en calciumbeelden adequaat op de verwervingsinterface verschijnen.</li>
			<li>Draai het diafragma van de lens naar de maximale diameter om te voorkomen dat spannings- of calciumsignalen lekken.</li>
			<li>Stel de cameralens op de juiste hoogte af, want deze heeft een fijne werkafstand tot het thermostatische bad, meestal wordt 10 cm gebruikt.</li>
			<li>Schakel de camera in voor een stabiele bemonsteringstemperatuur bij -50 °C.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Werkwijze
<ol><li>Oogst, canulatie en perfusie van muizenhart<ol><li>Injecteer de dieren intraperitoneaal met avertine-oplossing (1,2%, 0,5-0,8 ml) en heparine (200 eenheden) om lijden en pijnreflex te minimaliseren en de vorming van bloedstolsels te voorkomen. Offert de dieren na 15 minuten door cervicale dislocatie.</li>
		<li>Open de kist met een schaar, oogst het hart voorzichtig en plaats het in de koude Krebs-oplossing (4 °C, 95% O 2, 5% CO2) om de stofwisseling te vertragen en het hart te beschermen.</li>
		<li>Verwijder het omringende weefsel van de aorta, kanunneer de aorta met een op maat gemaakte canulerende naald (buitendiameter: 0,8 mm, binnendiameter: 0,6 mm, lengte: 27 mm) en fixeer deze met een 4-0 zijden hechtdraad.</li>
		<li>Doordrenk het hart met het Langendorff-systeem met een constante snelheid van 3,5-4,0 ml/min en houd de temperatuur op 37 ± 1 °C. OPMERKING: Alle volgende procedures worden in deze toestand uitgevoerd.</li>
		<li>Steek een klein plastic buisje (0,7 mm diameter, 20 mm lengte) in de linker hartkamer om de congestie van de oplossing in de kamer te verminderen om overbelasting te voorkomen.</li>
	</ol></li>
	<li>Ontkoppelaar van excitatie-contractie en dual-dye belasting<ol><li>Plaats twee draden in het parfum in het bad, schakel de stroomvoorziening van de ECG-versterkerbox en de elektrische stimulatieregelaar in en start vervolgens de ECG-software waarnaar wordt verwezen en controleer het ECG continu.</li>
		<li>Voer de volgende stappen in het donker uit wanneer het hart een stabiele toestand bereikt (het hart klopt ritmisch met ~400 slagen per minuut).</li>
		<li>Meng 50 μL 10 mM blebbistatine-stockoplossing met 50 ml Krebs-oplossing om een concentratie van 10 μM te bereiken. Laat het mengsel van blebbistatine en Krebs-oplossing gedurende 10 minuten constant in het hart doordringen om contractie los te koppelen van excitatie en contractieartefacten tijdens het filmen te voorkomen.</li>
		<li>Gebruik een rode zaklamp om te controleren of de samentrekking van het hart volledig stopt, omdat samentrekking de kwaliteit van het laden van de kleurstof zal beïnvloeden.</li>
		<li>Meng na het ontkoppelen van excitatie-contractie 15 μL Rhod-2 AM-voorraadoplossing met 15 μL Pluronic F127-stockoplossing in 50 ml Krebs-oplossing om de eindconcentraties van 0,267 μM Rhod-2 AM en 0,198 μM Pluronic F127 te bereiken. Doordrenk het hart vervolgens continu met Rhod-2 AM werkoplossing gedurende 15 minuten in het Langendorff-perfusiesysteem.</li>
		<li>Houd de zuurstoftoevoer op peil tijdens het laden van intracellulaire calciumkleurstoffen. Aangezien bellen gemakkelijk worden gevormd in Pluronic F127, moet u een bellenvanger in het perfusiesysteem plaatsen om gasembolisatie van de kransslagaders te voorkomen.</li>
		<li>Verdun 10 μL RH237-stockoplossing in 50 ml perfusaat om de uiteindelijke concentratie van 0,402 μM te bereiken en laad gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Maak aan het einde van het laden met dubbele kleurstof een reeks foto's om er zeker van te zijn dat zowel de spannings- als de calciumsignalen voldoende zijn voor analyse (geen interactie tussen twee signalen).</li>
	</ol></li>
	<li>Optische mapping en aritmie-inductie OPMERKING: Het optisch in kaart brengen begint na het stoppen van de contractie en een geschikte kleurstofbelasting, en het hart wordt achtereenvolgens geperfundeerd zoals in de hierboven beschreven stappen in 2.1 (4).<ol><li>Schakel de twee LED's in voor excitatielichten en pas hun intensiteit aan op het juiste bereik (sterk genoeg voor verlichting en relatief eenvoudig filmen, maar niet te robuust voor overbelichting).</li>
		<li>Plaats het hart onder het detectieapparaat, zorg ervoor dat het voldoende verlicht wordt door twee LED's en stel de diameter van de lichtvlek in op 2 cm.</li>
		<li>Stel de werkafstand van de lens tot het hart in op 10 cm, wat een bemonsteringsfrequentie van bijna 500 Hz en een ruimtelijke resolutie van 120 x 120 μm per pixel oplevert.</li>
		<li>Open de signaalbemonsteringssoftware om de camera digitaal te bedienen om tegelijkertijd spannings- en calciumsignalen vast te leggen.</li>
		<li>Start de myopacer-veldstimulator en stel het stimulatiepatroon in op Transistor Transistor Logic (TTL), 2 ms stimulatieduur voor elke puls en 0.3 V als initiële intensiteit.</li>
		<li>Gebruik 30 opeenvolgende 10 Hz S1-stimuli om de diastolische spanningsdrempel van het hart te testen die wordt aangedreven door de ECG-opnamesoftware. Verhoog geleidelijk de spanningsamplitude totdat 1:1 opname is gerealiseerd (controleer QRS-golf van de ECG-monitor, actiepotentiaal (AP) en calciumtransiënten (CaT)-signalen).</li>
		<li>Na het bepalen van de spanningsdrempel, loopt u het hart met een intensiteit van 2x de diastolische spanningsdrempel met een paar platina-elektroden die zijn bevestigd aan de epicardiale apex van de linker hartkamer (LV) (ELVA).</li>
		<li>Implementeer het S1S1-protocol om calcium- of actiepotentiaalalternanen en restitutie-eigenschappen te meten. Versnel het hart achtereenvolgens met een basiscycluslengte van 100 ms, waarbij u elke volgende reeks 10 ms van de cycluslengte verlaagt totdat 50 ms is bereikt. Elke aflevering bevat 30 opeenvolgende stimuli met een pulsbreedte van 2 ms. Begin tegelijkertijd met het optisch in kaart brengen vóór stimulatie (de bemonsteringstijd omvat ~10 sinusritmes en pacingduur).</li>
		<li>Om de ventriculaire effectieve refractaire periode (ERP) te meten met behulp van het S1S2-stimulusprotocol, begint u met een S1S1-stimulatiecycluslengte van 100 ms met een S2 gekoppeld aan 60 ms met een stapafname van 2 ms totdat S2 er niet in slaagt het ectopische QRS-complex vast te leggen.</li>
		<li>Voer voor aritmie-inductie eeuwigdurende burst-stimulatie van 50 Hz uit (50 continue elektrische stimulaties met een pulsbreedte van 2 ms) en voer dezelfde stimulatie-episode uit na een rustinterval van 2 s.</li>
		<li>Observeer ECG-opnames zorgvuldig tijdens de continue hoogfrequente pacing-periode, zodat de gelijktijdige optische mapping-opnames onmiddellijk kunnen beginnen wanneer een interessante aritmische ECG-golf wordt gegenereerd (aangezien de meeste hartritmestoornissen worden veroorzaakt door elektrische stimulatie, worden de optische signalen 2-3 s vóór burst-stimulatie bemonsterd in geval van verlies van belangrijke cardiale gebeurtenissen).</li>
		<li>Beeld met EMCCD-camera (bemonsteringsfrequentie: 500 Hz, pixelgrootte: 64 x 64).</li>
	</ol></li>
	<li>Data-analyse<ol><li>Laden van beelden en signaalverwerking<ol><li>Druk op Map selecteren en Afbeeldingen laden om de afbeeldingen in de beeldacquisitiesoftware te laden voor semi-automatische massale videogegevensanalyse volgens de eerder beschreven instellingen en protocollen15,16.</li>
			<li>Voer de juiste samplingparameters in (zoals pixelgrootte en framerate).</li>
			<li>Stel de afbeeldingsdrempel in door handmatige invoer en selecteer het interessegebied (ROI).</li>
			<li>Implementeer een Gaussiaans ruimtelijk filter van 3 x 3 pixels, een Savitzky-Goaly-filter en een basislijncorrectie met een hoge hoed.</li>
			<li>Druk op Afbeeldingen verwerken om de basislijn te verwijderen en de elektrofysiologische parameters te berekenen, zoals APD80 en CaTD50.</li>
		</ol></li>
		<li>Analyse van elektrofysiologische parameters<ol><li>Stel de initiatietijd van APD in op de piek en het eindpunt op 80% repolarisatie (APD80) voor de berekening van APD80. Evenzo wordt de starttijd van CaTD gedefinieerd als de piek en het eindpunt als de ontspanning van 80%.</li>
			<li>De meting van de geleidingssnelheid (CV) is afhankelijk van de pixelgrootte en de actiepotentiaalgeleidingstijd tussen twee pixels of meer. Bereken de gemiddelde snelheid van alle gekozen pixels - dit is de gemiddelde geleidingssnelheid van het geselecteerde gebied. Genereer tegelijkertijd overeenkomstige isochronale afbeeldingen voor een duidelijk beeld van de geleidingsrichting. OPMERKING: O'Shea et al.15 rapporteerden de CV-meting in detail.</li>
			<li>Voor de analyse van alternanen en aritmieën worden calciumalternanen gedefinieerd als een continue grote en kleine piekamplitude die afwisselend verschijnen. Gebruik de piekamplitudeverhouding om de ernst van frequentieafhankelijke alternanen te beoordelen (1-A2/A1). Pas fasekaarten toe om complexe aritmieën zoals ventriculaire tachycardie (VT) te analyseren. Zoek naar de rotoren die duidelijk in een specifiek gebied verschijnen terwijl de rotors verschuiven.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Priori, S. G., Chen, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherited+dysfunction+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+handling+and+arrhythmogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis.</a> Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).</li>
<li>Goddard, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+consequences+of+the+P2328S+mutation+in+the+ryanodine+receptor+%28RyR2%29+gene+in+genetically+modified+murine+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts.</a> Acta Physiologica. 194 (2), 123-140 (2008).</li>
<li>Sabir, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternans+in+genetically+modified+langendorff-perfused+murine+hearts+modeling+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Alternans in genetically modified langendorff-perfused murine hearts modeling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Frontiers in Physiology. 1, 126(2010).</li>
<li>Zhang, Y., Matthews, G. D., Lei, M., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+Ca2%2B+homeostasis%2C+atrial+arrhythmogenesis%2C+and+sinus+node+dysfunction+in+murine+hearts+modeling+RyR2+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Abnormal Ca2+ homeostasis, atrial arrhythmogenesis, and sinus node dysfunction in murine hearts modeling RyR2 modification.</a> Frontiers in Physiology. 4, 150(2013).</li>
<li>Leenhardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia+in+children.+A+7-year+follow-up+of+21+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children. A 7-year follow-up of 21 patients.</a> Circulation. 91 (5), 1512-1519 (1995).</li>
<li>Priori, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+cardiac+ryanodine+receptor+gene+%28hRyR2%29+underlie+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Circulation. 103 (2), 196-200 (2001).</li>
<li>Wehrens, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FKBP12.6+deficiency+and+defective+calcium+release+channel+%28ryanodine+receptor%29+function+linked+to+exercise-induced+sudden+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death.</a> Cell. 113 (7), 829-840 (2003).</li>
<li>Novak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+abnormalities+in+iPSC-derived+cardiomyocytes+generated+from+CPVT1+and+CPVT2+patients+carrying+ryanodine+or+calsequestrin+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional abnormalities in iPSC-derived cardiomyocytes generated from CPVT1 and CPVT2 patients carrying ryanodine or calsequestrin mutations.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 2006-2018 (2015).</li>
<li>Napolitano, C., Mazzanti, A., Bloise, R., Priori, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CACNA1C-related+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22GeneReviews%22%5BJournal%5D)">CACNA1C-related disorders.</a> GeneReviews. Adam, M. P. , University of Washington. Seattle. (1993).</li>
<li>Makita, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+calmodulin+mutations+associated+with+congenital+arrhythmia+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation.+Cardiovascular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility.</a> Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (4), 466-474 (2014).</li>
<li>Gomez-Hurtado, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+CPVT-associated+calmodulin+mutation+in+CALM3+%28CALM3-A103V%29+activates+arrhythmogenic+Ca+waves+and+sparks%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%2C+Arrhythmia+and+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks.</a> Circulation, Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (8), (2016).</li>
<li>Wleklinski, M. J., Kannankeril, P. J., Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+tissue+mechanisms+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Journal of Physiology. 598 (14), 2817-2834 (2020).</li>
<li>Neco, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+effect+of+increased+diastolic+Ca2%2B+release+and+decreased+sinoatrial+node+activity+in+a+mouse+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Paradoxical effect of increased diastolic Ca2+ release and decreased sinoatrial node activity in a mouse model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Circulation. 126 (4), 392-401 (2012).</li>
<li>Bogdanov, K. Y., Vinogradova, T. M., Lakatta, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sinoatrial+nodal+cell+ryanodine+receptor+and+Na%28%2B%29-Ca%282%2B%29+exchanger%3A+molecular+partners+in+pacemaker+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation.</a> Circulation Research. 88 (12), 1254-1258 (2001).</li>
<li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ElectroMap%3A+High-throughput+open-source+software+for+analysis+and+mapping+of+cardiac+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1389(2019).</li>
<li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+optical+mapping+data+using+ElectroMap%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663(2019).</li>
<li>Choi, B. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts%3A+mechanisms+underlying+concordant+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).</li>
<li>Rybashlykov, D., Brennan, J., Lin, Z., Efimov, I. R., Syunyaev, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-source+low-cost+cardiac+optical+mapping+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Open-source low-cost cardiac optical mapping system.</a> PLoS One. 17 (3), 0259174(2022).</li>
<li>Lucas-Lopez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+stereochemical+assignment+and+fluorescence+tuning+of+the+small+molecule+tool%2C+%28-%29-blebbistatin%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Absolute stereochemical assignment and fluorescence tuning of the small molecule tool, (-)-blebbistatin.</a> European Journal of Organic Chemistry. 2005 (9), 1736-1740 (2005).</li>
<li>Ponsaerts, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myosin+II+ATPase+inhibitor+blebbistatin+prevents+thrombin-induced+inhibition+of+intercellular+calcium+wave+propagation+in+corneal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4816-4827 (2008).</li>
<li>Jou, C., Spitzer, K., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbistatin+effectively+uncouples+the+excitation-contraction+process+in+zebrafish+embryonic+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+%26+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart.</a> Cellular Physiology & Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).</li>
<li>Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+uncoupler+blebbistatin+is+associated+with+significant+electrophysiological+effects+in+the+isolated+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart.</a> Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).</li>
<li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+optical+mapping+data+using+ElectroMap%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663(2019).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dataset+of+dual+calcium+and+voltage+optical+mapping+in+healthy+and+hypertrophied+murine+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts.</a> Scientific Data. 8 (1), 314(2021).</li>
<li>Lei, M., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+arrhythmogenesis%3A+a+tale+of+two+clocks%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks.</a> Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).</li>
<li>Mal Baudot,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concomitant+genetic+ablation+of+L-type+Cav1.3+%CE%B11D+and+T-type+Cav3.1+%CE%B11G+Ca2%2B+channels+disrupts+heart+automaticity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 α1D and T-type Cav3.1 α1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18906(2020).</li>
<li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZO-1+regulates+intercalated+disc+composition+and+atrioventricular+node+conduction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction.</a> Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).</li>
<li>Glukhov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calsequestrin+2+deletion+causes+sinoatrial+node+dysfunction+and+atrial+arrhythmias+associated+with+altered+sarcoplasmic+reticulum+calcium+cycling+and+degenerative+fibrosis+within+the+mouse+atrial+pacemaker+complex1%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1.</a> European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).</li>
<li>Torrente, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burst+pacemaker+activity+of+the+sinoatrial+node+in+sodium-calcium+exchanger+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventricular+SK2+upregulation+following+angiotensin+II+challenge%3A+Modulation+by+p21-activated+kinase-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).</li>
<li>Dong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+dual+calcium-voltage+optical+mapping+in+murine+sinoatrial+preparation+with+optogenetic+pacing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing.</a> Frontiers in Physiology. 10, 954(2019).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+transverse+cardiac+slicing+and+optical+mapping+in+murine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart.</a> Frontiers in Physiology. 10, 755(2019).</li>
<li>Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+calcium+release+in+tissue+from+the+failing+canine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).</li>
<li>Laurita, K. R., Singal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+action+potentials+and+calcium+transients+simultaneously+from+the+intact+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).</li>
<li>Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Errors+caused+by+combination+of+Di-4+ANEPPS+and+Fluo3%2F4+for+simultaneous+measurements+of+transmembrane+potentials+and+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium.</a> Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).</li>
</ol>

Geen van de auteurs heeft belangenconflicten te melden.

Op basis van onze ervaring zijn de sleutels tot een succesvolle dual-dye optische mapping van een muishart een goed voorbereide oplossing en hart, het laden van kleurstoffen, het bereiken van de beste signaal-ruisverhouding en het verminderen van het bewegingsartefact.
Bereiding van de oplossing De oplossing van Krebs is essentieel voor een succesvol hartexperiment. MgCl 2- en CaCl2-voorraadoplossingen (1 mol/L) worden van tevoren bereid rekening houde...

Erfelijke hartaandoening catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie (CPVT) manifesteert zich als episodes van polymorfe ventriculaire tachycardie (PVT) na fysieke activiteit, stress of catecholamine-provocatie, die kan verslechteren tot mogelijk fatale ventriculaire fibrillatie 1,2,3,4 . Recent bewijs na de eerste melding als klinisch syndroom in 1995 impliceerde mutaties in zeven genen, die allemaal betrokken zijn bij de afgifte van Ca 2+ in sarcoplasmatisch reticulair (SR) in deze toestand: de meest frequent gerapporteerde RYR2 die codeert voor ryanodinereceptor 2 (RyR2) van Ca2+ afgiftekanalen5,6, FKBP12.67, CASQ2 codeert voor cardiale calsequestrine8, TRDN codeert voor het junctionele SR-eiwit triadine 9, en CALM19, CALM2 10 en CALM3 codeert identiek voor calmoduline11,12. Deze genotypische patronen schrijven de aritmische gebeurtenissen toe aan de ongereguleerde pathologische afgifte van SR-opslag Ca2+12.
Spontane Ca 2+ afgifte van SR kan worden gedetecteerd als Ca 2+ vonken of Ca 2+ golven, die de Na+/Ca 2+ wisselaar (NCX) activeert. De wisselaar van één Ca2+ voor drie Na+ genereert een inwaartse stroom, die de diastolische depolarisatie versnelt en de membraanspanning naar de actiepotentiaaldrempel (AP) drijft. Bij RyR2 knock-in muizen leidt de verhoogde activiteit van RyR2R4496C in de sinusknoop (SAN) tot een onverwachte afname van de SAN-automaticiteit door Ca 2+-afhankelijke afname van I Ca,L en SRCa 2+ depletie tijdens diastole, waarbij subcellulaire pathofysiologische veranderingen worden geïdentificeerd die bijdragen aan de SAN-disfunctie bij CPVT-patiënten13,14. Het optreden van de verwante cardiomyocyt cytosolischeCa 2+ golven is waarschijnlijker na verhogingen van het cytosolische [Ca2+] op de achtergrond na RyR-sensibilisatie door catecholamine, waaronder isoproterenol (ISO), provocatie.
Gedetailleerde kinetische veranderingen in Ca 2+-signalering na RyR2-gemedieerde Ca2+-afgifte als reactie op activering van actiepotentiaal (AP) die de oorzaak kunnen zijn van de waargenomen ventriculaire aritmieën in intacte cardiale CPVT-modellen moeten nog worden bepaald voor het volledige bereik van gerapporteerde RyR2-genotypen12. Dit artikel presenteert de instrumentatie-opstelling en experimentele procedure voor high-throughput mapping van Ca2+ signalen en transmembraanpotentialen (Vm) in muizen wild-type (WT) en heterozygote RyR2-R2474S/+ harten, gecombineerd met geprogrammeerde elektrische stimulatie voor en na isoproterenol provocatie. Dit protocol biedt een methode voor de mechanistische studie van CPVT-ziekte in geïsoleerde muizenharten.

<table><tbody><tr><td>0.2 &mu;m syringe filter</td><td>Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China</td><td>N/A</td><td>Om oplossing te filteren</td></tr><tr><td>15 mL centrifuge tube</td><td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China</td><td>CFT011150</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Pasteur pipette</td><td>Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China</td><td>00900026</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Syringe</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>YZB/GER-5474-2014</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;L PCR tube</td><td>Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China</td><td>F611541-0010</td><td>De stockoplossingen af te meten  om herhaaldelijk invriezen en ontdooien te voorkomen</td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tube</td><td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China</td><td>CFT011500</td><td>Tyrode's oplossing bij 4 &deg;C bewaren voor het isoleren van het hart</td></tr><tr><td>585/40 nm filter</td><td>Chroma Technology</td><td>N/A</td><td>Filter voor calciumsignaal</td></tr><tr><td>630 nm long-pass filter</td><td>Chroma Technology</td><td>G15604AJ</td><td>Filter voor voltagesignaal</td></tr><tr><td>Avertin (2,2,2-tribromoethanol)</td><td>Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom</td><td>T48402-100G</td><td>Om het lijden en pijnreflex te minimaliseren</td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States</td><td>SLBV5564</td><td>Excitatie-contractie ontkoppelingsmiddel om&nbsp; bewegingsartefact tijdens mapping te elimineren</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td><td>SLBK1794V</td><td>Voor Tyrode's oplossing</td></tr><tr><td>Custom-made thermostatic bath</td><td>MappingLab, United Kingdom</td><td>TBC-2.1</td><td>Om de temperatuur van de perfusieoplossing te handhaven</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>(RNBT7442)</td><td>Oplosmiddel voor kleurstoffen</td></tr><tr><td>Dumont forceps</td><td>Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China</td><td>YAF030</td><td></td></tr><tr><td>ElectroMap software</td><td>University of Birmingham</td><td>N/A</td><td>Kwantificering van elektrische parameters</td></tr><tr><td>EMCCD camera</td><td>Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States</td><td>A18G150001</td><td>Beelden voor optische signalen verwerven</td></tr><tr><td>ET525/36 sputter coated filter</td><td>Chroma Technology</td><td>319106</td><td>Excitatiefilter</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td><td>SLBT4811V</td><td>Voor Tyrode's oplossing</td></tr><tr><td>Heparin Sodium</td><td>Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China</td><td>(H51021209)</td><td>Om bloedstolsels in de kransslagader te voorkomen</td></tr><tr><td>&nbsp;Iris forceps</td><td>Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China</td><td>YAA010</td><td></td></tr><tr><td>Isoproterenol</td><td>MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States</td><td>HY-B0468/CS-2582</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td><td>SLBS5003</td><td>Voor Tyrode's oplossing</td></tr><tr><td>MacroLED</td><td>Cairn Research, Faversham, United Kingdom</td><td>7355/7356</td><td>De excitatielicht van fluorescentieproeven</td></tr><tr><td>MacroLED light source</td><td>Cairn Research, Faversham, United Kingdom</td><td>7352</td><td>De LED's aansturen</td></tr><tr><td>Mayo scissors</td><td>Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China</td><td>YBC010</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>Optische signalen samplen</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td><td>BCBS6841V</td><td>Voor Tyrode's oplossing</td></tr><tr><td>MICRO3-1401</td><td>Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom</td><td>M5337</td><td>De elektrische stimulator en Spike2 software verbinden</td></tr><tr><td>MyoPacer EP field stimulator</td><td>Ion Optix Co, Milton, MA, United States</td><td>S006152</td><td>Elektrische stimulator</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td><td>SLBS2340V</td><td>Voor Tyrode's oplossing</td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td><td>BCBW9042</td><td>Voor Tyrode's oplossing</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td><td>SLBX3605</td><td>Voor Tyrode's oplossing</td></tr><tr><td>NeuroLog System</td><td>Digitimer</td><td>NL905-229</td><td>Voor ECG-versterker</td></tr><tr><td>OmapScope5</td><td>MappingLab, United Kingdom</td><td>N/A</td><td>Calcium-alternans- en aritmie-analyse</td></tr><tr><td>Ophthalmic scissors</td><td>Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China</td><td>T4-3904</td><td></td></tr><tr><td>OptoSplit</td><td>Cairn Research, Faversham, United Kingdom</td><td>6970</td><td>De emissielicht splitsen voor het tegelijkertijd detecteren van Ca2+ en Vm&nbsp;</td></tr><tr><td>Peristalic pump</td><td>Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,</td><td>BT100-2J</td><td>Om de oplossing te pompen</td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>BIOFIL</td><td>TCD010060</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, United States</td><td>1899021</td><td>Om het laden met Rhod2AM te verbeteren</td></tr><tr><td>RH237</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States</td><td>1971387</td><td>Spanningsgevoelige kleurstof</td></tr><tr><td>Rhod-2 AM</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, United States</td><td>1890519</td><td>Calciumindicator</td></tr><tr><td>Silica gel tube</td><td>Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,</td><td>96402-16</td><td>Aansluiten op de peristaltische pomp</td></tr><tr><td>Silk suture</td><td>Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China</td><td>20172650032</td><td>Om de aorta te fixeren</td></tr><tr><td>Spike2</td><td>Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom</td><td>N/A</td><td>ECG-gegevens opnemen en analyseren</td></tr><tr><td>Stimulation electrode</td><td>MappingLab, United Kingdom</td><td>SE1600-35-2020</td><td></td></tr><tr><td>T510lpxr</td><td>Chroma Technology</td><td>312461</td><td>Voor lichtbron</td></tr><tr><td>T565lpxr</td><td>Chroma Technology</td><td>321343</td><td>Voor lichtbron</td></tr></tbody></table>

dual-dye optische mapping van harten van ryr2r2474s knock-in muizen van catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie

Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

De pro-aritmische hartaandoening catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie (CPVT) manifesteert zich als episodes van polymorfe ventriculaire tachycardie na fysieke activiteit, stress of catecholamine-provocatie, die kan verslechteren tot mogelijk fatale ventriculaire fibrillatie. Het muizenhart is een wijdverbreide soort voor het modelleren van erfelijke hartritmestoornissen, waaronder CPVT. Het gelijktijdig optisch in kaart brengen van transmembraanpotentiaal (Vm) en calciumtransiënten (CaT) van met Langendorff geperfuseerde muizenharten heeft het potentieel om mechanismen op te helderen die ten grondslag liggen aan aritmogenese. Vergeleken met het onderzoek op cellulair niveau kan de optische mappingtechniek enkele elektrofysiologische parameters testen, zoals de bepaling van activering, geleidingssnelheid, actiepotentiaalduur en CaT-duur. Dit artikel presenteert de instrumentatie-opstelling en experimentele procedure voor high-throughput optische mapping van CaT en Vm in muizen wildtype en heterozygote RyR2-R2474S/+ harten, gecombineerd met geprogrammeerde elektrische stimulatie voor en tijdens de isoproterenol-provocatie. Deze aanpak heeft een haalbare en betrouwbare methode aangetoond voor het mechanistisch bestuderen van CPVT-ziekte in een ex vivo muizenhartpreparaat.

Optical mapping is de afgelopen tien jaar een populaire benadering geweest bij het bestuderen van complexe hartritmestoornissen. De optische mapping-opstelling bestaat uit een EMCCD-camera, die een bemonsteringsfrequentie tot 1.000 Hz en een ruimtelijke resolutie van 74 x 74 μm voor elke pixel oplevert. Het maakt een vrij hoge signaal-ruisverhouding mogelijk tijdens signaalbemonstering (Figuur 1). Zodra het met Langendorff doorbloede hart een stabiele toestand bereikt en het laden van de kle...

Dit protocol introduceert dual-dye optische mapping van muizenharten verkregen van wildtype en knock-in dieren die zijn aangetast door catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie, inclusief elektrofysiologische metingen van transmembraanspanning en intracellulaire Ca2+ transiënten met hoge temporele en ruimtelijke resolutie.

Dual-Dye optische mapping van harten van RyR2R2474S Knock-in muizen van catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie

The pro-arrhythmic cardiac disorder catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) manifests as polymorphic ventricular tachycardia episodes ...

Deze methode zal ons helpen om de elektrofysiologische eigenschappen en mechanismen van ventriculaire uitstrijkjes te onthullen die verband houden met ziekten zoals catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie. Met behulp van deze techniek kunnen we de membraanpotentiaal en intercellulaire calciumsignalen tegelijkertijd verkrijgen onder verschillende geprogrammeerde elektrische pacingprotocollen, wat vooral geschikt is voor het onderzoeken van de onderliggende mechanismen en dynamiek van hartritmestoornissen zoals CPVT. Om dit experiment met succes uit te voeren, moet u zorgen voor een goed doorbloed hart, een goede kleurstofbelasting, excitatie-contractie-ontkoppeling en zorgvuldige camera-instellingen.Stel om te beginnen het optische mappingsysteem in en zet de camera aan voor een stabiele bemonsteringstemperatuur bij min 50 graden Celsius. Plaats het geoogste muizenhart in de koude CREB-oplossing om de stofwisseling te vertragen en het hart te beschermen. Verwijder het omringende weefsel van de aorta.Gebruik een op maat gemaakte canulerende naald om het te cannuleren en fixeer het met een 4-0 zijden hechtdraad. Doordrenk nu het hart met het Langendorff-systeem met een constante snelheid van 3,5 tot 4,0 milliliter per minuut. Steek een klein plastic buisje in de linker hartkamer om de congestie van de oplossing in de kamer te verwijderen om overbelasting te voorkomen en bevestig het plastic buisje in de canulerende naald.Plaats vervolgens twee draden in het perfusaat in het bad en schakel de voedingen voor de elektrocardiogram versterkerbox en elektrische stimulatiecontroller in. Start vervolgens het elektrocardiogram of de ECG-software waarnaar wordt verwezen en controleer het ECG continu. Voer de volgende stappen in het donker uit wanneer het hart een stabiele toestand bereikt.Doordrenk het blebbistatine CREBs-oplossingsmengsel constant gedurende 10 minuten in het hart om contractie los te koppelen van excitatie en contractieartefacten tijdens het filmen te voorkomen. Onderzoek vervolgens met een rode zaklamp het hart om de volledige stopzetting van de weeën te bevestigen. Doordrenk het hart gedurende 15 minuten met Rhod-2 AM-werkoplossing in het Langendorff-perfusiesysteem na het ontkoppelen van de excitatiecontractie.Handhaaf de zuurstoftoevoer tijdens het laden van intracellulaire calciumkleurstoffen. Om de vorming van luchtbellen door pluronic F-127 te voorkomen, plaatst u een bellenvanger in het perfusiesysteem. Verdun 10 microliter RH 237 stockoplossing in 50 milliliter perfusaat en laad gedurende 10 minuten.Na voltooiing van het laden van de dubbele kleurstof, maakt u een reeks foto's. Controleer of de spannings- en calciumsignalen voldoende zijn voor analyse. Schakel de twee LED's in voor excitatielichten en pas hun intensiteit aan tot een goed bereik.Plaats het hart onder het detectieapparaat en zorg ervoor dat het goed wordt verlicht door de twee LED's die de diameter van de lichtvlek aanpassen tot twee centimeter. Stel de werkafstand tussen de lens en het hart in op 10 centimeter om de gewenste bemonsteringsfrequentie en ruimtelijke resolutie te bereiken. Open de software voor signaalbemonstering om tegelijkertijd de camera te bedienen en spannings- en calciumsignalen vast te leggen.Start de MyoPacer Field Stimulator en stel het stimulatiepatroon in op transistortransistorlogica met twee milliseconden stimulatieduur per puls. Stel de initiële intensiteit in op 0.3 volt. Plaats een paar platina-elektroden die zijn bevestigd aan de epicardiale apex van de linker hartkamer.Pas 30 opeenvolgende S1-stimuli van 10 hertz toe om de diastolische spanningsdrempel van het hart te testen met behulp van de ECG-opnamesoftware. Verhoog geleidelijk de spanningsamplitude totdat één-op-één opname is bereikt. Implementeer het S1-S1-protocol om calcium- of actiepotentiaalalternatieven en restitutie-eigenschappen te meten.Verhoog het hart achtereenvolgens, beginnend met een basiscycluslengte van 100 milliseconden. Verkort de cycluslengte met 10 milliseconden in elke volgende reeks tot 50 milliseconden. Start tegelijkertijd optische mapping voorafgaand aan stimulatie.Om de ventriculaire effectieve refractaire periode te meten met behulp van het S1-S2-stimulusprotocol, begint u met een S1-S1-stimulatiecycluslengte van 100 milliseconden. Koppel S2 na 60 milliseconden en verlaag met een stapafname van twee milliseconden totdat S2 er niet in slaagt het ectopische QRS-complex vast te leggen. Voor aritmie-inductie dient u eeuwigdurende burst-pacing van 50 hertz toe en voert u dezelfde pacing-episode uit na een rustpauze van twee seconden.Houd de elektrocardiogramopnamen zorgvuldig in de gaten tijdens de continue hoogfrequente stimulatieperiode om onmiddellijk te beginnen met gelijktijdige optische mapping-opnames wanneer een interessante aritmische golf wordt gegenereerd. Ga verder met het vastleggen van beelden met behulp van de camera van het elektronenvermenigvuldigende ladinggekoppelde apparaat. Druk in de beeldacquisitiesoftware op Map selecteren en laad afbeeldingen om het semi-automatische analyseproces voor enorme videogegevens te starten.Voer de juiste bemonsteringsparameters voor de analyse in. Stel handmatig de afbeeldingsdrempel in en selecteer het interessegebied. Pas een Gaussiaans ruimtelijk filter van drie bij drie pixels, een Savitzky-Golay-filter en een basislijncorrectie met hoge hoed toe.Druk vervolgens op Afbeeldingen verwerken om de basislijn te verwijderen en elektrofysiologische parameters zoals APD-80 en CATD-50 te berekenen. Stel de initiatietijd van de actiepotentiaalduur in op de piek en het eindpunt op 80% repolarisatie voor het berekenen van APD-80. Definieer op dezelfde manier de starttijd van de calciumtransiënte duur als de piek, met als eindpunt 80% ontspanning.Typische sporen in heatmaps van APD-80 en CATD-80 worden getoond. Isoproterenol verkort APD-80 en wildtype en catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie of CPVT-muizen, maar er werd geen verschil gevonden na isoproterenolprovocatie. CATD-80- en CPVT-muizen waren langer dan bij wildtype na de isoproterenolprovocatie, terwijl er vóór de behandeling geen significantie was.Volgens de spanningssignalen bezaten het wildtype en CPVT-harten hetzelfde geleidingsvermogen over het epicardium bij baseline en na isoproterenol-interventie. Warmtekaarten toonden aan dat CPVT-muizen hetzelfde geleidingsvermogen hebben als de wildtype muizen voor en na de isoproterenol-provocatie. Analyse van calciumamplitude-alternatieven toonde aan dat de calciumsignalen in wild-type harten stabiel bleven bij baseline tijdens opeenvolgende S1-S1-pacing op 14,29 en 16,67 hertz, terwijl de CPVT-harten frequentieafhankelijke alternatieven vertoonden.Na de isoproterenol-provocatie vertoonden CPVT-harten frequentieafhankelijke afwisselingen en calciumsignaal tijdens S1-S1-stimulatie, terwijl wild-type harten niet werden beïnvloed. Analyse van tachy-aritmie suggereerde dat zowel wildtype- als CPVT-harten normale geleiding vertonen tijdens een burst-tempo van 50 hertz bij baseline. Na overdaad met isoproterenol vertoonden CPVT-harten hoogfrequente rotoren na een burst-pacing van 50 hertz, terwijl wild-type harten een normale geleiding behielden.Volgens deze procedure worden adogene types en wildtype muizen gebruikt om de elektrofysiologische en functionele eigenschappen in deze modellen of in de uitvinding van geneesmiddelen te illustreren. Optische mapping is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van hartritmestoornissen, maar het kan niet klinisch worden gebruikt vanwege de beperking van fluorescerende kleurstof onder de excitatiecontractie-ontkoppeling. Met de ontwikkeling van fluorescerende juiste voor verschillende doelmoleculen onder de ontwikkeling van rekentechnologie met hoge omwenteling, zal de cardiale optische mappingtechniek alleen toepassingen bereiken.

dual-dye-optical-mapping-hearts-from-ryr2r2474s-knock-mice

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel beschrijft een hoge temporele en ruimtelijke resolutie techniek om optisch image actie potentiaal beweging op het oppervlak van de Langendorff-geperfuseerde rattenharten met behulp van een potentiometrische kleurstof (di-8-ANEPPS).

Optisch in kaart brengen van Langendorff-geperfuseerde Rat Hearts

Dit rapport geeft een gedetailleerde beschrijving van de methodologie en de resultaten van gelijktijdige endocardiale en epicardiale optische in kaart brengen van de elektrische prikkeling in de intacte linker atrium van een Langendorff-doorbloed schapen hart tijdens stretch-geïnduceerde atriumfibrilleren.

High-Resolution endocardiale en epicardiale Optical Mapping in een Schaap Model van Stretch-Induced atriale fibrillatie

Dit artikel beschrijft de basisprocedures voor het uitvoeren van optische in kaart brengen van experimenten in de Langendorff-geperfuseerde konijn hart met behulp van het panoramische imaging systeem, en de dubbele (spanning en calcium) beeldvormende modaliteit.

Multiparametrische Optische kaart brengen van de Langendorff-geperfuseerde Rabbit Heart

Dit document beschrijft de dissectie procedure, instrumentale setup, en de experimentele omstandigheden tijdens de optische in kaart brengen van de transmembraan potentiaal (Vm) en intracellulair calcium van voorbijgaande aard (CAT) in intacte geïsoleerde Langendorff doorbloed muis harten.

Optische kaart brengen van actiepotentialen en Calcium Transiënten in de muis Hart

Dit artikel beschrijft de gedetailleerde protocol en de apparatuur die nodig is voor dual optische kaart brengen van transmembraan potentiaal (V m) en gratis intra-sarcoplasmatisch reticulum (SR) Ca 2+ in de Langendorff-doorbloed konijn hart. Deze methode maakt directe observatie en kwantificering van Vm en SR Ca 2+ dynamiek in het intacte hart.

Optische kaart brengen van Intra-sarcoplasmareticulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; En Transmembrane potentieel in de Langendorff-geperfuseerde Rabbit Heart

Hier presenteren we een protocol voor optische kaart brengen van de elektrische activiteit van de muis rechteratrium en vooral de sinusknoop, bij een hoge ruimtelijke en temporele resolutie.

Hoge-resolutie optische kaart brengen van de Muis sinusknoop

Dit protocol beschrijft de elektrofysiologische evaluatie van lymfkliertest atria met behulp van een optische mapping systeem met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie, met inbegrip van dubbele opnamen van de membraan spanning en Ca2 + voorbijgaande onder geprogrammeerd stimulatie door middel van een speciale elektrode-katheter.

Elektrofysiologische beoordelingvan lymfkliertest Atria met hoge resolutie optische Mapping

We presenteren de methodologie voor het isoleren van Murine myocyten en het verkrijgen van spannings-of calcium sporen tegelijk met sarcomere inkorten van sporen met fluorescentie fotometrie met gelijktijdige metingen van digitale cellen geometrie.

Optische beeldvorming van geïsoleerde Murine ventriculaire Myocyten

Dit protocol beschrijft de procedure voor het doorsnijden en kweken van menselijke cardiale plakjes voor preklinische geneesmiddelentesten en beschrijft het gebruik van optische mapping voor het opnemen van transmembranespanning en intracellulaire calciumsignalen gelijktijdig van deze plakjes.

Preklinische Cardiale Elektrofysiologie Beoordeling door Dual Voltage en Calcium Optical Mapping van human organotypic cardiale plakjes

Dit werk rapporteert een methode voor het regelen van het hartritme van intacte muizen van transgene channelrhodopsine-2 (ChR2) muizen met behulp van lokale fotostimulatie met een micro-LED-array en gelijktijdige optische mapping van epicardiale membraanpotentiaal.

Geavanceerd hartritmebeheer door toepassing van optogenetische multi-site fotostimulatie in muizenharten

Leer dual-dye optische mapping voor cardiale elektrofysiologie bij CPVT muizen. Deze methode registreert gelijktijdig membraanpotentiaal en calciumsignalen om aritmieën te bestuderen.

Dual-Dye optische mapping van harten van RyR2^R2474S Knock-in muizen van catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie

Meer video's verkennen