High-throughput contractiele metingen van hydrogel-ingebedde intacte muisspiervezels met behulp van een op optica gebaseerd systeem

Dit protocol kan worden gebruikt om de impact van genetische mutaties op de spiervezelfunctie te beoordelen. Bovendien kan het worden gebruikt voor geneesmiddelenscreeningstudies gericht op het verbeteren van de spiergezondheid. Deze techniek kan worden gebruikt om contractiliteit in een groot aantal spiervezels in een relatief korte tijd te isoleren en te meten zonder de noodzaak van geavanceerde training.

De samenstelling van de hydrogels kan worden gewijzigd om het effect van omgevingssignalen in zowel gezonde als zieke spieren te bevestigen. Het meest uitdagende deel van de procedure is de eerste dissectie van de spier. Als er niet genoeg zorg wordt besteed, kan schade aan de spier leiden tot een afname van de levensvatbaarheid van de spiervezels.

Leander Vonk, een onderzoekstechnicus, en Osman Esen, promovendus in mijn laboratorium, zullen de procedure demonstreren. Begin met het snijden van het onderste achterbeen van de geëuthanaseerde muis net boven de enkel. Maak een incisie op de huid aan de dorsale kant van de voet richting de tenen.

Schil de huid voorzichtig naar de tenen en zorg ervoor dat de spier niet wordt beschadigd. Plaats de ontleedde voet in een seal guard dish met 10 milliliter voorverwarmd dissectiemedium bij 37 graden Celsius. Speld de voet door de huid die nog aan de tenen vastzit.

Speld het onderbeen voorbij de enkel en snijd voorzichtig het bindweefsel bovenop de spier weg. Snijd de pees bij de hiel door en til de spier op. Snijd naast en onder de spier door het bindweefsel totdat de teenpezen bloot komen te liggen.

Knip de pezen door wanneer de helft van de lengte van drie pezen bloot ligt. Maak de spier los van de voet en pin de pezen van de FDB-spieren. Verwijder eventueel achtergebleven bindweefsel uit de spier.

Breng het schone spierweefsel over in een buis met voorverwarmd dissectiemedium. Gebruik een serologische pipet om de brevisspier over te brengen naar een buis met daarin het spierverteringsmedium. Plaats het weefsel in een couveuse bij 37 graden Celsius onder 5% koolstofdioxide gedurende 80 minuten.

Breng de spier over in een buis van 15 milliliter met drie milliliter dissectiemedium. Met behulp van voorbereide trituratietips, pipetteer de spier van de grootste naar de kleinste en ga door met trituratie totdat de spiervezels van de pees zijn gekomen. De pezen kunnen worden verwijderd met een P200-punt.

Breng de gedissocieerde spiervezels over in een buis van 15 milliliter met 10 milliliter dissectiemedium. Laat de vezels 20 minuten in de incubator bezinken totdat er een pellet is gevormd. Pipeter voorzichtig al het medium vanaf de bovenkant van de vezelkorrel.

Op het ijs resuspensie je de cellen in 875 microliter celmix per spier. Voeg 125 microliter matrixcelmengsel toe aan buisjes met 125 microliter celsuspensie aliquot. Meng door zacht pipetteren en vermijd de vorming van bubbels.

Breng de uiteindelijke mix onmiddellijk over in een put. Controleer de levensvatbaarheid van de spiervezels onder de microscoop. Plaats de gels 30 tot 45 minuten in een incubator om stolling te bevorderen.

Als je klaar bent, voeg je voorzichtig 500 microliter kweekmedium toe aan elke put. Schakel het op optica gebaseerde contractiele meetsysteem, de fluorescentielamp, de elektrische celpacer en de computer in. Stel de elektrische stimulator in op 1,0 hertz op 10 volt met een pulsduur van vijf milliseconden om de geïsoleerde spiervezels te stimuleren.

Plaats de plaat in het meetsysteem. Sluit de pacer aan op de insert en steek deze in de kweekplaat. Open het programma IonWizard.

Klik op OK. Open een nieuw bestand door op het pictogram Bestand te klikken en vervolgens op Nieuw te klikken. Selecteer Experiment verzamelen om te controleren of het programma het juiste skeletsarcomeer van het experiment gebruikt. Als u het experiment wilt wijzigen, klikt u op het gewenste experiment en drukt u vervolgens op Toevoegen.

Pas de instellingen SARC 20X, gemiddelde lijnen, enkele FFT, 250 hertz bemonsteringsfrequentie en een acquisitietijd van 10 seconden toe. Verander de temperatuur van het meetsysteem naar 25 graden Celsius. Klik op de open celzoeker om een nieuwe schermpop-up te maken.

Selecteer Plaattype en Actieve putten. Stel de vezels scherp door de schuifbalk voor scherpstelling aan te passen. Schakel de pacing in om elektrische stimulatie te induceren en vezeltrillingen te observeren.

Houd de sarcomeren scherp, zorg ervoor dat het meetgebied op het vezeluiteinde is gefixeerd, zodat de sarcomeren verticaal lopen. Wanneer de sarcomeren gefocust zijn, is een enkele piek zichtbaar in de werkbalk die bij samentrekking naar rechts zal bewegen. Meet de vezels op het meetsysteem.

Klik op Start om het experiment te starten. Druk op de Q-toets om te beginnen met het meten van 10 contractietransiënten. Als meer dan vier transiënten er ruisvrij uitzien, accepteert u de meting door op de Z-toets te drukken.

Als de transiënten te veel ruis bevatten, weiger dan de metingen. Druk op Stop om het celzoekervenster te sluiten zodra het experiment is voltooid. Sla het bestand op en maak een nieuw bestand.

Open het programma CytoSolver desktop, klik vervolgens op Importeren en selecteer de bestanden die moeten worden geanalyseerd. Zodra de analyse is voltooid, identificeert u de blauwe, rode en grijze pieken. Klik op Exporteren.

Schakel de vakjes Gemiddelde naar Tijdelijke gegevens in en exporteer naar Excel. Een hoger percentage bruikbare contractiele spiermetingen werd verkregen in de 3D-fibrinehydrogel omdat het laterale bewegingen en andere beïnvloedende factoren voorkwam. Vezelinbedding had geen significant effect op de maximale contractiesnelheid of de sarcomeerverkorting.

Verminderde contractie in de zuivere keldermatrix werd waargenomen, waarschijnlijk als gevolg van gelstijfheid of verhoogde celmatrixinteractie. Op dezelfde manier verminderde de inbedding van de keldermatrix ook de verkorting van sarcomeer in vergelijking met de fibrinehydrogel. Het is belangrijk om te onthouden dat de geïsoleerde spiervezels vrij kwetsbaar zijn en dat er extra zorg moet worden besteed om ze niet te beschadigen tijdens het pipetteren.

Na de isolatieprocedure kunnen ook methoden zoals immunostaining, eiwit- en RNA-isolatie worden uitgevoerd. De ontwikkeling van deze techniek heeft nieuwe mogelijkheden geopend om de functie van volwassen spiervezels op een hoge doorvoer te bestuderen.