Name: Een eenvoudige techniek om locomotorische activiteit in Drosophila te testen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Leer een eenvoudige methode om locomotorische activiteit in Drosophila te evalueren met behulp van open-source software Fiji. Deze techniek maakt kwantitatieve analyse van snelheid en afstand mogelijk voor gedragsonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een speciaal lanceringsfonds van Soochow University en de National Science Foundation of China (NSFC) (82171414). We bedanken prof. Chunfeng Liu's lableden voor hun discussie en commentaar.

W1118 volwassen vliegen en derde instar larven werden gebruikt voor de huidige studie.
1. Experimentele voorbereiding
OPMERKING: Een open-veld arena voor Drosophila locomotion tracking is gemaakt metacolorless en geurloze silicagel.
<ol><li>Meng reagens A en reagens B in een verhouding van 1:10, volgens de instructies van de fabrikant voor de silicakit (zie materiaaltabel). Zorg ervoor dat natriumbicarbonaat aan het mengsel wordt toegevoegd door te roeren totdat de kleur wit wordt. Breng het mengsel over in een schone petrischaal en plaats het in een oven op 40 °C om gedurende 48 uur te drogen.</li>
	<li>Plaats de HD-camera (zie Materiaaltabel) op een statief en stel deze zo in dat de cameralens loodrecht op het oppervlak van de silica-arena staat. Door de brandpuntsafstand en de diafragma's van de camera aan te passen, moet u ervoor zorgen dat de camera op het oppervlak van het silica is gericht en dat het display voldoende wordt verlicht. De experimentele opzet wordt geïllustreerd in figuur 1.</li>
	<li>Breng een vlieg over in de open arena om een continue video van ten minste 61 s op te nemen. OPMERKING: Gezien de trage aard van larven, wordt een video-opnametijd van meer dan 10 minuten aanbevolen.<ol><li>Open de video met Fiji, sleep de voortgangsbalk naar het beginframe en keur stilzwijgend goed. Kies het hele lichaam van de vlieg met behulp van het gereedschap "selectie uit de vrije hand" (figuur 2B, C).</li>
		<li>Klik op de afbeelding > pas > helderheid en contrast aan om de witbalans aan te passen totdat de grijswaarde van het geselecteerde gebied de brede achtergrond nadert (figuur 2D-F). OPMERKING: Achtergrondhomogenisatie van het eerste frame stelt de software in staat om de achtergrond zonder objecten te onderscheiden en een contrast te creëren wanneer een vlieg aanwezig is, waardoor de software deze kan volgen.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer het hele experiment uit in een testomgeving die is ingesteld op 25 °C en 60% relatieve vochtigheid, in een ruimte die stil is en verstoken van blootstelling aan fel licht.</li>
</ol>2. Video-opname en voorbewerking
<ol><li>Na een korte periode van anesthesie met behulp van95% koolstofdioxide (CO2), breng je een vlieg over naar de open arena en druk je op de opnameknop op de cameratoepassing om de video-opname te starten. OPMERKING: Om het effect van de verdoving op de voortbeweging te minimaliseren, laat u de vliegen 10 minuten herstellen voordat u de video-opname start. Koel-verdoving door koelen wordt ook aanbevolen.<ol><li>Zodra de vliegen herstellen van de anesthesie, plaatst u de arenaschotel met de vlieg onder de camera en schudt u de plaat snel van links naar rechts om ervoor te zorgen dat de vlieg in beweging is wanneer de opname begint.</li>
	</ol></li>
	<li>Druk na voltooiing van de opname op de stopknop om de video-opname te beëindigen. OPMERKING: Zorg ervoor dat de video-opnametijd de tijd voor het volgen van de bestemming met een kleine marge iets overschrijdt. Om de experimentele efficiëntie te verbeteren, is het bovendien mogelijk om meerdere vliegen spontaan te volgen. Dit is afhankelijk van de resolutie van de camera om een video-uitsnede van hoge kwaliteit mogelijk te maken.</li>
	<li>Converteer de opgenomen video's naar AVI-formaat met MJPEG-codering, zodat ze kunnen worden geopend en geanalyseerd met Fiji. Stel ondertussen de frames per seconde (fps) snelheid van de video in op 15 fps voor volwassen vliegen en 12 fps voor larven.</li>
</ol>3. Video-analyse
<ol><li>Open de video die is getransformeerd met "gebruik virtuele stapel" en "converteren naar grijswaarden", twee opties in het pop-upvenster bij het openen van de video met Fiji (figuur 2A).</li>
	<li>Maak een leeg eerste frame, zoals hierboven vermeld.</li>
	<li>Verkrijg een verwerkingsvenster met behulp van de tool "actieve afbeelding instellen" van de AnimalTracker-plug-in en maak een trackinggebied dat de arena in het oorspronkelijke videovenster omcirkelt met behulp van het gereedschap "ovaal" (figuur 3A).</li>
	<li>Stel de filters (Figuur 3A,3) en de parameters van de twee filters (Figuur 4A-G) in voor het eerste lege frame in het verwerkingsvenster. Selecteer vervolgens het volgende frame in het originele videovenster en kies het gefilterde oppervlak van het verwerkingsvenster (figuur 5A-C). OPMERKING: De filterstap dient om beeldruis te verminderen en/of de achtergrond te verwijderen, waardoor het eenvoudiger wordt om de voorgrond van de achtergrond te scheiden in de binarisatie van de frames.</li>
	<li>Zodra een gefilterd verwerkingsvenster is geselecteerd, draait u de gevolgde vlieg met een rood profiel bedekt in het verwerkingsvenster met behulp van het gereedschap "drempel instellen" (figuur 3A,4, figuur 5D-E en figuur 6A).</li>
	<li>Gebruik de "set blob-detector" om de computer de vlieg te laten herkennen met een rood profiel bedekt in het verwerkingsvenster (figuur 3A,5 en figuur 6B).</li>
	<li>Stel frame 901 in als het laatste frame voor de volwassen vlieg, berekend op basis van de opnameduur en fps van de video (figuur 3A,6, figuur 6C). OPMERKING: Het volgende experiment met larven is gedurende 10 minuten gevolgd, dus frame 7200 is ingesteld als het laatste frame.</li>
	<li>Gebruik het gereedschap "blobs weergeven" om een trackingrechthoek in het oorspronkelijke videovenster weer te geven (figuur 3A,7 en figuur 6D,E). Start vervolgens de tracking en exporteer het trackingbestand nadat de monitoring is voltooid (figuur 3A,8,9 en figuur 7A,B).</li>
</ol>4. Bestandsanalyse bijhouden
<ol><li>Laad de track- en zonebestanden met de plug-in Animal tracker > Tracking analyzer (Figuur 8A).</li>
	<li>Selecteer de gewenste index met behulp van zone-instellingen en wijzig de parameterinstellingen (Afbeelding 8). Bereken de tijd van het frame-interval met behulp van de framesnelheid. OPMERKING: In deze situatie is de framesnelheid 15 fps en is het frame-interval ongeveer 0,067 s, wat de standaardinstelling is (Figuur 8D).</li>
	<li>Produceer de kwantitatieve analysegrafieken met behulp van de spreadsheetsoftware en GraphPad Prism na analyse in tracking analyzer (figuur 9).</li>
</ol>5. Analyse per frame
<ol><li>Voer snelheidsanalyses uit per frame-interval. Analyseer het trackbestand zonder Fiji als er meer gedetailleerd onderzoek nodig is.<ol><li>Open het trackbestand, kopieer alle coördinaten naar Microsoft Office Excel en splits de cellen met de spatietoets. OPMERKING: Zodra het bestand bijvoorbeeld is verdeeld in de kolommen "C" en "D", wordt de snelheid van Drosophila per frame-interval berekend met de formule SQRT((C5-C4)^ 2+(D5-D4)^2), die wordt weergegeven in de kolom "E" (Figuur 10A). De gegevens in kolom "E" geven het aantal pixels aan dat de vlieg tussen twee frames heeft verplaatst, waarbij het eerste frame niet in aanmerking wordt genomen. Selecteer alle berekende resultaten en voeg een lijndiagram in om een intuïtieve vliegbewegingssnelheid per frame-interval weer te geven, met een piek in het lijndiagram (figuur 10B).</li>
	</ol></li>
	<li>Bereken de immobiliteitstijd per frame-interval. Nadat het bestand is gesplitst in de kolommen "C" en "D", berekent u de immobiliteitsstatus van Drosophila per frame-interval met behulp van de formule ALS(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2) <20, 0, 1), die wordt weergegeven in de kolom "E". (Figuur 10C). OPMERKING: In tegenstelling tot snelheidsanalyse werden de resultaten van het eerste frame gedefinieerd. Vliegen die minder dan 20 pixels bewogen, werden als onbeweeglijk beschouwd en geregistreerd als "0" in kolom "E".<ol><li>Selecteer alle berekende resultaten en voeg een kolomdiagram in om de immobiliteitstijd visueel weer te geven met de marge van het hele kolomdiagram (figuur 10D).</li>
	</ol></li>
	<li>Zorg ervoor dat de hoek van richting verandert. OPMERKING: De analyse van de hoek van de richtingsverandering vertegenwoordigt de richtingskeuze van de vliegen. Zodra het bestand is gesplitst in de kolommen "C" en "D", wordt de hoek van richtingsverandering berekend met de formule ACOS(((SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2))^2+(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))^2-(SQRT((C7-C5)^2+(D7-D5)^2))^2)/(2*SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))*(SQRT((C7-C6)^ 2+(D7-D6)^2)))*180/PI(), die wordt weergegeven in de kolom "E" (Figuur 10E). De berekende resultaten geven de hoek tussen drie coördinaten aan.<ol><li>Selecteer alle berekende resultaten en voeg een spreidingsdiagram in om de richtingshoek van de beweging van de vliegen te illustreren (figuur 10F).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Ham, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+UCHL1+rescues+the+defects+related+to+Parkinson%27s+disease+by+suppressing+glycolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Loss of UCHL1 rescues the defects related to Parkinson's disease by suppressing glycolysis.</a> Science Advances. 7 (28), (2021).</li>
<li>Algarve, T. D., Assmann, C. E., Aigaki, T., da Cruz, I. B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parental+and+preimaginal+exposure+to+methylmercury+disrupts+locomotor+activity+and+circadian+rhythm+of+adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Parental and preimaginal exposure to methylmercury disrupts locomotor activity and circadian rhythm of adult Drosophila melanogaster.</a> Drug and Chemical Toxicology. 43 (3), 255-265 (2020).</li>
<li>Jones, M. A., Grotewiel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+age-related+impairment+in+locomotor+and+other+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors.</a> Experimental Gerontology. 46 (5), 320-325 (2011).</li>
<li>Yamaguchi, M., Yoshida, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model organism.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 1-10 (2018).</li>
<li>Rothenfluh, A., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs%2C+files%2C+and+videotape%3A+the+effects+of+ethanol+and+cocaine+on+Drosophila+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Drugs, files, and videotape: the effects of ethanol and cocaine on Drosophila locomotion.</a> Current Opinion in Neurobiology. 12 (6), 639-645 (2002).</li>
<li>Tsuda, L., Lim, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease+model+system+using+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease model system using Drosophila.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 25-40 (2018).</li>
<li>Dung, V. M., Thao, D. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease model.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 41-61 (2018).</li>
<li>Liguori, F., Amadio, S., Volonte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fly+for+ALS%3A+Drosophila+modeling+on+the+route+to+amyotrophic+lateral+sclerosis+modifiers%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fly for ALS: Drosophila modeling on the route to amyotrophic lateral sclerosis modifiers.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (17-18), 6143-6160 (2021).</li>
<li>Cao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+rapid+iterative+negative+geotaxis+assay+for+analyzing+adult+climbing+behavior+in+a+Drosophila+model+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An automated rapid iterative negative geotaxis assay for analyzing adult climbing behavior in a Drosophila model of neurodegeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), 56507(2017).</li>
<li>Eidhof, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+locomotor+behavior+in+the+Drosophila+island+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of locomotor behavior in the Drosophila island assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), 55892(2017).</li>
<li>Scaplen, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+real-time+quantification+of+group+locomotor+activity+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Automated real-time quantification of group locomotor activity in Drosophila melanogaster.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4427(2019).</li>
<li>Werkhoven, Z., Rohrsen, C., Qin, C., Brembs, B., de Bivort, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MARGO+%28Massively+Automated+Real-time+GUI+for+Object-tracking%29%2C+a+platform+for+high-throughput+ethology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MARGO (Massively Automated Real-time GUI for Object-tracking), a platform for high-throughput ethology.</a> PLoS One. 14 (11), e0224243(2019).</li>
<li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+iterative+negative+geotaxis+%28RING%29%3A+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Experimental Gerontology. 40 (5), 386-395 (2005).</li>
<li>Cichewicz, K., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ShinyR-DAM%3A+a+program+analyzing+Drosophila+activity%2C+sleep+and+circadian+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms.</a> Communications Biology. 1, 25(2018).</li>
<li>McParland, A. L., Follansbee, T. L., Ganter, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+larval+activity+in+the+Drosophila+activity+monitor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measurement of larval activity in the Drosophila activity monitor.</a> Journal of Visualized Experiments. 98, e52684(2015).</li>
<li>Walter, T., Couzin, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRex%2C+a+fast+multi-animal+tracking+system+with+markerless+identification%2C+and+2D+estimation+of+posture+and+visual+fields%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">TRex, a fast multi-animal tracking system with markerless identification, and 2D estimation of posture and visual fields.</a> eLife. 10, (2021).</li>
<li>Maia Chagas, A., Prieto-Godino, L. L., Arrenberg, A. B., Baden, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%E2%82%AC100+lab%3A+A+3D-printable+open-source+platform+for+fluorescence+microscopy%2C+optogenetics%2C+and+accurate+temperature+control+during+behaviour+of+zebrafish%2C+Drosophila%2C+and+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">The €100 lab: A 3D-printable open-source platform for fluorescence microscopy, optogenetics, and accurate temperature control during behaviour of zebrafish, Drosophila, and Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biology. 15 (7), e2002702(2017).</li>
<li>Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+assay+Drosophila+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Methods to assay Drosophila behavior.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).</li>
<li>Xiao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+assay+the+behavior+of+Drosophila+melanogaster+for+toxicity+study%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods to assay the behavior of Drosophila melanogaster for toxicity study.</a> Methods in Molecular Biology. 2326, 47-54 (2021).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Johnson, M. E., Bobrovskaya, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+the+rotenone+models+of+Parkinson%27s+disease%3A+their+ability+to+reproduce+the+features+of+clinical+disease+and+model+gene-environment+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">An update on the rotenone models of Parkinson's disease: their ability to reproduce the features of clinical disease and model gene-environment interactions.</a> Neurotoxicology. 46, 101-116 (2015).</li>
<li>Coulom, H., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+exposure+to+rotenone+models+sporadic+Parkinson%27s+disease+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (48), 10993-10998 (2004).</li>
<li>Kumar, P. P., Bawani, S. S., Anandhi, D. U., Prashanth, K. V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotenone+mediated+developmental+toxicity+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Rotenone mediated developmental toxicity in Drosophila melanogaster.</a> Environmental Toxicology and Pharmacology. 93, 103892(2022).</li>
<li>Gulyas, M., Bencsik, N., Pusztai, S., Liliom, H., Schlett, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AnimalTracker%3A+an+ImageJ-based+tracking+API+to+create+a+customized+behaviour+analyser+program%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">AnimalTracker: an ImageJ-based tracking API to create a customized behaviour analyser program.</a> Neuroinformatics. 14 (4), 479-481 (2016).</li>
<li>Qu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EasyFlyTracker%3A+a+simple+video+tracking+Python+package+for+analyzing+adult+Drosophila+locomotor+and+sleep+activity+to+facilitate+revealing+the+effect+of+psychiatric+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">EasyFlyTracker: a simple video tracking Python package for analyzing adult Drosophila locomotor and sleep activity to facilitate revealing the effect of psychiatric drugs.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 15, 809665(2022).</li>
<li>Yarwais, Z. H., Najmalddin, H. O., Omar, Z. J., Mohammed, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+data+collection+of+Drosophila+movement+behaviour+assays+using+computer+vision+in+Python%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Innovative+Approaches+in+Science+Research%22%5BJournal%5D)">Automated data collection of Drosophila movement behaviour assays using computer vision in Python.</a> International Journal of Innovative Approaches in Science Research. 4 (1), 15-22 (2020).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

We hebben een methode ontworpen, gebaseerd op het open-source materiaal AnimalTracker API compatibel met het Fiji-beeldverwerkingsprogramma, waarmee onderzoekers systematisch locomotorische activiteit kunnen evalueren door zowel volwassen als individuele larvale vliegen te volgen. AnimalTracke is een tool geschreven in Java die eenvoudig kan worden geïntegreerd in bestaande databases of andere tools om de analyse van door de toepassing ontworpen gedrag van het volgen van dieren te vergemakkelijken<sup c...

Drosophila melanogaster biedt een uitstekend modelorganisme voor het onderzoeken van cellulaire en moleculaire functies in neuronale ziektemodellen gemaakt door genmodificatie1, medicamenteuze behandeling2 en senescentie3. Het hoge behoud van biologische routes, fysieke eigenschappen en ziekte-geassocieerde homologe genen tussen mensen en Drosophila maakt de fruitvlieg een ideale nabootsing van het moleculaire naar het gedragsniveau4. In veel ziektemodellen is gedragsdeficiëntie een belangrijke index, die een nuttig model biedt voor verschillende menselijke neuropathieën 5,6. Drosophila wordt nu gebruikt om meerdere menselijke ziekten, neurologische ontwikkeling en neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Parkinson en amyotrofische laterale sclerose te bestuderen 7,8. Het detecteren van het motorisch vermogen van de ziektemodellen is cruciaal voor het begrijpen van de pathogene vooruitgang en kan een fenotypische correlatie bieden met de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan het ziekteproces.
Onlangs zijn commercieel beschikbare softwaretools en kosteneffectieve programma's ontwikkeld voor Drosophila locomotorische detectiestrategieën, zoals high-throughput testen in gegroepeerde vliegen 9,10 en het meten van voortbeweging in real-time11,12. Een dergelijke conventionele benadering is snelle interactieve negatieve geotaxis (RING), ook wel de klimtest genoemd, die meerdere kanalen omvat waarmee een grote vliegenpopulatie met hetzelfde geslacht en dezelfde leeftijd kan worden ingeperkt, waardoor variatie wordt verminderd terwijl gegevens 9,13 worden verzameld. Een andere pre-testmethode voor het analyseren van locomotorisch gedrag is TriKinetics Drosophila activity monitor (DAM), een apparaat dat meerdere bundels gebruikt om vliegactiviteitsbewegingen in een dunne glazen buiste detecteren 14. Het apparaat registreert continu de positie, wat de geautomatiseerde voortbeweging vertegenwoordigt door de balkkruisingen te berekenen om de activiteit en het circadiane ritme van vliegen over een langere periode te bestuderen15. Hoewel deze methoden op grote schaal zijn gebruikt bij het analyseren van gedragsdefecten bij fruitvliegen om veranderingen in gedragsvoortbeweging te bepalen, vereisen ze altijd speciale testapparatuur of complexe analyseprocessen en beperken ze hun toepassing in sommige modellen met een beperkt, eenvoudig apparaat. Diertraceringsgroepgebaseerde strategieën voor het testen van de volwassen Drosophila, zoals FlyGrAM11 en de Drosophila-eilandtest 10, implementeren sociale rekrutering en individuele tracking in een vooraf gedefinieerd gebied. Niettemin kan sociale individuele beperking in getrotseerde gebieden een negatief effect hebben op identificaties in de beelden, veroorzaakt door de botsing of overlapping van vliegen. Hoewel sommige op open-source materialen gebaseerde methoden, zoals TRex16, MARGO 12 en FlyPi17, een noodgeval hebben, kunnen ze de vliegen snel traceren met flexibel gebruik in gedragstests. Deze testbenaderingen worden geassocieerd met uitgebreide experimentele apparaatinstallaties, speciale softwarevereisten of professionele computertalen. Voor larven zijn het meten van de totale afgelegde afstand over het aantal rastergrenslijnen per tijdseenheid18, of het ruw tellen van de lichaamswandcontracties voor individuen handmatig19, de belangrijkste methoden om hun motorische vermogen te beoordelen. Vanwege het gebrek aan precisie in apparatuur of apparaten en analysemethoden, kan enige gedragsbeweging van larven aan detectie ontsnappen, waardoor het moeilijk wordt om gedragsbewegingen nauwkeurig te beoordelen, vooral fijne beweging15.
De huidige ontwikkelde methode maakt gebruik van de AnimalTracker application programming interface (API), compatibel met het Fiji (ImageJ) beeldverwerkingsprogramma, om systematisch de locomotorische activiteit van zowel volwassen als larvale vliegen te evalueren door hun trackinggedrag van high-definition (HD) video's te analyseren. Fiji is een open-source software ImageJ-distributie die robuuste softwarebibliotheken kan combineren met tal van scripttalen, wat resulteert in snelle prototyping van beeldverwerkingsalgoritmen, waardoor het populair is bij biologen vanwege de beeldanalysemogelijkheden20. In de huidige aanpak wordt de integratie van Fiji in de AnimalTracker API gebruikt om een unieke Drosophila-gedragstest te ontwikkelen met gepersonaliseerde algoritme-invoeging, en biedt een nuttige stap voor gedetailleerde documentatie en tutorials ter ondersteuning van robuuste analytische mogelijkheden van locomotorisch gedrag (figuur 1). Om de complicatie van objectieve identificaties in de beelden veroorzaakt door de botsing of overlapping van vliegen te omzeilen, is elke arena beperkt tot het hosten van slechts één vlieg. Na het beoordelen van de trackingprecisie van de aanpak, werd het geïmplementeerd om de locomotorische bewegingen van Drosophila te traceren en te kwantificeren die werden toegediend met het toxische medicijn rotenon, dat over het algemeen wordt gebruikt voor diermodellen van de ziekte van Parkinson, en uiteindelijk locomotiestoornissen ontdekte in de medicamenteuze behandeling21. Deze methodologie, die open-source en vrije software gebruikt, vereist geen dure instrumentatie en kan de gedragsbeweging van Drosophila nauwkeurig en reproduceerbaar analyseren.

<table><tbody><tr><td>Animal tracker</td><td>Hongaars hersenonderzoeksprogramma</td><td>versie: 1.7</td><td>officiële website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads</td></tr><tr><td>Camera software</td><td>Microsoft</td><td>versie: 2021.105.10.0</td><td>ingebouwd windows 10 systeem</td></tr><tr><td>Computer</td><td>DELL</td><td>Vostro-14-5480</td><td>een computer met win 10 systeem is beschikbaar</td></tr><tr><td>Drosophila kooldioxide anesthesie werkstation</td><td>Wu han Yihong technologie</td><td>#YHDFPCO2-018</td><td>officiële website: http://www.yhkjwh.com/</td></tr><tr><td>Fiji software</td><td>Fiji team</td><td>versie: 1.53v</td><td>officiële website: https://fiji.sc/</td></tr><tr><td>Format factory software</td><td>Pcfreetime</td><td>versie: X64 5.4.5</td><td>officiële website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html</td></tr><tr><td>Graph pad prism</td><td>GraphPad Software</td><td>versie: 8.0.2</td><td>officiële website: https://www.graphpad-prism.cn</td></tr><tr><td>Hight definition camera</td><td>TTQ</td><td>Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm)</td><td>officiële website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35</td></tr><tr><td>Office software</td><td>Microsoft</td><td>versie: office 2019</td><td>officiële website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office</td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>Bkman</td><td>110301003</td><td>maat: 60 mm</td></tr><tr><td>Silica gel</td><td>DOW</td><td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Goed mengen volgens de instructies</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Macklin</td><td>#144-55-8</td><td>Goed mengen met silica gel</td></tr></tbody></table>

een eenvoudige techniek om locomotorische activiteit in drosophila te testen

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

Drosophila melanogaster is een ideaal modelorganisme voor het bestuderen van verschillende ziekten vanwege de overvloed aan geavanceerde genetische manipulatietechnieken en diverse gedragskenmerken. Het identificeren van gedragsdeficiëntie in diermodellen is een cruciale maat voor de ernst van de ziekte, bijvoorbeeld bij neurodegeneratieve ziekten waarbij patiënten vaak stoornissen in de motorische functie ervaren. Met de beschikbaarheid van verschillende systemen om motorische tekorten in vliegmodellen te volgen en te beoordelen, zoals met geneesmiddelen behandelde of transgene personen, ontbreekt het echter nog steeds aan een economisch en gebruiksvriendelijk systeem voor nauwkeurige evaluatie vanuit meerdere hoeken. Een methode op basis van de AnimalTracker application programming interface (API) is hier ontwikkeld, die compatibel is met het Fiji-beeldverwerkingsprogramma, om systematisch de bewegingsactiviteiten van zowel volwassen als larvale individuen van opgenomen video te evalueren, waardoor de analyse van hun trackinggedrag mogelijk is. Deze methode vereist alleen een high-definition camera en een computerrandapparatuurintegratie om gedrag vast te leggen en te analyseren, waardoor het een betaalbare en effectieve aanpak is voor het screenen van vliegmodellen met transgene of omgevingsgedragsgebreken. Voorbeelden van gedragstests met farmacologisch behandelde vliegen worden gegeven om te laten zien hoe de technieken gedragsveranderingen bij zowel volwassen vliegen als larven op een zeer herhaalbare manier kunnen detecteren.

In deze studie werden locomotorische tekorten bij volwassen vliegen en derde instarlarven behandeld met rotenon onderzocht en vergeleken in hun motorische activiteit met die van een controlevlieg gevoed met het geneesmiddel oplosmiddel dimethylsulfoxide (DMSO). Van behandeling met rotenon in Drosophila is aangetoond dat het dopaminerge neuronverlies in de hersenenveroorzaakt 22 en leidt tot significante locomotorische tekorten23. Zoals te zien is in figuur <strong ...

Het huidige protocol beoordeelt de locomotorische activiteit van Drosophila door de beweging van vliegen in een handgemaakte arena te volgen en te analyseren met behulp van open-source software Fiji, compatibel met plug-ins om pixels van elk frame te segmenteren op basis van high-definition video-opname om parameters van snelheid, afstand, enz. Te berekenen.

Een eenvoudige techniek om locomotorische activiteit in Drosophila te testen

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and ...

De methode is gebaseerd op open source software om systematisch de lokale motorische activiteiten te evalueren voor het volggedrag van volwassen en de larven vliegen van opgenomen video. Deze methode vereist goedkope apparaatintegratie om gedrag vast te leggen en te analyseren, waardoor het een betaalbare en effectieve aanpak is voor het screenen van vliegbewegingen. Deze technologie wordt gebruikt om gedragsverandering te identificeren in een vliegmodel van menselijke ziekte met lokale bewegingsstoornissen, maar het is niet geschikt voor de behandeling van ziekten, handicaps of moeilijkheden.Het is essentieel om het relevante videovenster tijdens het analyseproces te wissen, namelijk het origineel en het verwerkende videovenster. Om te beginnen, meng reagens A en reagens B van de silicakit in een verhouding van één tot 10, volgens de instructies van de fabrikant, om de open veldarena voor te bereiden op het volgen van de voortbeweging van drosophila. Zet vervolgens de HD-camera op een statief en stel deze zo in dat de cameralens loodrecht op het oppervlak van de silica-arena staat.Open vervolgens de video met Fiji. Sleep de voortgangsbalk naar het oorspronkelijke frame en keur stilzwijgend goed. Kies het hele lichaam van de vlieg met behulp van de selectietool uit de vrije hand.Klik op afbeelding, pas aan en helderheid en contrast om de witbalans aan te passen totdat de grijswaarde van het geselecteerde gebied de brede achtergrond nadert. Breng de verdoofde vlieg over naar de open veldarena. Zodra de vlieg is hersteld van de anesthesie, plaatst u de arenaschaal met de vlieg onder de camera en schudt u deze snel van links naar rechts om ervoor te zorgen dat de vlieg in beweging is wanneer de opname begint.Druk op de opnameknop in de cameratoepassing om de video-opname te starten. Druk na voltooiing van de opname op de stopknop om de video-opname te beëindigen. Converteer de opgenomen video's naar AVI-formaat met M-J pagan-codering, zodat ze kunnen worden geopend en geanalyseerd met Fiji.Stel ook de frames per seconde van de video in op 15 fps voor volwassen vliegen en 12 fps voor larven. Om de video met Fiji te openen, selecteert u de twee opties, gebruikt u virtuele stapel en converteert u naar grijswaarden in het pop-upvenster. Verkrijg een verwerkingsvenster met behulp van de set active image tool van de animal tracker plug-in en maak een trackinggebied dat de arena omcirkelt in het originele videovenster, met behulp van het ovale gereedschap.Stel de filters en de parameters van de twee filters in voor het eerste lege frame in het verwerkingsvenster. Selecteer vervolgens het volgende frame in het originele videovenster en kies het gefilterde oppervlak van het verwerkingsvenster. Zodra een gefilterd verwerkingsvenster is geselecteerd, gebruikt u het gereedschap drempel instellen om de tractusvlieg te draaien met een rood profiel, bedekt in het verwerkingsvenster.Gebruik vervolgens de ingestelde blobdetector om de computer de vlieg te laten herkennen met een rood profiel, bedekt in het verwerkingsvenster. Stel het laatste kader in voor de volwassen vlieg of larven, zoals beschreven in het tekstmanuscript. Gebruik het gereedschap blobs weergeven om een traceerrechthoek in het oorspronkelijke videovenster weer te geven.Start de tracking en exporteer het trackingbestand nadat de bewaking is voltooid. Laad de track- en zonebestanden met behulp van de plug-in voor het volgen van dieren en het volgen van analysers. Selecteer de gewenste index met behulp van zone-instellingen en wijzig de parameterinstellingen.Bereken de tijd van het frame-interval met behulp van de framesnelheid. Produceer de kwantitatieve analysegrafieken met behulp van spreadsheetsoftware en grafiekblokprisma, nadat ze zijn geanalyseerd in de trackinganalysator. Open het trackbestand.Kopieer alle coördinaten naar Microsoft Office Excel en splits de cellen met de spatietoets. Als u de immobiliteitstijd per frame-interval wilt berekenen, selecteert u alle berekende resultaten en voegt u een kolomdiagram in om de immobiliteitstijd visueel weer te geven met de marge van het hele kolomdiagram. Als u de wijzigingen in de richtingshoek wilt illustreren, selecteert u alle berekende resultaten en voegt u een spreidingsdiagram in.Volwassen vliegen en derde Instar-larven, behandeld met Rotenone, hadden significante locomotorische tekorten in vergelijking met die van controlevliegen, gevoed met oplosmiddel DMSO. Kwantitatieve analyse van de Rotenone-behandeling bij volwassen vliegen toonde een significante afname van de afgelegde afstand en de gemiddelde snelheid. En een aanzienlijke toename van de immobiliteitstijd.Representatieve grafieken toonden minder pieken voor de bewegingssnelheid per frame-interval in vliegen gevoed met Rotenone in vergelijking met die in de controle, wat de ernst van het tekort aan locomotorische activiteit aangeeft. De instellings-immobiliteitskolom van verplaatste pixels per frame vertoonde ook aanzienlijk minder beweging binnen één minuut voor Rotenone gevoede vliegen, vergeleken met de controlevliegen. Representatieve grafieken die de bewegingshoek van richtingsveranderingen in Rotenone gevoerd en controledieren illustreren, onthulden ook veranderingen in de richting die door vliegen werd gekozen.Vergelijkbare resultaten werden waargenomen voor de derde Instar-larven. De resultaten toonden aan dat de gedragsbeweging van het volgen van larven gevoed met Rotenone aanzienlijk was aangetast in vergelijking met de controle. De meest cruciale stap in het analyseproces is het vormen van de eerste van een leeg frame, omdat het bewijst of de software effectief kan controleren.Met deze technologie kunnen onderzoekers dieper ingaan op het onderliggende mechanisme van meerdere defecten, zoals zenuw- of spierletsel.

a-simple-technique-to-assay-locomotor-activity-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Behavior

Gedrag

De studie van complexe locomotorisch gedrag...

Hoge-resolutie video-Tracking van Locomotion in Adult Drosophila melanogaster

We beschrijven de procedures voor de registratie van de dagelijkse bewegingsactiviteit ritmes...

Het testen van de locomotorische activiteit te circadiaanse ritmes Studie en parameters Sleep in Drosophila</em

Drosophila melanogaster is een genetisch en gedragsmatig soepel model systeem dat is gebruikt om de moleculaire en cellulaire basis van een groot aantal belangrijke biologische processen meer dan een eeuw een begrip. Drosophila goed is benut om inzicht te krijgen in de genetische basis van vlieg gedrag.

Methoden om Assay Drosophila Gedrag

Deze video beschrijft een eenvoudige methode om vliegbeweging te kwantificeren en toont de uitgevoerde klimtest.  De vliegklimtest is een algemene test van de motorische functie die afhankelijk is van een negatieve geotaxis-respons.

Fly Climbing Assay: een methode om algemene voortbeweging in Drosophila melanogaster te testen

Deze video beschrijft hoe je vrij lopende vliegen kunt volgen om hun algemene bewegingsvermogen te beoordelen. Het aanbevolen protocol demonstreert de installatie en gegevensanalyse van de test met behulp van videotrackingsoftware.

Vrij lopende vliegen volgen: een methode om voortbeweging in Drosophila te beoordelen

Deze video beschrijft het Drosophila activity monitor (DAM) systeem dat wordt gebruikt om de motorische activiteit te volgen. Onderzoekers gebruiken activiteitsgegevens verzameld van de DAM om circadiaanse ritmes bij fruitvliegen te bestuderen. De aanbevolen protocolclip laat zien hoe u vliegen in het apparaat laadt en activiteitsgegevens opneemt voor circadiane experimenten.

Drosophila Activity Monitor (DAM): een methode om de motorische activiteit bij vliegen te meten

Hier beschrijven we een methode voor een snelle en nauwkeurige meting van vliegprestaties in Drosophila, waardoor high-throughput screening.

Een verbeterde methode voor nauwkeurige en snelle meting van Vliegprestaties in<em&gt; Drosophila</em

Drosophila melanogaster zijn nuttig bij het ​​bestuderen van genetische of ecologische manipulaties die gedrag zoals spontane motorische activiteit beïnvloeden. Hier beschrijven we een protocol dat monitoren met infrarood stralen en data analyse software om spontane bewegingsactiviteit kwantificeren gebruikt.

Bepaling van de Spontane bewegingsactiviteit in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Met behulp van een webcam en een combinatie van gratis en goedkope software programma's, kan locomotief patronen in Drosophila melanogaster worden geanalyseerd om verschillen in de snelheid, afstand en tijd van de verschillende motorische activiteiten op te sporen.

Een Low-cost methode voor het analyseren van de inbeslagneming-achtige activiteit en beweging in<em&gt; Drosophila</em

Dit rapport beschrijft een methode voor het meten van Drosophila larvenactiviteit met behulp van de TriKinetics Drosophila Activiteitsmonitor. Het apparaat gebruikt infraroodstralen om bewegingen van maximaal 16 individuele dieren te detecteren. Gegevens kunnen worden geanalyseerd om bewegingsparameters weer te geven, inclusief snelheden en de posities van de dieren binnen de testkamers.

Meting van larvale activiteit in de<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Het protocol presenteert een high-throughput, kosteneffectieve methode voor het beoordelen van neurotoxiciteit in de fruitvlieg door middel van de kwantificering van locomotorische disfunctie als alternatief voor traditionele zoogdiermodellen. Het heeft tot doel de neurotoxische effecten van farmaceutische verbindingen, milieuagentia of genetische modificaties te evalueren met behulp van een gevoelig, reproduceerbaar en ethisch gunstig model.

Gedragsanalyse van locomotorische disfunctie bij Drosophila melanogaster als uitlezing voor neurotoxiciteit

Leer een eenvoudige methode om locomotorische activiteit in Drosophila te evalueren met behulp van open-source software Fiji. Deze techniek maakt kwantitatieve analyse van snelheid en afstand mogelijk voor gedragsonderzoek.

Een eenvoudige techniek om locomotorische activiteit in Drosophila te testen

Meer video's verkennen