Opheldering van het metabolisme van 2,4-dibroomfenol in planten

Planteneeltcultuur biedt een oplossing voor de nauwkeurige, efficiënte en snelle evaluatie van metabole afbraak van xenobiotica in planten. Planteneeltcultuur kan microbioom- of schimmelinterferentie en fotochemische afbraak uitsluiten, het matrixeffect van intacte planten vereenvoudigen, de teeltomstandigheden standaardiseren, de behandelingsduur verkorten en minder experimentele inspanning vereisen. De hier voorgestelde methode kan inzicht geven in het opnamegedrag en de metabolische mechanismen van verschillende organische verontreinigende stoffen op gewassen en is nuttig voor inspanningen op het gebied van milieurisicobeoordelingen.

Om te beginnen, autoclaaf alle apparatuur en voer alle bewerkingen uit in een UV-gesteriliseerde ultra schone werkbank. Steriliseer het vernaliseerde zaadoppervlak met 75% ethanol gedurende 20 minuten. Spoel ze drie keer af met steriel gedeïoniseerd water en steriliseer ze opnieuw met 20% waterstofperoxide gedurende 20 minuten.

Na het wassen van de zaden met gesteriliseerd gedeïoniseerd water zes keer, ontkiem ze aseptisch door te zaaien op autoclaver, hormoonvrij Murashige en Skoog medium van pH 5,8 met 1% agargel en incubeer bij 26 graden Celsius met 16 uur fotoperiode gedurende 15 dagen. Snijd na 15 dagen zaadincubatie de hypocotyl en zaadlob van de zaailing in kleine stukjes van 0,5 centimeter om de explantaten te verkrijgen. Transformeer de explantaten in een petrischaaltje met 15 tot 20 milliliter geautoclaveerde Murashige en Skoog medium aangevuld met Oxymon en Phycocyanine en incubeer in het donker bij 26 graden Celsius gedurende drie tot vier weken om het eelt op te wekken.

Scheid met behulp van een steriel scalpel en een tang de eelt van ongeveer een centimeter diameter gevormd van de eerste explantaten. Los voor de behandeling 2, 4-dibroomfenol op in 10 milliliter aseptische vloeistof Murashige en Skoog medium. Voeg vervolgens drie gram gescheiden worteleelt toe aan de bereide 2, 4-dibroomfenoloplossing.

Nadat u het medium in blanco controle hebt voorbereid zoals beschreven in het manuscript, incubeer u alle kolven in het donker. Om het monster te bereiden, scheidt u het eelt zorgvuldig van de 2, 3-dibroomfenolbehandeling en controlekolven door filtratie met glasvezelfilters van 0,45 micron. Was het eelt drie keer met ultrapuur water voordat je het verzamelt.

Vriesdroog al het verzamelde eelt en homogeniseer 0,2 gram gedroogd eelt met een high throughput weefselmolen op 70 hertz gedurende drie minuten. Gebruik een glazen microspuit om gedurende één minuut 50 microliter surrogaat gedeutereerd 4-n-nanofenol toe te voegen aan de gehomogeniseerde callus en vortex. Voeg vijf milliliter van de oplossing met een gelijke verhouding van methanol en water toe aan de puntige callus en soniceer deze gedurende 30 minuten om de 2, 4-dibroomfenol en metabolieten te extraheren.

Na extractie, centrifugeer de suspensie bij 8.000 G bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten en verzamel het supernatant door pipetteren. Laat het extract door hydrofiele lipofiele gebalanceerde vastefase-extractie of HLB-SPE-patroon met een stroomsnelheid van één milliliter per minuut lopen. Verdun de analyten door zes milliliter methanol door de HLB-SPE-patroon te leiden.

Concentreer vervolgens het verkregen eluent tot één milliliter onder een zachte stroom stikstofgas voor instrumentele analyse. Open voor analyse de deur van de kolomverwarming. Installeer vervolgens de ultraperformante vloeistofchromatografiekolom door de kolominlaat aan te sluiten op de injectieklep en de uitlaat op de inlaat van de massaspectrometer.

Steek het uiteinde van de oplosmiddelbuizen A en B in de overeenkomstige oplosmiddelflessen. Plaats de injectieflacons met serienummer op de overeenkomstige plaatsen van de monsterbakken en plaats de monsterbakken opnieuw in de monsterkamer. Klik in het softwarevenster op Instrument en vervolgens op Inlaatmethode om de voorwaarden voor het vloeistofchromatogram te bewerken.

Selecteer MS-methode en stel de parameters van massaspectrumanalyse in. Klik op Bestand en vervolgens op Nieuw om de database te maken en een naam te geven. Laad het hierboven gemaakte voorbeeldprogramma door MS File te selecteren, gevolgd door Inlet File en Inject Volume.

Sla de database op in de voorbeeldmap van het project door op Bestand en opslaan te klikken. Selecteer vervolgens Uitvoeren en starten in het hoofdvenster van de software en klik op Voorbeeldgegevens verkrijgen, gevolgd door de knop OK in de startvoorbeeldlijst om gegevens te verzamelen. Om de gegevens te verwerken, selecteert u de rij met doelgegevens en klikt u op het chromatogramvenster om het MS-scanchromatogram te bekijken.

Klik in het chromatogramvenster op Display, gevolgd door TIC. Nadat u op de scangolf DS hebt geklikt, voegt u trace en OK toe om de dochtermassaspectracan te krijgen. Het chromatogram van 2, 4-dibroomfenol-behandeld worteleeltextract toonde de aanwezigheid van acht verschillende metabolieten in vergelijking met de controlemonsters.

Bovendien duidt de afwezigheid van ouder 2, 4-dibroomfenolpiek uit het chromatogram op het snelle metabolisme van 2, 4-dibroomfenol in de worteleelt onder experimentele omstandigheden. Bovendien leidde 2, 4-dibroomfenol geïncubeerd in wortel callus tot de vorming van metabolieten door directe conjugatie met glucose en aminozuren. Alle apparatuur en het Murashige- en Skoog-medium moeten worden geautoclaveerd om ervoor te zorgen dat de differentiatie en het onderhoud van de planteelt onder aseptische omstandigheden worden uitgevoerd.

Omics-benaderingen die deze procedure volgen, maken het mogelijk om een duidelijk fytotoxisch mechanistisch beeld van milieuverontreinigende stoffen te creëren.