Gebruik van referentiereagentia om de robuustheid van cytokine-afgiftetests te bevestigen voor de voorspelling van de veiligheid van monoklonale antilichamen

Het testen van de veiligheid van nieuwe geneesmiddelen is van cruciaal belang en dit protocol beschrijft hoe gevalideerde standaarden kunnen worden gebruikt om de reproduceerbaarheid, robuustheid en mogelijke beperkingen van een CRS-platform te beoordelen. Deze techniek is gevalideerd met deze reagentia in 11 verschillende laboratoria en een internationale samenwerkingsstudie met vergelijkbare responspatronen is waargenomen, waardoor de inspanningen op het gebied van harmonisatie en reproduceerbaarheid zijn verbeterd. Toepassingen van deze techniek strekken zich uit tot verbeterde CRS-risicotesten van nieuwe therapeutische antilichamen, en het zal ook helpen om klaar te zijn voor de klinische behandeling van mogelijke bijwerkingen.

Dit werk is bedoeld om de reproduceerbaarheid en harmonisatie te verbeteren, en een visuele demonstratie vergroot de kans op reproduceerbaarheid. Begin met het reconstitueren van de inhoud van de referentiereagensampullen in één milliliter steriel gedestilleerd water en laat 5 tot 10 minuten rehydratatie. Meng vervolgens elke antilichaamoplossing op de juiste manier voordat u deze overbrengt naar een steriel buisje met dop.

Verdun vervolgens elk gereconstitueerd antilichaam en testantilichaam tot 10 microgram per milliliter in steriel PBS. Neem een steriele, niet-TC-behandelde, U-bodem polypropyleen 96-well microtiterplaat en voeg 100 microliter van de gewenste verdunde antilichaamoplossing toe aan de aangewezen putjes van de plaat. Incubeer de plaat vervolgens een nacht bij vier graden Celsius voordat u de vastefase-test uitvoert.

Nadat u minimaal 30 milliliter perifeer volbloed in een gehepariniseerde buis hebt verzameld, keert u deze meerdere keren om om ervoor te zorgen dat het bloedmonster op de juiste manier wordt gemengd met natriumheparine. Zet 15 milliliter van het volbloedmonster opzij in een aparte buis voor later gebruik in de waterige fase volbloedtest. Verdun de resterende 15 milliliter volbloed door een gelijk volume PBS- of serumvrije RPMI 1640-media toe te voegen.

Breng het verdunde bloed voorzichtig aan op de bovenkant van 15 milliliter van een dichtheidsgradiëntmedium in een tube van 50 milliliter. Centrifugeer de buis met behulp van een uitzwenkbare rotor zonder rem en een verminderde acceleratie bij 500 G en kamertemperatuur gedurende 20 minuten om het bloed in zijn verschillende componenten te scheiden. Na centrifugatie zal de dichtheidsgradiënt zich scheiden als een toplaag plasma, gevolgd door een dunne laag buffy-laag met PBMC's en een onderste laag met RBC's en polymorfonucleaire granulocyten, waaronder neutrofielen en eosinofielen.

Verwijder voorzichtig de bovenste plasmalaag, gevolgd door de volgende laag, om de PBMC's te oogsten. Voor het wassen, suspendeer de geoogste buffy coat in 10 milliliter PBS of serumvrije RPMI 1640 media. Centrifugeer de buis en begin bij 500 G gedurende 10 minuten om de cellen te pelleteren.

Gooi het bovenstaande weg en herhaal het wassen opnieuw. Resuspendeer vervolgens de resulterende pellet in twee milliliter complete RPMI-media. Tel cellen met behulp van een hemocytometer en pas de PBMC-concentratie aan tot 1 miljoen cellen per milliliter in volledige RPMI.

Neem voor de test voor de afgifte van cytokines in de waterfase het volbloedmonster dat eerder opzij is gezet, voeg 190 microliter van het monster toe aan de putjes van een 96-well U-bodem polystyreenplaat, warmtebehandelingsantilichamen en referentiereagentia voorverdund tot 100 microgram per milliliter in PBS, en voeg 10 microliter van het gewenste verdunde antilichaam toe aan de aangewezen putjes die 190 microliter volbloed bevatten. Incubeer de plaat gedurende 48 uur in een bevochtigde broedmachine bij 37 graden Celsius. Voor de vastefase-PBMC-cytokine-afgiftetest verkrijgt u de eerder voorbereide gecoate platen.

Gooi met behulp van een meerkanaalspipet de antilichaamoplossing van de gecoate platen. Nadat u een reagensreservoir met PBS hebt gevuld, wast u de plaat drie keer met 200 microliter PBS om ongebonden monoklonale antilichamen te verwijderen. Voeg 200 microliter van de eerder bereide PBMC-suspensie toe aan elk putje.

Incubeer de plaat gedurende 48 uur in een bevochtigde broedmachine bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Na de incubatie van 48 uur met monoklonale antilichamen onder controle en test, centrifugeert u de platen gedurende vijf minuten bij 400 G. Verzamel het celgeconditioneerde medium of plasma zonder de celpellet te verstoren.

Vries het verzamelde bovenmiddel of plasma in bij min 20 graden Celsius. De PBMC-testresultaten in vaste fase toonden aan dat de positieve controle-antilichamen significant hoge niveaus van cytokinen induceerden in vergelijking met de gematchte isotypecontroles. Er werd ook waargenomen dat anti-CD28-superagonist een significant hogere verandering van de afgifte van interleukine-2 of IL-2 induceerde dan het gematchte isotype, terwijl anti-CD3 en anti-CD52, hoewel ze nog steeds IL-2-expressie induceerden, resulteerden in lagere vouwveranderingen.

In de waterige fasetest met volbloed was het niveau van detecteerbare cytokinen relatief lager dan in de vastefasetest, maar werd gekenmerkt door een grotere gevoeligheid voor stimulatie door anti-CD52.