Name: Isolatie en kweek van menselijke vetstamcellen met een innovatieve xenogene-vrije methode voor menselijke therapie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Leer een xenogene-vrije methode voor isolatie en kweek van menselijke vetstamcellen voor celtherapie. Deze techniek vermindert biosafety-risico's en is eenvoudig te repliceren in klinisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs hebben geen erkenningen.

hASCs werden geïsoleerd uit het buikvetweefsel van een gezonde vrouw die een borstreconstructie onderging met behulp van abdominale autologe flappen (diepe inferieure epigastrische perforatorflappen, [DIEP]) in het Universitair Ziekenhuis van Lausanne, CHUV, Lausanne, Zwitserland. Het weggegooide deel van de flap en het vetweefsel werd verkregen nadat de patiënt geïnformeerde toestemming had ondertekend. Alle protocollen werden beoordeeld en goedgekeurd door de Biobank afdeling DAL (nummer 314 GGC) van het ziekenhuis en ethische commissies in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki.
OPMERKING: Alle stappen moeten worden uitgevoerd onder een laminaire stromingskap en met aseptische omstandigheden. Handschoenen en laboratoriumjassen voor persoonlijke bescherming moeten altijd worden gedragen en alle oppervlakken moeten worden gewassen met geschikte biociden. Overtollig weefsel moet op de juiste manier worden afgevoerd als biomedisch afval.
1. Benodigde materialen en voorbereiding van de kweekoplossingen
<ol><li>Voor celisolatie, expansie en cryopreservatie kunt u de volgende instrumenten aanschaffen: steriele schaar; steriele scalpels; steriel pincet; een petrischaal van 10 cm; 15 ml buizen; T25-kolven; een Burker-kamer; cryovialen; een celvriescontainer; een optische microscoop met 4x en 10x vergrotingsobjectieven; en een draaiende emmercentrifuge.</li>
	<li>Verkrijg voor immunofenotypering de volgende instrumenten en reagentia: FACS-buizen, steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS); Dulbecco's minimal essential medium (DMEM); hPL; dimethylsulfide; en diervrij trypsine.</li>
	<li>Bereid het volledige kweekmedium door DMEM aan te vullen met 5% heparinevrij hPL. Bewaar het medium bij 4 °C gedurende maximaal 3 weken en gebruik het altijd warm (tussen kamertemperatuur en 37 °C). Volg de GMP-richtlijnen voor de productie van celgeneesmiddelen die bedoeld zijn voor menselijke therapie en voeg geen antibiotica toe aan het kweekmedium.</li>
	<li>Bereid vriesmedium met 20% hPL en 10% dimethylsulfide in DMEM.</li>
</ol>2. Isolatie van hASCs uit het vetweefselmonster
<ol><li>Verwerk het vetweefselmonster binnen 6 uur na het verkrijgen ervan. Voordat u overgaat tot de gevestigde mechanische xenogeneïsche isolatiemethode, wast u het weefsel 2x met PBS gedurende 10 minuten totdat bindweefsel en bloed vrijkomen.</li>
	<li>Bewaar het verkregen vetweefselmonster van abdominoplastische chirurgie in PBS bij 4 ° C tot de verwerking en in elk geval niet langer dan 24 uur, om de levensvatbaarheid van hASC niet te beschadigen.</li>
	<li>Knip het vetweefsel met een steriele schaar in kleinere stukjes van ongeveer 1 cm2 .</li>
	<li>Met een scalpel micro-ontleed elk stuk in kleine fragmenten met een diameter <5 mm en dispreid er vijf in een petrischaal van 10 cm (figuur 2A).</li>
	<li>Om elk fragment te bevestigen, gebruikt u het scalpel om incisies op het plastic oppervlak te maken en sleept u elk fragment totdat het stevig aan de petrischaal is vastgeplakt. Gebruik een pincet om het fragment te helpen hanteren (figuur 2B).</li>
	<li>Voeg voorzichtig 10 ml volledig kweekmedium toe om alle fragmenten te bedekken zonder ze los te maken.</li>
	<li>Incubeer de petrischaaltjes bij 37 °C en 5% CO2. De hASCs migreren uit het weefsel en worden geselecteerd vanwege hun plastische hechting zonder enzymatische spijsvertering.</li>
	<li>Tot de celsamenvloeiing controleert u de hASC-expansie onder een optische microscoop met 4x vergroting eenmaal per dag. Naarmate de hASCs uit het weefsel beginnen te komen, verschijnen ze als kleine clusters rond de weefselstukken met een typische fibroblastachtige morfologie. De hASCs worden geselecteerd vanwege hun vermogen om zich aan het plastic oppervlak te hechten. Verwijder elke 72 uur zoveel mogelijk medium en vervang het door vers compleet medium om celresten te verwijderen.</li>
	<li>Laat de fragmenten van weefsel op hun plaats tot de eerste passage van cellen, die meestal na 7 dagen is.</li>
</ol>3. hASC-cultuur na de isolatiefase
<ol><li>Wanneer de hASC-cultuur 70% -80% confluentie bereikt, zijn de hASCs klaar om te worden losgemaakt en verder uitgebreid om te worden gebruikt voor andere experimenten of langdurige opslag.</li>
	<li>Verwijder met een steriel pincet alle stukjes weefsel uit de petrischaal en gooi ze weg. Verwijder en gooi het uitgeputte medium weg, waarbij u voorzichtig bent de hASC's niet aan te raken om ze niet los te maken.</li>
	<li>Was de cellen voorzichtig eenmaal met 10 ml PBS. Voeg 1 ml 1x diervrij trypsine toe en laat de petrischaal 5 minuten in de couveuse bij 37 °C staan.</li>
	<li>Controleer onder een optische microscoop bij 4x vergroting of alle cellen zijn losgekomen; laat anders de petrischaal nog eens 2 minuten in de couveuse staan en tik uiteindelijk voorzichtig op het plastic oppervlak om celloslating te ondersteunen.</li>
	<li>Stop de trypsine-actie door 2 ml volledig medium toe te voegen en verzamel alle cellen in een buis van 15 ml.</li>
	<li>Om eventuele resterende trypsine te verwijderen, centrifugeert u de buis gedurende 5 minuten op 300 x g . Gooi het supernatant weg, suspensie van de cellen met 5 ml volledig medium en breng de celsuspensie over in een nieuwe T25-kolf. Houd de hASCs in cultuur en breid ze uit totdat ze nodig zijn.</li>
</ol>4. Immunofenotypeonderzoek door flowcytometrie
<ol><li>Wanneer de hASC-cultuur 70%-80% confluentie bereikt, maakt u de hASCs los zoals eerder beschreven in rubriek 3.</li>
	<li>Na het verzamelen van de cellen, suspensie ze in 1 ml volledig medium, en tel een aliquot met de cel teller onder een optische microscoop bij 10x vergroting.</li>
	<li>Centrifugeer de hASCs op 300 x g gedurende 5 minuten en suspensie ze op 1 x 106 cellen / ml FACS-buffer. Breng 100 μL van de suspensie met 1 x 105 cellen over in één FACS-buis. Gebruik één FACS-buis voor elk onderzocht antigeen, plus nog een voor elke isotypische controle.</li>
	<li>Kleuring van de cellen met 100 μL van de volgende antilichamen verdund in FACS-buffer: anti-CD73 (1:1.000, IgG1, FITC-gelabeld), anti-CD105 (1:200, IgG1, PE-gelabeld); anti-CD34 (1:66, IgG1, FITC-gelabeld); anti-CD45 (1:66, IgG1, FITC-gelabeld); en isotypische controles voor elke fluorofoor, IgG1 FITC-gelabeld (1:1.000) en IgG1 PE-gelabeld (1:50).</li>
	<li>Incubeer de monsters gedurende 1 uur in het donker met roeren bij 4 °C. Centrifugeer de buizen gedurende 5 minuten op 300 x g , gooi het supernatant weg en suspensie de cellen in 500 μL FACS-buffer.</li>
	<li>Beoordeel het celimmunofenotype met een flowcytometrie-instrument, waarbij 50.000 gebeurtenissen worden geregistreerd voor elke buis in de poort die is geselecteerd om celresten uit te sluiten. Bereken het percentage tot expressie brengende cellen als het verschil met de specifieke isotypische controle.</li>
</ol>5. Proliferatietest van hASC
<ol><li>Wanneer de hASC-cultuur 70%-80% confluentie bereikt, maakt u de hASCs los zoals beschreven in rubriek 3.</li>
	<li>Na het verzamelen van de cellen, suspensie ze in 1 ml volledig medium, en tel een aliquot met de cel teller onder een optische microscoop bij 10x vergroting.</li>
	<li>Zaai 5 x 102 hASCs in 200 μL compleet medium in 96-well transparante platen. Zaai de cellen in technische replicaties, met één put voor elk tijdspunt.</li>
	<li>Begin 3 dagen na het zaaien met het detecteren van de celproliferatie met behulp van een proliferatietestkit volgens de instructies van de fabrikant. Kortom, vervang het kweekmedium door 100 μL vers medium toegevoegd aan 20 μL testreagens per putje. Incubeer de hASCs gedurende 2,5 uur bij 37 °C, 5% CO2 voor reagensontwikkeling en detecteer vervolgens de absorptie bij 490 nm met een spectrofotometer.</li>
	<li>Druk de hASC-proliferatie uit als de procentuele absorptie na het verwijderen van de blanco-absorptie.</li>
</ol>6. Cryopreservatie en opslag van de hASCs
<ol><li>Maak de cellen los zoals beschreven in rubriek 3 en tel een aliquot met de celteller onder een optische microscoop bij 10x vergroting.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen op 300 x g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg. Suspensie van de cellen met vriesmengsel met een dichtheid van 1 x 106 hASCs / ml en breng 1 ml van de celoplossing over in één cryovial.</li>
	<li>Plaats de cryovialen bij −80 °C in een vriescontainer die de temperatuur met 1 °C/min verlaagt en verplaats de cryovialen vervolgens naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag.</li>
</ol>

<ol><li>Naderi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regenerative+role+of+adipose-derived+stem+cells+%28ADSC%29+in+plastic+and+reconstructive+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22International+Wound+Journal%22%5BJournal%5D)">The regenerative role of adipose-derived stem cells (ADSC) in plastic and reconstructive surgery.</a> International Wound Journal. 14 (1), 112-124 (2017).</li>
<li>Guiotto, M., Riehle, M. O., Raffoul, W., Hart, A., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+human+platelet+lysate+%28hPL%29+the+ideal+candidate+to+substitute+the+foetal+bovine+serum+for+cell-therapy+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Is human platelet lysate (hPL) the ideal candidate to substitute the foetal bovine serum for cell-therapy translational research.</a> Journal of Translational Medicine. 19 (1), 426(2021).</li>
<li>Condé-Green, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shift+toward+mechanical+isolation+of+adipose-derived+stromal+vascular+fraction%3A+Review+of+upcoming+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery.+Global+Open%22%5BJournal%5D)">Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: Review of upcoming techniques.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 4 (9), 1017(2016).</li>
<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue%3A+Implications+for+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li>
<li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+of+adipose-derived+stem+cells+and+collagenase+in+fat+tissue+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Aesthetic+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation.</a> Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).</li>
<li>Spees, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internalized+antigens+must+be+removed+to+prepare+hypoimmunogenic+mesenchymal+stem+cells+for+cell+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).</li>
<li>Fadel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+obtainment+and+isolation+of+two+mesenchymal+stem+cell+sources+in+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cirurgica+Brasileria%22%5BJournal%5D)">Protocols for obtainment and isolation of two mesenchymal stem cell sources in sheep.</a> Acta Cirurgica Brasileria. 26 (4), 267-273 (2011).</li>
<li>Markarian, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adipose-derived+stem+cells%3A+A+comparison+among+different+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Letters%22%5BJournal%5D)">Isolation of adipose-derived stem cells: A comparison among different methods.</a> Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).</li>
<li>Sherman, L. S., Condé-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-free+method+for+isolation+and+expansion+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e59419(2019).</li>
<li>Lalu, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+of+cell+therapy+with+mesenchymal+stromal+cells+%28SafeCell%29%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis+of+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Safety of cell therapy with mesenchymal stromal cells (SafeCell): A systematic review and meta-analysis of clinical trials.</a> PLoS One. 7 (10), 47559(2012).</li>
<li>Escobar, C. H., Chaparro, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-free+extraction%2C+culture%2C+and+cryopreservation+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Xeno-free extraction, culture, and cryopreservation of human adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 5 (3), 358-365 (2016).</li>
<li>Vaidya, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet-C+irradiation+for+inactivation+of+viruses+in+foetal+bovine+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet-C irradiation for inactivation of viruses in foetal bovine serum.</a> Vaccine. 36 (29), 4215-4221 (2018).</li>
<li>Kyllönen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+serum+conditions+on+osteogenic+differentiation+of+human+adipose+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Effects of different serum conditions on osteogenic differentiation of human adipose stem cells in vitro.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4 (1), 17(2013).</li>
<li>Schallmoser, K., Henschler, R., Gabriel, C., Koh, M. B. C., Burnouf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+quality+requirements+of+human+platelet+lysate%3A+A+position+statement+from+the+Working+Party+on+Cellular+Therapies+of+the+International+Society+of+Blood+Transfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production and quality requirements of human platelet lysate: A position statement from the Working Party on Cellular Therapies of the International Society of Blood Transfusion.</a> Trends in Biotechnology. 38 (1), 13-23 (2020).</li>
<li>Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelet+lysate+to+substitute+fetal+bovine+serum+in+hMSC+expansion+for+translational+applications%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human platelet lysate to substitute fetal bovine serum in hMSC expansion for translational applications: A systematic review.</a> Journal of Translational Medicine. 18 (1), 351(2020).</li>
<li>Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelet+lysate+acts+synergistically+with+laminin+to+improve+the+neurotrophic+effect+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Human platelet lysate acts synergistically with laminin to improve the neurotrophic effect of human adipose-derived stem cells on primary neurons.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 658176(2021).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Cowper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelet+lysate+as+a+functional+substitute+for+fetal+bovine+serum+in+the+culture+of+human+adipose+derived+stromal%2Fstem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Human platelet lysate as a functional substitute for fetal bovine serum in the culture of human adipose derived stromal/stem cells.</a> Cells. 8 (7), 724(2019).</li>
<li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+for+the+treatment+and+prevention+of+graft-versus-host+disease%3A+Experiments+and+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells for the treatment and prevention of graft-versus-host disease: Experiments and practice.</a> Annals of Hematology. 92 (10), 1295-1308 (2013).</li>
<li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+metal+micro+and+nano-particles+on+hASCs%3A+An+in+vitro+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials%22%5BJournal%5D)">Effects of metal micro and nano-particles on hASCs: An in vitro model.</a> Nanomaterials. 7 (8), 212(2017).</li>
<li>Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stromal+vascular+fraction+cells%3A+Update+on+clinical+utility+and+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Eukaryotic+Gene+Expression%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy.</a> Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).</li>
<li>Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+medium+composition+and+translational+adult+bone+marrow-derived+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Cell culture medium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research.</a> Stem Cells. 24 (5), 1409-1410 (2006).</li>
<li>Perez-Ilzarbe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+ex+vivo+expansion+culture+conditions+of+mesenchymal+stem+cells+for+human+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Comparison of ex vivo expansion culture conditions of mesenchymal stem cells for human cell therapy.</a> Transfusion. 49 (9), 1901-1910 (2009).</li>
<li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+cell-detaching+methods+on+the+viability+and+cell+surface+antigen+expression+of+synovial+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li>
<li>Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-enzymatic+method+for+isolating+human+adipose+tissue-derived+stromal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).</li>
<li>Becherucci, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelet+lysate+in+mesenchymal+stromal+cell+expansion+according+to+a+GMP+grade+protocol%3A+A+cell+factory+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Human platelet lysate in mesenchymal stromal cell expansion according to a GMP grade protocol: A cell factory experience.</a> Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 124(2018).</li>
<li>Blande, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+mesenchymal+stem+cell+expansion+in+animal+serum-free+medium+supplemented+with+autologous+human+platelet+lysate%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate.</a> Transfusion. 49 (12), 2680-2685 (2009).</li>
<li>Castegnaro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+platelet+lysate+on+the+functional+and+molecular+characteristics+of+mesenchymal+stem+cells+isolated+from+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Effect of platelet lysate on the functional and molecular characteristics of mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue.</a> Current Stem Cell Research & Therapy. 6 (2), 105-114 (2011).</li>
<li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+review+and+meta-analysis+on+the+use+of+human+platelet+lysate+for+mesenchymal+stem+cell+cultures%3A+Comparison+with+fetal+bovine+serum+and+considerations+on+the+production+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Systematic review and meta-analysis on the use of human platelet lysate for mesenchymal stem cell cultures: Comparison with fetal bovine serum and considerations on the production protocol.</a> Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 142(2022).</li>
<li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelet+lysate+as+a+potential+clinical-translatable+supplement+to+support+the+neurotrophic+properties+of+human+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Human platelet lysate as a potential clinical-translatable supplement to support the neurotrophic properties of human adipose-derived stem cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 432(2020).</li>
<li>Krähenbühl, S. M., Grognuz, A., Michetti, M., Raffoul, W., Applegate, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+human+adipose-derived+stem+cell+expansion+and+stability+for+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Enhancement of human adipose-derived stem cell expansion and stability for clinical use.</a> International Journal of Stem Cell Research & Therapy. 2 (1), 007(2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Van vetweefsel afgeleide stamcellen hebben de afgelopen tien jaar de belangstelling van translationeel onderzoek getrokken vanwege hun overvloed, snelle en betaalbare isolatiemethoden, hoge in vitro / in vivo proliferatiesnelheid en stam / differentiatie-eigenschappen18,19,20. Als gevolg hiervan worden hASCs beschouwd als een uitstekende kandidaat voor celgebaseerde strategieën in regeneratieve geneeskunde<sup ...

In de afgelopen decennia heeft de toenemende vraag naar innovatieve therapeutische behandelingen geleid tot aanzienlijke inspanningen en investeringen in middelen op het gebied van translationele geneeskunde1. Celgebaseerde producten worden geassocieerd met risico's die worden bepaald door de celbron, het productieproces (isolatie, expansie of genetische modificatie) en de niet-cellulaire supplementen (enzymen, groeifactoren, kweeksupplementen en antibiotica), en deze risicofactoren zijn afhankelijk van de specifieke therapeutische indicatie. De kwaliteit, veiligheid en werkzaamheid van het eindproduct kunnen sterk worden beïnvloed door de hierboven aangegeven elementen2. Stamceltherapie vereist naleving van bioveiligheidsprincipes; De potentiële risico's van pathogene overdracht met dierlijke producten in celkweek kunnen problematisch zijn, en het grondig testen van elk product dat bij de productie wordt geïntroduceerd, is essentieel3.
De traditionele methode om menselijke vet-afgeleide stamcellen (hASCs) te isoleren, omvat een enzymatische vertering uitgevoerd met collagenase gevolgd door wasstappen door centrifugatie4. Hoewel enzymatische isolatie over het algemeen als efficiënter wordt beschouwd dan andere mechanische technieken in termen van celopbrengst en levensvatbaarheid, worden de gebruikte dierlijke componenten, zoals collagenase, beschouwd als meer dan minimaal gemanipuleerd door de Amerikaanse Food and Drug Administration. Dit betekent dat er een significant verhoogd risico is op immuunreacties of ziekteoverdracht, waardoor de vertaling van hASC-therapie naar klinische settingswordt beperkt 5,6.
Op trypsine gebaseerde spijsvertering is een ander enzymatisch protocol om ASC's te isoleren. Verschillende technieken zijn beschreven met kleine wijzigingen in termen van de trypsineconcentratie, centrifugatiesnelheid en incubatietijd. Helaas is deze methode niet goed beschreven en bestaat er een gebrek aan vergelijking in de literatuur, met name met de mechanische isolatieprotocollen7. In termen van de vertaalbaarheid van de aanpak heeft trypsine echter dezelfde nadelen van collagenase.
Alternatieve isolatiemethoden om ASC's te verkrijgen, gebaseerd op mechanische krachten en zonder enzymtoevoeging, omvatten snelle centrifugatie (800 x g of 1.280 x g, 15 min) van de vetweefselfragmenten. Vervolgens wordt de pellet geïncubeerd met een rode bloedcellysisbuffer (5 min), gevolgd door een andere centrifugatiestap bij 600 x g voordat deze in kweekmedium wordt geresuspenseerd. Ondanks dat een groter aantal cellen in de eerste dagen werd geïsoleerd in vergelijking met de explantatiemethoden, toonde een eerdere studie een lagere of afwezige proliferatie na de tweede week van cultuur8.
Daarnaast is verdere manipulatie met xenogeen toegevoegd medium, zoals foetaal runderserum (FBS), dat wordt gebruikt als groeifactorsupplement voor celkweek, geassocieerd met een verhoogd risico op immuunreactiviteit en blootstelling aan virale, bacteriële of prioninfecties van de gastheerpatiënt 9,10. Immuunreacties en de ontwikkeling van urticariforme huiduitslag zijn al beschreven bij personen die verschillende doses mesenchymale stamcellen kregen die werden geproduceerd met FBS11. Bovendien is FBS onderhevig aan batch-to-batch variabiliteit, wat van invloed kan zijn op de uiteindelijke productkwaliteit12.
In overeenstemming met de richtlijnen voor goede productiepraktijken (GMP) moet enzymatische weefseldissociatie worden vermeden en moet FBS worden vervangen door xenogene-vrije supplementen. Deze stappen, samen met betrouwbaardere en reproduceerbare protocollen, zijn essentieel om de toepassing van celtherapiete ondersteunen 3,13.
In deze context is humaan bloedplaatjeslysaat (hPL) voorgesteld als een substituut voor FBS, omdat het een celvrij, eiwitbevattend, met groeifactor verrijkt supplement is, en het werd eerder geïntroduceerd onder op klinische kwaliteit op cellen gebaseerde producten als een additief van groeimedium voor in vitro celkweek en expansie14,15. Aangezien hPL een van de mens afgeleid product is, wordt het vaak gebruikt als vervanging voor FBS tijdens de in vitro kweek van hASCs bedoeld voor klinische toepassingen, waardoor problemen met immunologische reacties en infecties gerelateerd aan FBS-vertaalbaarheid worden verminderd15,16.
Ondanks de hogere productiekosten is al aangetoond dat hPL in vergelijking met FBS de levensvatbaarheid van cellen voor veel celtypen ondersteunt, de proliferatie verhoogt, de senescentie vertraagt, genomische stabiliteit garandeert en het cellulaire immunofenotype behoudt, zelfs in late celpassages; Al deze elementen ondersteunen de omschakeling naar dit cultuursupplement11.
Het doel van dit werk was om een gestandaardiseerd protocol te ontwikkelen om hASCs te isoleren en te kweken met een volledige diervrije methode, zonder de celfysiologie en stamheidseigenschappen te wijzigen in vergelijking met klassieke FBS-gekweekte hASCs (figuur 1).

<table><tbody><tr><td>15 mL tubes</td><td>euroclone</td><td>et5015b</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD105</td><td>BD Biosciences</td><td>BD560839</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>BD555821</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>BD555482</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD73</td><td>BD Biosciences</td><td>BD561254</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer)</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument)</td><td>BD accuri</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Burker chamber</td><td>Blaubrand</td><td>717810</td><td></td></tr><tr><td>Cell freezing container</td><td>corning</td><td>CLS432002</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell Freezing container</td><td>Corning</td><td>CLS432002</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>clearline</td><td>390701</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100mL</td><td></td></tr><tr><td>disposabile blade scalpel</td><td>paragon</td><td>bs 2982</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose</td><td>GIBCO</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Human Platelet Lysate FD (GMP grade)</td><td>Stemulate</td><td>PL-NH-500</td><td></td></tr><tr><td>Infinite F50 spectrophotometer</td><td>Tecan</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 10 cm</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Sterile scalpels</td><td>Reda</td><td>07104-00</td><td></td></tr><tr><td>Sterile scissors</td><td>Bochem</td><td>4071</td><td></td></tr><tr><td>Sterile tweezers</td><td>Bochem</td><td>1152</td><td></td></tr><tr><td>Swinging bucket centrifuge</td><td>Sigma</td><td>3-16K</td><td></td></tr><tr><td>T25 flasks</td><td>Greiner bio-one</td><td>6910170</td><td></td></tr><tr><td>TrypLe (animal free trypsin substitute)</td><td>GIBCO</td><td>12604-013</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie en kweek van menselijke vetstamcellen met een innovatieve xenogene-vrije methode voor menselijke therapie

Isolation and Culture of Human Adipose-Derived Stem Cells With an Innovative Xenogeneic-Free Method for Human Therapy

Gezien de toenemende impact van stamceltherapie zijn er zorgen geuit over de bioveiligheid met betrekking tot mogelijke besmetting of infectieoverdracht als gevolg van de introductie van dierlijke producten tijdens in vitro manipulatie. De xenogene componenten, zoals collagenase of foetaal runderserum, die vaak worden gebruikt tijdens de celisolatie en expansiestappen, kunnen worden geassocieerd met de potentiële risico's van immuunreactiviteit of virale, bacteriële en prioninfectie bij de ontvangende patiënten. Volgens de richtlijnen voor goede productiepraktijken moet dissociatie van chemisch weefsel worden vermeden, terwijl foetaal runderserum (FBS) kan worden vervangen door xenogene-vrije supplementen. Om de veiligheid van celproducten te waarborgen, is bovendien de definitie van betrouwbaardere en reproduceerbare methoden belangrijk. We hebben een innovatieve, volledig xenogeneïsche vrije methode ontwikkeld voor de isolatie en in vitro expansie van menselijke vet-afgeleide stamcellen zonder hun eigenschappen te veranderen in vergelijking met collagenase FBS-gekweekte standaardprotocollen. Hier werden menselijke vet-afgeleide stamcellen (hASCs) geïsoleerd uit abdominaal vetweefsel. Het monster werd mechanisch gehakt met een schaar / een scalpel, micro-ontleed en mechanisch gedispergeerd in een petrischaal van 10 cm, en bereid met scalpelincisies om de aanhechting van de weefselfragmenten en de migratie van hASCs te vergemakkelijken. Na de wasstappen werden hASC's geselecteerd vanwege hun plastische hechting zonder enzymatische vertering. De geïsoleerde hASCs werden gekweekt met medium aangevuld met 5% heparinevrij humaan bloedplaatjeslysaat en losgemaakt met een diervrij trypsinesubstituut. Volgens de aanwijzingen voor goede productiepraktijken (GMP) voor de productie van celproducten die bedoeld zijn voor menselijke therapie, werden in geen enkel kweekmedium antibiotica gebruikt.

Door de hierboven beschreven isolatiemethode toe te passen, werden hASCs met succes verkregen uit abdominale vetweefselmonsters zonder het gebruik van collagenase. Bovendien werden de hASCs uitgebreid in volledig xenogene-vrije omstandigheden in aanwezigheid van hPL en zonder andere componenten van dierlijke oorsprong. De volgende resultaten ondersteunen het protocol en worden verkregen uit hASCs die parallel met hPL en met FBS als controlevoorwaarde zijn gekweekt.
Na het eerste clusteroptrede...

Xenogene (chemische of dierlijke afgeleide) producten die worden geïntroduceerd in de voorbereidings-/manipulatiestappen voor celtherapie zijn geassocieerd met een verhoogd risico op immuunreactiviteit en pathogene overdracht bij gastheerpatiënten. Hier wordt een volledig xenogeneïsche vrije methode beschreven voor de isolatie en in vitro expansie van menselijke vet-afgeleide stamcellen.

Isolatie en kweek van menselijke vetstamcellen met een innovatieve xenogene-vrije methode voor menselijke therapie

Considering the increasing impact of stem cell therapy, biosafety concerns have been raised regarding potential contamination or infection transmission ...

Onze exogeen-vrije methode voor isolatie en in vitro expansie van menselijke vet-afgeleide stamcellen is het antwoord op de bioveiligheidsproblemen rond celtherapie wanneer het wordt overwogen voor translationele toepassing. Onze isolatie- en uitbreidingsmethoden zijn eenvoudig te repliceren, snel en laag in technische vereisten, waardoor ze voor iedereen nuttig zijn. We onderzoeken de op menselijke vetstamcellen gebaseerde therapiestrategie voor perifeer zenuwherstel.Onze techniek kan echter op grote schaal worden toegepast wanneer nieuwe vetstamcellen nodig zijn in verschillende klinische onderzoeksopstellingen. We hebben het eenvoudig gehouden om de produceerbaarheid te behouden. De steriliteit moet zorgvuldig worden geobserveerd vanaf de operatiekamer tot de celkweek.Voor monstermanipulatie en fragmenten lopen microdissecties een risico op besmetting. Na het verkrijgen van het vetweefselmonster van abdominale plastische chirurgie, met behulp van een steriele schaar, snijdt u het in stukken van ongeveer een vierkante centimeter. Met een scalpel ontleed micro elk stuk in kleinere fragmenten en verspreid vijf fragmenten in een petrischaal van 10 centimeter.Gebruik voor fragmentbevestiging een scalpel om incisies op het plastic oppervlak te maken en sleep elk fragment. Voeg voorzichtig 10 milliliter compleet kweekmedium toe om alle fragmenten te bedekken zonder ze los te maken en incuber de petrischaal bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Controleer de menselijke vet-afgeleide stamcel, of HASC, expansie dagelijks onder een optische microscoop totdat cellen confluent worden.Vervang het medium elke 72 uur door een vers compleet medium om celresten te verwijderen en laat ze groeien tot de eerste passage. Zodra de HASC-cultuur 70 tot 80% confluentie bereikt, verwijdert u alle stukjes weefsel en gooit u deze weg met een steriel pincet. Gooi ook het uitgeputte medium weg en vermijd het loslaten van de HASC van de petrischaal.Was de cellen voorzichtig met 10 milliliter PBS. Voeg na het verwijderen van PBS een milliliter diervrij trypsine toe en incubeer gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Controleer op celloslating onder een optische microscoop en incubeer indien nodig nog twee minuten.Om de celloslating te ondersteunen, tikt u voorzichtig op het plastic oppervlak. Stop de trypsine-actie door twee milliliter compleet medium toe te voegen en verzamel alle cellen in een buis van 15 milliliter. Verwijder de resterende trypsine door centrifugeren.Nadat u het supernatant hebt weggegooid, suspenseert u de cellen in een volledig medium van vijf milliliter en brengt u de celsuspensie over naar een nieuwe T25-kolf. Tel voor cryoconservering een aliquot van losgemaakte losgemaakte cellen met behulp van de celteller onder een optische microscoop. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten op 300 G.Na het weggooien van het supernatant, suspensieer de cellen in het vriesmengsel met een dichtheid van één maal 10 tot de zesde cellen per milliliter en breng één milliliter van de celsuspensie over in één cryoflacon. Plaats de cryoflacons op min 80 graden Celsius in een vriescontainer die de temperatuur met één graad Celsius per minuut verlaagt en verplaats de cryoflacons vervolgens naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag. In het eerste clusterbeeld vertoonden de HASC's een klassieke spilachtige vorm en waren ze kleiner en langwerpiger in vergelijking met de controlecellen in aanwezigheid van FBS.Het celimmunofenotype bleek vergelijkbaar te zijn tussen de HASCs gekweekt met de twee supplementen. Meer dan 80 tot 90% van de HASCs was positief voor CD73 en CD105 en minder dan 5% uitgedrukt voor CD34 en CD45. Ten slotte onthulde de proliferatietest een significante toename van de celgroei wanneer menselijk bloedplaatjeslysaat aan het medium werd toegevoegd in vergelijking met de FBS-controle.De belangrijkste stap is de microdissectie van vetfragmenten en hun aanhechting met scalpelincisie op petrischaal. Een gebruiksklare menselijke vetstamcelpopulatie wordt verkregen met betrekking tot de GMP-bioveiligheidscriteria, waarbij de therapeutische celeigenschappen behouden blijven en de celproliferatie wordt verbeterd.

isolation-culture-human-adipose-derived-stem-cells-with-an-innovative

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

In 2001, onderzoekers van UCLA beschreef de isolatie van een populatie van volwassen stamcellen, genaamd vet-afgeleide stamcellen of ASC, uit vetweefsel. Dit artikel schetst de isolatie van ASC uit lipoaspirates behulp van een handleiding, enzymatische afbraak protocol met behulp van collagenase.

Handmatig Isolatie van vetweefsel-afgeleide stamcellen uit menselijke Lipoaspirates

De transcriptionele heterogeniteit binnen humane adipogeen-afgeleide stromale cellen kan op enkelcellig niveau worden gedefinieerd met behulp van celoppervlaktemarkers en osteogene genen. We beschrijven een protocol dat flowcytometrie gebruikt voor de isolatie van celsubpopulaties met verhoogd osteogeen potentieel, die kunnen worden gebruikt om craniofaciale skeletreconstructie te verbeteren.

Isolatie en Verrijking van Human Adipose-afgeleide stromale cellen voor Enhanced Osteogenesis

Volwassen adipocyten kunnen een overvloedige bron van stamcellen vertegenwoordigen door dedifferentiatie, wat leidt tot een homogene populatie van fibroblast-achtige cellen. Collagenase-digestie wordt gebruikt om volwassen adipocyten uit menselijk vet te isoleren. Het doel van ons protocol is om multipotente, dedifferentieerde vetcellen te verkrijgen uit menselijke volwassen adipocyten.

Generatie van de Mens Adipose stamcellen via dedifferentieëren Mature Adipocyten in Plafond Culturen

De differentiatie van wit en beige adipocytes uit vetweefsel vasculaire progenitoren beren mogelijkheden voor metabole verbetering in obesitas. We beschrijven protocollen voor een CD34 + CD31 + endothelial cel los van menselijk vet en voor een latere in vitro expansie en de differentiatie in wit en beige adipocytes. Verschillende downstream toepassingen worden besproken.

Isolatie, uitbreiding en Adipogenic inductie van CD34 + CD31 + endotheliale cellen van menselijke Omental en onderhuids vetweefsel

Dit protocol biedt een enzym vrije methode voor het isoleren van mesenchymale stamcellen uit correctie-en lipoaspirate-monsters met behulp van een explant methode. De afwezigheid van harde enzymen of centrifugeer stappen voorziet in klinisch relevante stamcellen die kunnen worden gebruikt voor studies in vitro of teruggeplaatst naar de kliniek.

Een enzym vrije methode voor isolatie en uitbreiding van mesenchymale stamcellen van menselijke adipeus

Hier presenteren we menselijke vetweefsel enzym-vrije micro-fragmentatie met behulp van een gesloten systeem apparaat. Deze nieuwe methode maakt het verkrijgen van sub-millimeter clusters van vetweefsel geschikt voor in vivo transplantatie, in vitro cultuur, en verdere celisolatie en karakterisering.

Menselijke vetweefsel micro-fragmentatie voor Celfenotyping en Secretome karakterisatie

We beschrijven een 3D menselijke extracellulaire matrix-adipocyte in vitro cultuur systeem dat het mogelijk maakt dissectie van de rollen van de matrix en adipocytes in bij te dragen tot vetweefsel metabole fenotype.

Een menselijke 3D-extracellulaire matrix-Adipocyte cultuur model voor het bestuderen van matrix-cel metabole Overspraak

Het huidige protocol beschrijft een verbeterde methodologie voor ADSC-isolatie, wat resulteert in een enorme cellulaire opbrengst met tijdwinst in vergelijking met de literatuur. Deze studie biedt ook een eenvoudige methode voor het verkrijgen van een relatief groot aantal levensvatbare cellen na cryopreservatie op lange termijn.

Techniek voor het verkrijgen van mesenchymale stamcel uit vetweefsel en stromale vasculaire fractiekarakterisering bij cryopreservatie op lange termijn

Dit protocol beschrijft een methodologie voor het isoleren en identificeren van van vetweefsel afgeleide mesenchymale stamcellen (MSC's) van Sprague Dawley-ratten.

Isolatie en identificatie van mesenchymale stamcellen afgeleid van vetweefsel van Sprague Dawley-ratten

Het vetweefsel is een uitstekende bron van mesenchymale stamcellen. Hier brengen we de stapsgewijze extractie, cultivatie en karakterisering van van vetweefsel afgeleide stamcellen (ADSC's) uit epididymaal vetweefsel van Zwitserse muizen.

Isolatie, in-vitro-expansie en karakterisering van mesenchymale stamcellen uit epididymaal vetweefsel van muizen

Hier presenteren we een standaardmethode om effectief stamcellen en adipocyten van vetweefsel te isoleren, gekenmerkt door &gt;90% vermindering van verwerkingstijd, hoge cellevensvatbaarheid en brede compatibiliteit.

Efficiënte isolatie van vetweefselstamcellen en adipocyten uit varkensvet vetweefsel

Leer een xenogene-vrije methode voor isolatie en kweek van menselijke vetstamcellen voor celtherapie. Deze techniek vermindert biosafety-risico's en is eenvoudig te repliceren in klinisch onderzoek.

Isolatie en kweek van menselijke vetstamcellen met een innovatieve xenogene-vrije methode voor menselijke therapie

Meer video's verkennen