Efficiënte vascularisatie van nierorganoïden door intracelomische transplantatie in kippenembryo's

In vitro gekweekte nierorganoïden blijven onvolgroeid, waardoor hun toepasbaarheid wordt beperkt. En deze methode van intracoelomale transplantatie induceert vascularisatie en verbetert de rijping van de organoïden. De procedure is zeer efficiënt, waardoor de transplantatie en analyse van een groot aantal organoïden in één experiment mogelijk is.

Na het bereiden van HIPSC-afgeleide nierorganoïden en het incuberen van de bevruchte leghorn-eieren creëer je een venster in de eierschaal op dag drie van de incubatie. Plaats een klein stukje transparante tape op de puntige punt van het ei. Maak een klein gaatje in de eierschaal in het midden van de transparante tape door erop te tikken met het scherpe uiteinde van een ontleedschaar.

Steek vervolgens een naald van 19 gauge op een spuit van vijf milliliter in het gat in een hoek van 45 graden. Zuig twee tot drie milliliter albumine uit het ei om het embryo in het ei te laten zakken. Verberg het gat met een tweede stuk transparante tape en plaats vervolgens een groot stuk transparante tape op het potlood dat naar boven is gericht op de kant van het ei.

Maak een gat in de eierschaal in het midden van de transparante tape door erop te tikken met het scherpe uiteinde van een ontleedschaar. Knip een klein cirkelvormig venster in de eierschaal uit dit gat met een gebogen ontleedschaar. Kijk door dit venster om het embryo te lokaliseren.

Vergroot vervolgens het venster om de toegang tot het embryo te optimaliseren. Verwijder grote stukken eierschaal die mogelijk bovenop het embryo zijn gevallen met een tang. Verwijder kleinere stukjes door een paar druppels DPBS met calcium en magnesium op het embryo te plaatsen met een plastic transferpipet en vervolgens de DPBS met de eierschaal in de pipet te zuigen.

Voeg met behulp van een plastic transferpipet drie druppels DPBS, aangevuld met 0,5% penicilline streptomycine toe aan het ei. Sluit het raam voorzichtig af met een groot stuk transparante tape voordat u het ei terug in de broedmachine plaatst tot dag vier van de incubatie. Knip de tape uit het raam met een gebogen ontleedschaar.

Leg het ei onder een ontleedmicroscoop op een rubberen houder of eierdoos. Het kippenembryo bevindt zich nu in Hamburger-Hamilton Stage 23 tot 24 en ligt op zijn linkerkant met zijn rechterkant naar de kijker gericht. Lokaliseer de rechtervleugel en beenknop van het embryo, omdat het coelom tussen deze twee ledemaatknoppen zal worden beoordeeld.

Maak in het gebied tussen de rechtervleugel en de beenknop achtereenvolgens een opening in het vitellinemembraan, het chorion en het amnion door ze vast te houden met twee paar ontleedtangen en ze voorzichtig in tegengestelde richtingen te trekken. Controleer of er onbelemmerde toegang is tot de coelomic holte. Pak de rand van de lichaamswand tussen de vleugel en de ledemaatknop voorzichtig vast met een tang en trek deze iets naar de kijker toe.

De coelomic holte moet duidelijk zichtbaar zijn. Steek voorzichtig een stomp maar slank instrument in de coelomic holte. Plaats een halve organoïde in het ei bovenop de allantois met behulp van een dura-dissector.

Gebruik een ontleedtang en pak voorzichtig de rand van de lichaamswand vast en trek deze iets naar de kijker toe om de opening naar het coelum zichtbaar te maken. Beweeg de organoïde voorzichtig naar en door de opening in de lichaamswand in het coelum met een stompe wolfraamdraad en een micro-scalpelhouder. Duw de organoïde iets craniaal om het in het coelum te plaatsen.

Het is nu zichtbaar net achter de vleugelknop. Voeg drie druppels DPBS toe aan het ei met behulp van een plastic transferpipet. Sluit het venster voorzichtig af met een groot stuk transparante tape voordat u het ei terug in de broedmachine plaatst tot dag 12 van de incubatie.

Knip de tape uit het raam met een gebogen ontleedschaar. Leg het ei onder een ontleedmicroscoop in een rubberen houder. Evalueer de vasculatuur en lokaliseer de aderen, die van de slagaders kunnen worden onderscheiden door hun iets helderdere rode kleur.

Om de toegang tot de vasculatuur te verbeteren, vergroot u het venster zorgvuldig door het te knippen met een gebogen ontleedschaar. Nadat u de ader hebt geselecteerd, steekt u de punt van de microcapillaire naald in de ader in een hoek van nul tot 20 graden. Zorg ervoor dat de naald in de ader zit door de punt voorzichtig van links naar rechts te bewegen.

Blaas voorzichtig en gestaag in het injectiesysteem om de lens culinaris agglutinine te injecteren. En plaats het ei 10 minuten terug in de broedmachine om het te laten circuleren. Leg het ei in een rubberen houder op de bank.

Knip vervolgens door de membranen rond het embryo met een gebogen ontleedschaar. Schep het embryo met een geperforeerde lepel uit het ei en onthoofd het embryo onmiddellijk met een schaar. Plaats onder de dissectiemicroscoop het lichaam van het embryo in een petrischaaltje.

Plaats het embryo op zijn rug in de petrischaal en spreid zijn ledematen. Open voorzichtig de buikwand van het embryo langs de lengteas met behulp van een tang. Lokaliseer de organoïde in het embryo.

De organoïde wordt meestal gehecht aan de rechter leverkwab, hetzij aan de vertroetelpunt of craniaal, net onder de ribbenkast. Het is dus raadzaam om te beginnen met het bekijken van deze locaties. Zodra de organoïde is gelokaliseerd, verwijdert u deze uit het embryo door er met een microschaar omheen te knippen.

Plaats de organoïde in het kippenweefsel dat er onvermijdelijk aan vastzit in een petrischaaltje onder de ontleedmicroscoop. Verwijder zoveel mogelijk kippenweefsel met een tweesnijdend roestvrijstalen scheermesje. Immunofluorescente beelden van een niet-getransplanteerde nierorganoïde en een getransplanteerde nierorganoïde bevatten beide glomerulaire en buisvormige structuren.

In de niet-getransplanteerde organoïden zijn enkele menselijke endotheelcellen aanwezig. In de getransplanteerde organoïde is een doordrenkt vasculair netwerk zichtbaar in de organoïde. Vergrote afbeeldingen van de verpakte gebieden tonen de drie soorten endotheelcellen die kunnen worden onderscheiden in getransplanteerde organoïden: geperfuseerde menselijke endotheelcellen, niet-geperfuseerde menselijke endotheelcellen en geperfuseerde van kip afgeleide endotheelcellen.

In niet-getransplanteerde organoïden omringen endotheelcellen glomerulaire structuren, maar dringen ze niet binnen. In getransplanteerde organoïden worden glomerulaire structuren echter gevasculariseerd door geperfuseerde haarvaten. Getransplanteerde organoïden kunnen worden geanalyseerd met behulp van verschillende technieken, afhankelijk van het doel van het experiment.

Directe vergelijking met niet-getransplanteerde controles kan inzicht geven in het proces van vascularisatie en rijping.