Name: Een GMP-conforme procedure voor het genereren van gengemodificeerde T-cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Leer een GMP-conforme methode voor het transduceren van humane primaire T-cellen met een gen van belang. Deze kosteneffectieve techniek vereist geen dure gesloten systemen en ondersteunt de ontwikkeling van gentherapieën zoals CAR T-cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek is medegefinancierd door de Europese Unie en Griekse nationale fondsen via het Operationeel Programma Concurrentievermogen, Ondernemerschap en Innovatie, onder de oproep RESEARCH - CREATE - INNOVATE (projectcode: T2EDK - 00474). We willen ook onze dank uitspreken aan de Choose Life Foundation voor het bieden van voortdurende steun aan het GMP Lab "Dimitris Lois" van het Instituut voor Celtherapie.

Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Universiteit van Patras en de Institutional Review Board van het Universitair Algemeen Ziekenhuis van Patras. Voorafgaand aan het verkrijgen van biologische monsters werd geïnformeerde toestemming verkregen van gezonde personen. De geschiktheidsbeoordeling van deelnemers werd uitgevoerd volgens institutionele procedures en in overeenstemming met de JACIE-normen voor leukaferese. Als dit protocol moet worden geïmplementeerd in een klinische ACT-setting, moeten alle procedures voldoen aan de Good Manufacturing Practice (GMP)-richtlijnen en worden uitgevoerd in GMP-conforme cleanrooms. Speciale veiligheidsmaatregelen zijn noodzakelijk bij het werken met virale vectoren, en deze procedures moeten worden uitgevoerd in een speciale bioveiligheidskast. In deze studie werden de beschreven procedures uitgevoerd binnen een gevalideerd H35 HEPA-hypoxystation (zie materiaaltabel) om een gecontroleerde en bewaakte omgeving te garanderen. Ontsmetting van alle gevaarlijke vloeistoffen moet worden uitgevoerd met behulp van 10% bleekoplossing.
1. PBMC-isolatie en T-celactivering (dag 0)
<ol><li>Verzamel cellen uit de donoraferesezak (leukopaks, zie Materiaaltabel) in buisjes van 50 ml, afhankelijk van het oorspronkelijke volume.</li>
	<li>Voer twee wasbeurten van de celzak uit door 15 ml volledige hematopoëtische media te infuseren (+5% HSA, commerciële serumvrije hematopoëtische media, zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Voer centrifugatie uit op basis van polysacharide met dichtheidsgradiënt bij een verdunning van 1:2 (reagens:monster). Centrifugeer bij 800 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met afbreekpauzes (A/D, 9/0).</li>
	<li>Verzamel PBMC's met behulp van een micropipet in een schoon buisje van 50 ml.</li>
	<li>Was de cellen twee keer met 1x PBS en vul tot 50 ml voor elke wasbeurt (400 x g, 10 min, kamertemperatuur). Resuspendeer de cellen in 5 ml volledig medium.</li>
	<li>Tel de cellen met behulp van trypan blue met behulp van een standaard hemocytometer of een geautomatiseerde celteller (zie Tabel met materialen).</li>
	<li>Verdun de cellen met volledige media om een concentratie van 2 x 106 cellen/ml te bereiken.</li>
	<li>Activeer 20 x 106 PBMC's door 10 μL T-celstimulatiereagens (zie materiaaltabel) per 2 x 106 startcellen toe te voegen. OPMERKING: Dit protocol is ontworpen voor de activering van 20 x 106 PBMC's, maar kan indien nodig worden aangepast voor grotere celaantallen.</li>
	<li>Voeg rhIL-2 (20 E/ml) toe (zie materiaaltabel), meng voorzichtig en breng het mengsel over in een geschikt vat (bijv. een bord met 6 putjes).</li>
	<li>Incubeer de cellen bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 72 uur.</li>
</ol>2. Lentivirale T-celtransductie (dag 3)
<ol><li>Breng de celkweek over in een geschikt vat, zoals een kegelbuis van 50 ml. Meng goed en centrifugeer op 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) om het activeringsreagens te verwijderen. Gooi het supernatans voorzichtig volledig weg en repsuspendeer de pellet opnieuw in 1 ml compleet medium. OPMERKING: In dit stadium is het mogelijk om het virus op ijs te ontdooien.</li>
	<li>Tel de cellen met trypan blue.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in volledig medium om een concentratie te bereiken die het mogelijk maakt om 0,5 x 106 cellen te plateren in een totaal volume van 400 μL per putje in een plaat met 24 putjes. Voeg rhIL-7 (155 E/ml) en rhIL-15 (290 E/ml) toe (zie materiaaltabel). OPMERKING: Zorg ervoor dat u rekening houdt met het aantal toe te voegen virussen. Zie stap 2.4.</li>
	<li>Voeg in een apart buisje Vectofusine-1 (zie Materiaaltabel) toe aan Opti-MEM-medium in een concentratie van 10 μg/ml, met een volume dat gelijk is aan het te gebruiken virale volume. OPMERKING: Houd rekening met het totale celkweekvolume bij het berekenen van de concentratie Vectofusine-1. Zie stap 2.3. Als alternatief kan Vectofusin-1 GMP worden gebruikt als een reagens van GMP-kwaliteit.</li>
	<li>Combineer het geconcentreerde virus met een Multiplicity of Infection (MOI) van 40 met het Vectofusin-1/Opti-MEM-mengsel (verhouding 1:1) en meng grondig. Voeg dit mengsel toe aan de celkweek en pas het totale volume aan tot 400 μL per putje, indien nodig met behulp van een volledig medium.</li>
	<li>Plaats het deksel op de plaat, sluit deze af met paraffinefolie en centrifugeer gedurende 2 uur bij 32 °C bij 1000 x g . Incubeer de plaat vervolgens een nacht bij 37 °C, 5% CO2 .</li>
</ol>3. Virusverwijdering en T-celexpansie (dag 4)
<ol><li>Verzamel de cellen en bundel ze in een geschikt vat, zoals een buis van 50 ml.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen bij 400 x g bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 min. Verwijder het supernatans voorzichtig volledig en resuspendeer de pellet in 1 ml volledig medium.</li>
	<li>Tel de cellen met trypan blue. Resuspendeer de cellen in volledige media met een concentratie van 1 x 106 cellen/ml. Voeg rhIL-7 (155 E/ml) en rhIL-15 (290 E/ml) toe (zie materiaaltabel).</li>
	<li>Breng de cellen over in een geschikte tank, zoals een T25-kolf, in een concentratie van 0,3-0,5 x 106 cellen/cm2 en incubeer ze gedurende 2 dagen bij 37 °C, 5% CO2. OPMERKING: Als een grotere celpopulatie nodig is, kunnen cellen om de 2 dagen worden gesubcultureerd (1:2) in aanwezigheid van rhIL7 en rhIL-15, volgens dezelfde incubatieomstandigheden als hierboven vermeld, totdat de gewenste celaantallen zijn bereikt.</li>
</ol>4. Cryopreservatie (dag 14)
NOTITIE: Tijdens deze stap is ijs nodig om cryovials naar de opslaglocatie over te brengen. De timing van cryopreservatie is afhankelijk van het gewenste aantal cellen. Voor dit protocol wordt cryopreservatie uitgevoerd op dag 14 na het bereiken van een 25-voudige expansie.
<ol><li>Zodra het gewenste celaantal is bereikt, oogst je de cellen en breng je ze over naar buisjes van 50 ml (pas het aantal buisjes aan op basis van het totale volume).</li>
	<li>Centrifugeer de buisjes op 400 x g bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 min. Verwijder het supernatans voorzichtig volledig en resuspendeer de pellet in 10 ml media. Bundel indien nodig de cellen van meerdere buizen.</li>
	<li>Tel de cellen met trypan blue. Houd een aliquot van 1 x 106 cellen bij voor elke kwaliteitscontrole (QC) (zie sectie 5) om het aantal vectorkopieën en de transductie-efficiëntie te beoordelen.</li>
	<li>Centrifugeer de buisjes bij 400 x g gedurende 10 minuten bij RT. Label nu de cryovials dienovereenkomstig.</li>
	<li>Verwijder het supernatans volledig en resuspendeer de pellet in een cryopreservatieoplossing bestaande uit 50% HSA en 40% HBSS in een concentratie van 1 x 10,7 cellen per ml per cryovial. Breng de celsuspensie over in het juiste aantal cryovials en voeg 10% dimethylsulfoxide (DMSO) toe aan elke cryovial.</li>
	<li>Plaats de cryovials op ijs en breng ze onmiddellijk over naar een vriezer met gecontroleerde snelheid voor cryopreservatie. Breng de cryovials na cryopreservatie over naar een bewaakte tank met vloeibare stikstof voor langdurige opslag.</li>
</ol>5. Kwaliteitscontrole (dag 14)
OPMERKING: Voor het testen van de afgifte onderging het product verschillende tests, waaronder steriliteitstests voor microbiële groei en beoordeling van het endotoxineniveau. Deze tests werden uitgevoerd in gecertificeerde laboratoria van het Universitair Algemeen Ziekenhuis van Patras en de Universiteit van Patras. De aanwezigheid van mycoplasma werd intern bepaald met behulp van een biochemische detectietest en gemeten op een luminometer volgens de instructies van de fabrikant (zie Tabel met materialen). Het celfenotype (figuur 1), het aantal cellen en de levensvatbaarheid werden intern beoordeeld door middel van flowcytometrie (zie rubriek 5.1) en een geautomatiseerde celteller (zie materiaaltabel). Op basis van gepubliceerde gegevens en aanbevelingen10,11 voor GMP-geproduceerde celproducten werden vrijgavecriteria vastgesteld (tabel 1).
<ol><li>Voer transductie-efficiëntie-flowcytometriekleuring uit (dag 14) OPMERKING: Een aliquot van 1 x 106 cellen zal worden gekleurd voor levensvatbaarheid (7-AAD) en CD3-marker2 om de transductie-efficiëntie te evalueren (zie Materiaaltabel). Als het gen van belang, zoals in het geval van CAR T-cellen, moet worden gedetecteerd, moet het specifieke antilichaam een andere kleur hebben dan die van de CD3-marker en 7-AAD om compensatie te voorkomen. Er moet rekening worden gehouden met geschikte controlemonsters.<ol><li>Plaats het monster in een FACS-buisje en voeg 500 μL FACS-buffer toe.</li>
		<li>Centrifugeer de buis bij 400 x g bij RT gedurende 5 min.</li>
		<li>Gooi het supernatans volledig weg met een pipet en resuspendeer de pellet in een 1:5 verdunde oplossing van CD3:FACS-buffer (zie Materiaaltabel).</li>
		<li>Draai het monster en incubeer gedurende 30 minuten op ijs in het donker.</li>
		<li>Voeg 500 μL FACS-buffer toe. Centrifugeer op 400 x g gedurende 5 min (RT).</li>
		<li>Gooi het supernatans volledig weg en resuspendeer de pellet in een 1:20 verdunde oplossing van 7-AAD:FACS-buffer (zie Materiaaltabel).</li>
		<li>Draai het monster en incubeer gedurende 10 minuten op ijs in het donker.</li>
		<li>Voeg 200 μL FACS-buffer toe en analyseer het monster met behulp van een flowcytometer (zie Materiaaltabel).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).</li>
<li>Brentjens, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra38(2013).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+remissions+following+chimeric+antigen+receptor+modified+T+cells+directed+against+CD19+%28CTL019%29+in+patients+with+relapsed+or+refractory+CD19%2B+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sustained remissions following chimeric antigen receptor modified T cells directed against CD19 (CTL019) in patients with relapsed or refractory CD19+ lymphomas.</a> Blood. 126 (23), 183(2015).</li>
<li>Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+manufacturing+of+CAR+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Global manufacturing of CAR T cell therapy.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).</li>
<li>Wang, X., Rivière, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+manufacturing+of+CAR+T+cells%3A+foundation+of+a+promising+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Clinical manufacturing of CAR T cells: foundation of a promising therapy.</a> Molecular Therapy - Oncolytics. 3, 16015(2016).</li>
<li>Iancu, E. M., Kandalaft, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+advantages+of+cell+therapy+manufacturing+under+Good+Manufacturing+Practices+within+the+hospital+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Challenges and advantages of cell therapy manufacturing under Good Manufacturing Practices within the hospital setting.</a> Current Opinion in Biotechnology. 65, 233-241 (2020).</li>
<li>Kaiser, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+commercial+process+for+the+manufacture+of+genetically+modified+T+cells+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Towards a commercial process for the manufacture of genetically modified T cells for therapy.</a> Cancer Gene Therapy. 22 (2), 72-78 (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+on+quality%2C+non-clinical+and+clinical+aspects+of+medicinal+products+containing+genetically+modified+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Medicines+Agency%22%5BJournal%5D)">Guidelines on quality, non-clinical and clinical aspects of medicinal products containing genetically modified cells.</a> European Medicines Agency. , EMA/CAT/GTWP/671639/2008 Rev. 1 - corr., Committee for Advanced Therapies (CAT) (2020).</li>
<li>Castella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-care+CAR+T-Cell+production+%28ARI-0001%29+using+a+closed+semi-automatic+bioreactor%3A+experience+from+an+academic+phase+I+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Point-of-care CAR T-Cell production (ARI-0001) using a closed semi-automatic bioreactor: experience from an academic phase I clinical trial.</a> Frontiers in Immunology. 11, 482(2020).</li>
<li>Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviruses+as+gene+transfer+agents+for+delivery+to+non-dividing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Lentiviruses as gene transfer agents for delivery to non-dividing cells.</a> Current Opinion in Biotechnology. 9 (5), 457-463 (1998).</li>
<li>Ausubel, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+CGMP-grade+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioprocess+International%22%5BJournal%5D)">Production of CGMP-grade lentiviral vectors.</a> Bioprocess International. 10 (2), 32-43 (2012).</li>
<li>Van der Loo, J. C. M., Wright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+challenges+in+viral+vector+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Progress and challenges in viral vector manufacturing.</a> Human Molecular Genetics. 25 (R1), R42-R52 (2016).</li>
<li>Rad, S. M. A. H., Poudel, A., Tan, G. M. Y., McLellan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter+choice%3A+Who+should+drive+the+CAR+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Promoter choice: Who should drive the CAR in T cells.</a> PLoS One. 15 (7), e0232915(2020).</li>
<li>Sandrin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+pseudotyped+with+a+modified+RD114+envelope+glycoprotein+show+increased+stability+in+sera+and+augmented+transduction+of+primary+lymphocytes+and+CD34%2B+cells+derived+from+human+and+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors pseudotyped with a modified RD114 envelope glycoprotein show increased stability in sera and augmented transduction of primary lymphocytes and CD34+ cells derived from human and nonhuman primates.</a> Blood. 100 (3), 823-832 (2002).</li>
<li>Costello, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+stimulated+and+unstimulated+T+lymphocytes+by+HIV-1-derived+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into stimulated and unstimulated T lymphocytes by HIV-1-derived lentiviral vectors.</a> Gene Therapy. 7 (7), 596-604 (2000).</li>
<li>Radek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vectofusin-1+improves+transduction+of+primary+human+cells+with+diverse+retroviral+and+lentiviral+pseudotypes%2C+enabling+robust%2C+automated+closed-system+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Vectofusin-1 improves transduction of primary human cells with diverse retroviral and lentiviral pseudotypes, enabling robust, automated closed-system manufacturing.</a> Hum Gene Therapy. 30 (12), 1477-1493 (2019).</li>
<li>Hanenberg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+retrovirus+and+target+cells+on+specific+fibronectin+fragments+increases+genetic+transduction+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Colocalization of retrovirus and target cells on specific fibronectin fragments increases genetic transduction of mammalian cells.</a> Nature Medicine. 2 (8), 876-882 (1996).</li>
<li>Lamers, C. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retronectin-assisted+retroviral+transduction+of+primary+human+T+lymphocytes+under+good+manufacturing+practice+conditions%3A+tissue+culture+bag+critically+determines+cell+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Retronectin-assisted retroviral transduction of primary human T lymphocytes under good manufacturing practice conditions: tissue culture bag critically determines cell yield.</a> Cytotherapy. 10 (4), 406-416 (2008).</li>
<li>O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+spinoculation+enhances+infection+through+virus+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding.</a> Journal of Virology. 74 (21), 10074-10080 (2000).</li>
<li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+%28CAR-T%29+cells+expanded+with+IL-7%2FIL-15+mediate+superior+antitumor+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects.</a> Protein Cell. 10 (10), 764-769 (2019).</li>
<li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+manufacturing+of+non-activated+potent+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Rapid manufacturing of non-activated potent CAR T cells.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (2), 118-128 (2022).</li>
<li>Wang, R. -N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocols+for+%CE%B3%CE%B4+T+cell+expansion+and+lentiviral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Optimized protocols for γδ T cell expansion and lentiviral transduction.</a> Molecular Medicine Reports. 19 (3), 1471-1480 (2019).</li>
<li>Yuan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+and+optimization+of+protocols+for+producing+recombinant+lentivirus+carrying+the+anti-Her2+chimeric+antigen+receptor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis and optimization of protocols for producing recombinant lentivirus carrying the anti-Her2 chimeric antigen receptor gene.</a> The Journal of Gene Medicine. 20 (7-8), e3027(2018).</li>
<li>Zhu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closed-system+manufacturing+of+CD19+and+dual-targeted+CD20%2F19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+using+the+CliniMACS+Prodigy+device+at+an+academic+medical+center%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Closed-system manufacturing of CD19 and dual-targeted CD20/19 chimeric antigen receptor T cells using the CliniMACS Prodigy device at an academic medical center.</a> Cytotherapy. 20 (3), 394-406 (2018).</li>
<li>Mock, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+manufacturing+of+chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+adoptive+immunotherapy+using+CliniMACS+Prodigy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Automated manufacturing of chimeric antigen receptor T cells for adoptive immunotherapy using CliniMACS Prodigy.</a> Cytotherapy. 18 (8), 1002-1011 (2016).</li>
</ol>

N.S. ontwikkelde het protocol en schreef het manuscript dat door A.S. werd beoordeeld en begeleid; K.S., G.A. voerden aanvullende experimenten uit; D.K., M.L. leverde waardevolle ondersteuning bij de experimenten en samen met V.Z., N.T. bij het beoordelingsproces. N.T. is lid van ProtATonce Ltd. Alle andere auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Lentivirale vectoren als genafgiftevoertuigen zijn belangrijke hulpmiddelen op het gebied van cel- en gentherapie vanwege hun vermogen om zowel delende als niet-delende cellen te transduceren12. Grootschalige productie van lentivirale vectoren met behulp van GMP-compatibele methoden is echter nog steeds een uitdaging vanwege verschillende parameters, zoals transfectiemethoden en zuiveringsstappen, die kunnen leiden tot variabiliteit in lentivirusbatches. Academische centra verkrijgen vaak virale v...

De opkomst van Adoptive Cell Therapies (ACT) en chimere antigeenreceptor (CAR)-T-cellen hebben een revolutionaire verschuiving teweeggebracht in de moderne klinische praktijk, waardoor een nieuw paradigma van gepersonaliseerde geneeskunde is ontstaan. Met name CAR-T-cellen gericht op CD19 hebben uitzonderlijke klinische responsen aangetoond en vertegenwoordigen de meest geavanceerde T-celtherapie voor B-celmaligniteiten 1,2,3,4,5. De huidige gecommercialiseerde gen-gemodificeerde T-celtherapieën zijn echter sterk afhankelijk van virale vectoren voor genoverdracht. De implementatie van virale vectoren in ACT, met name onder Good Manufacturing Practice (GMP)-omstandigheden binnen een academische omgeving, brengt aanzienlijke uitdagingen met zich mee vanwege schaalbaarheidsbeperkingen, gespecialiseerde apparatuurvereisten, de behoefte aan hoogopgeleid personeel en het gebruik van GMP-conforme reagentia voor de productie van plasmide-gemedieerde virale deeltjes 6,7,8.
Bijgevolg is het productieproces voor gengemodificeerde T-celtherapieën ingewikkeld en begint het meestal met de isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) uit een leukafereseproduct. T-cellen worden vaak verrijkt vanuit de PBMC-pool en geactiveerd met behulp van anti-CD3/CD28-microcomplexen 7,9. Vervolgens worden T-cellen genetisch gemodificeerd met virale of niet-virale vectoren, die in situ kunnen worden geproduceerd of uitbesteed. Om het vereiste aantal cellen voor infusie te bereiken, worden gengemodificeerde cellen geëxpandeerd voordat ze definitief worden geformuleerd en/of gecryoppaserveerd. Ten slotte moet het celproduct voldoen aan verschillende vrijgavecriteria op basis van meervoudige kwaliteitscontroletests9.
Dit protocol presenteert een uitgebreide methodologie die gebruik maakt van eenvoudige technieken voor de ex vivo manipulatie van gezonde PBMC's om een gengemodificeerd T-celproduct te vervaardigen onder GMP-conforme omstandigheden. Het protocol omvat het gebruik van een lentivirale vector, die kan worden uitbesteed aan een viraal productiebedrijf dat alle noodzakelijke kwantitatieve/functionele, zuiverheids- en veiligheidstests uitvoert (bijv. virale titer, detectie van DNA-replicatiecompetent lentivirus van gastheercellen). Voor deze studie is de gebruikte vector een op VSV-g (Vesicular Stomatitis Virus G Protein) gebaseerde lentivirale vector van de tweede generatie met Green Fluorescent Protein (GFP), als het gen van belang, in constitutieve expressie.

<table><tbody><tr><td>24-well TC-behandelde plaat</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>5 mL FACS tube&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tubes</td><td>Greiner biomedica</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>6-well TC-behandelde plaat</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS CANTO II</td><td>BD Biosciences</td><td>V96300084</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Applichem</td><td>A1391</td><td></td></tr><tr><td>Cell Counter&nbsp;</td><td>Corning Cell Cytosmart</td><td>J21E0081</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Greiner biomedica</td><td>122263</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>FACS Buffer (1x D-PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software v10.6.2&nbsp;</td><td>TreeStar Inc</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Gibco CTS Opti-MEM I Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A4124801</td><td></td></tr><tr><td>GMP rhIL-15</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-114</td><td></td></tr><tr><td>GMP rhIL-2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-146</td><td></td></tr><tr><td>GMP rhIL-7</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-111</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&rsquo;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>HEPA Whitley H35 Hypoxystation</td><td>Don Whitley Scientific</td><td>HA0315172H</td><td></td></tr><tr><td>Human Serum Albumin (HSA)</td><td>Baxter</td><td>B05AA01</td><td></td></tr><tr><td>Junior LB 9509 Portable Luminometer</td><td>Berthold Technologies</td><td>6506</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X Provirus Quantitation Kit</td><td>Takara Bio</td><td>631239</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7811</td><td></td></tr><tr><td>MACS GMP T cell TransAct</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-156</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human&nbsp; CD3 (Clone: UCHT-1)</td><td>BD Biosciences</td><td>557706</td><td></td></tr><tr><td>MycoAlert Plus Detection kit</td><td>Lonza Bioscience</td><td>LT07-703</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm ultra-expandable sluitfilmtape 5 cm x 75 m</td><td>D.Dutscher</td><td>90261</td><td></td></tr><tr><td>PeriStem PS-650-DB (aferesezak)</td><td>Biomed Device</td><td>SC00816</td><td></td></tr><tr><td>Planer Kryo10 Series III</td><td>Planer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T75 flasks</td><td>Greiner biomedica</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue, 0.4% oplossing</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Vectofusin-1 GMP</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-165</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVOTM 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium</td><td>Lonza Bioscience</td><td>A1048501</td><td></td></tr></tbody></table>

een gmp-conforme procedure voor het genereren van gengemodificeerde t-cellen

A GMP-Compliant Procedure for the Generation of Gene-Modified T cells

Het gebied van adoptieve celtherapie (ACT) heeft een revolutie teweeggebracht door de ontwikkeling van genetisch gemodificeerde cellen, met name chimere antigeenreceptor (CAR)-T-cellen. Deze gemodificeerde cellen hebben opmerkelijke klinische reacties laten zien bij patiënten met hematologische maligniteiten. De hoge kosten voor het produceren van deze therapieën en het uitvoeren van uitgebreide kwaliteitscontroles hebben hun toegankelijkheid voor een breder scala aan patiënten echter beperkt. Om dit probleem aan te pakken, onderzoeken veel academische instellingen de haalbaarheid van interne productie van genetisch gemodificeerde cellen, terwijl ze zich houden aan de richtlijnen van nationale en internationale regelgevende instanties.
De grootschalige productie van genetisch gemodificeerde T-celproducten brengt verschillende uitdagingen met zich mee, met name wat betreft de productiecapaciteit van de instelling en de noodzaak om te voldoen aan de vereisten voor infusiehoeveelheden. Een grote uitdaging is het produceren van grootschalige virale vectoren volgens Good Manufacturing Practice (GMP)-richtlijnen, die vaak worden uitbesteed aan externe bedrijven. Bovendien kan het vereenvoudigen van het T-celtransductieproces helpen de variabiliteit tussen productiebatches te minimaliseren, de kosten te verlagen en de opleiding van het personeel te vergemakkelijken. In deze studie schetsen we een gestroomlijnd proces voor lentivirale transductie van primaire menselijke T-cellen met een fluorescerende marker als het gen van belang. Het hele proces voldoet aan GMP-conforme normen en wordt geïmplementeerd binnen onze academische instelling.

Beoordeling van de transductie-efficiëntie De getransduceerde cellen werden geëvalueerd op de expressie van het gen van belang (GFP) met behulp van flowcytometrie. Representatieve resultaten zijn weergegeven in figuur 1. Op dag 14 was meer dan 95% van de cellen CD3+, wat wijst op succesvolle activering en expansie van T-cellen. De transductie-efficiëntie binnen de CD3+-populatie werd gemeten op 58,7% (TD, figuur 1C</st...

Dit protocol schetst het proces van het transduceren van primaire menselijke T-cellen met een gen van belang, waardoor compatibiliteit met Good Manufacturing Practice (GMP)-normen wordt gegarandeerd.

Een GMP-conforme procedure voor het genereren van gengemodificeerde T-cellen

The field of Adoptive Cell Therapy (ACT) has been revolutionized by the development of genetically modified cells, specifically Chimeric Antigen Receptor ...

Dit protocol beschrijft een vereenvoudigd en BNP-conform proces voor het transduceren van menselijke primaire T-cellen met genen van belang. Deze specifieke techniek is ontworpen om kosteneffectief te zijn en in overeenstemming te zijn met het BNP zonder het gebruik van dure productieplatforms voor gesloten systemen die momenteel in veel academische centra beschikbaar zijn. Deze methode kan mogelijk worden toegepast op het genereren van gengemodificeerde celtherapieën, inclusief maar niet beperkt tot CAR-T-cellen, die een paradigmaverschuiving hebben plaatsgevonden om hematologische maligniteiten aan te pakken.Om PBMC te isoleren uit de cellen die zijn verzameld na leukaferese van donorbloed, voert u een op polysachariden gebaseerde dichtheidsgradiëntcentrifugatie van het monster uit, waarbij een reagens/monsterverhouding van 1:2 wordt gehandhaafd, door het mengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur bij 800 G te centrifugeren met de remmen uit. Verzamel vervolgens met behulp van een micropipet de PBMC's in een schone buis van 50 milliliter. Was de cellen twee keer met PBS door te centrifugeren.Alvorens de gewassen cellen opnieuw te suspenderen in volledige hematopoëtische me

a-gmp-compliant-procedure-for-the-generation-of-gene-modified-t-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Een snelle, eenvoudige en kosteneffectieve protocol voor het genereren van donor-afgeleide multivirus-specifieke CTL (rCTL) voor infusie aan allogene hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT) ontvangers risico op het ontwikkelen CMV, Adv of EBV infecties. Dit productieproces is GMP-compliant en moet zorgen voor de bredere implementatie van T-cel-immunotherapie voorbij gespecialiseerde centra.

Genereren van Multivirus-specifieke T-cellen te voorkomen / virale infecties te behandelen na allogene hematopoietische stamceltransplantatie

The video outlines a process for creating genetically modified CAR T cells through the CRISPR-Cas9 System. Infecting T cells with CRISPR and CAR lentiviruses results in modifications to the target gene and the synthesis of a chimeric antigen receptor or CAR, ultimately leading to the formation of genetically modified CAR T cells.

Genetically Modifying CAR T Cells Using a CRISPR-Cas9 System

This video demonstrates an assay for performing gene editing in human T cells using the CRISPR-Cas9 technology. A mixture of primary CD4+ and CD8+ T cells is combined with a CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complex, targeting specific genes for knockout. Upon electroporation, the sgRNA guides Cas9 to the target DNA sequence, creating precise cuts. These cuts are then repaired by the cell's non-homologous end-joining mechanism, leading to gene knockout.

A CRISPR-Cas9 Technique for Gene Editing in T Cells

T cellen die een CD19-antigen specifieke chimere receptor (CAR) worden toegediend als onderzoek behandeling van B-cel maligniteiten in de eerste-in-humane gentherapie trials. We beschrijven genetische modificatie van T cellen met behulp van...

Klinische toepassing van<em&gt; Sleeping Beauty</em&gt; En Kunstmatige antigeen presenterende cellen genetisch te wijzigen T-cellen uit perifeer en navelstrengbloed

De lymfodeletieve en immunomodulerende effecten van chemotherapie en stralingsstandaardzorg kunnen worden benut om de antitumor-effectiviteit van T-celimmunotherapie te verbeteren. We schetsen een methode voor het genereren van EGFRvIII-specifieke chimere antigeenreceptor (CAR) T-cellen en het toedienen ervan in de context van glioblastoma standaardzorg.

Generatie van de CAR T-cellen voor adoptieve Therapie in de context van glioblastoma Standard of Care

Hierin beschrijven we een nieuwe methode om antigeenspecifieke T-celreceptoren (TCR's) door het koppelen van de TCRα of TcR van een bestaande TCR, bezit de antigeen-specificiteit van interesse, met aanvullende hemichain van de perifere T-cel receptor repertoire genereren. De novo geproduceerde TCRs behouden antigeen-specificiteit met verschillende affiniteit.

Generating<em&gt; De Novo</em&gt; Antigeen-specifieke menselijke T-cel receptoren door Retrovirale Transductie van Centric Hemichain

Hier presenteren we een protocol voor genetisch gemodificeerde CAR-T cellen via een CRISPR/Cas9 systeem.

CRISPR/Cas9 gebruiken om GM-CSF uit te nemen in CAR-T-cellen

Dit artikel beschrijft het productieproces voor chimere antigeenreceptor-T-cellen voor klinisch gebruik, met name met behulp van een geautomatiseerde celprocessor die virale transductie en kweek van T-cellen kan uitvoeren. We geven aanbevelingen en beschrijven valkuilen waarmee rekening moet worden gehouden tijdens de procesontwikkeling en implementatie van een klinische studie in een vroege fase.

Chimere antigeenreceptor T-celproductie op een geautomatiseerde celprocessor

Dit protocol stroomlijnt de productie van retrovirale vectoren en de transductie van T-cellen bij muizen, waardoor de efficiënte generatie van CAR-T-cellen van muizen wordt vergemakkelijkt.

Efficiënte generatie van muizen chimere antigeenreceptor (CAR)-T-cellen

Dit protocol biedt een gestroomlijnde workflow voor het genereren en testen van menselijke chimere antigeenreceptorregulerende T-cellen (CAR Tregs).

Generatie van menselijke chimere antigeenreceptorregulerende T-cellen

Dit protocol beschrijft een schaalbare methode voor de uitbreiding van Adoptive Cell Therapies (ACT)-producten, namelijk Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T-cellen en Cytokine-Induced Killer (CIK)-cellen, met behulp van gaspermeable Rapid expansion (G-Rex) apparaten, waarmee efficiënte en robuuste groei wordt aangetoond in een klinisch relevante omgeving.

Efficiënte en snelle generatie van CAR-T en cytokine-geïnduceerde killercellen in GMP-schaalbare apparaten

Leer een GMP-conforme methode voor het transduceren van humane primaire T-cellen met een gen van belang. Deze kosteneffectieve techniek vereist geen dure gesloten systemen en ondersteunt de ontwikkeling van gentherapieën zoals CAR T-cellen.

Een GMP-conforme procedure voor het genereren van gengemodificeerde T-cellen

Meer video's verkennen