Name: Het meten van de snelheid van lipolyse in ex vivo muizenvetweefsel en primaire preadipocyten gedifferentieerd in vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Leer lipolysemeting in muizenadipocyten en ex vivo vetweefsel met seriële bemonstering en enzymatische assays. Deze methode valideert lineaire lipolytische snelheden voor metabool onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de Amerikaanse National Institutes of Health subsidie R01DK126944 aan SMR.

Het gebruik van alle dieren werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan het Weill Cornell Medical College van Cornell University.
1. Voorbereiding van buffers en opvangplaten
<ol><li>Maak 5% runderserumalbumine (BSA) door 5 g BSA op te lossen in 100 ml Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) zonder fenolrood. Roer de BSA voorzichtig om op te lossen (schudden werkt averechts). Zodra de BSA volledig is opgelost, filter-steriliseer de media met een 0,2 μm filter. Bewaar de BSA media bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand.</li>
	<li>Maak werkconcentraties van controle- en stimulatiemedia. Besturingsmedia: 5% BSA-media met voertuigbesturing. Stimulatiemedia: 5% BSA-media met 0,5 μM CL-316,243. Maak nieuwe stimulatiemedia voor elk experiment.</li>
	<li>Verwarm de te gebruiken media tot 37 °C. Label een plaat met 96 putten voor mediaverzameling.</li>
</ol>2. Monstervoorbereiding
<ol><li>Voer celkweek uit zoals hieronder beschreven. Voer alle celwerkzaamheden uit in een steriele zuurkast om besmetting van buitenaf te minimaliseren.<ol><li>Isoleer en differentieer primaire preadipocyten, zoals in73,74.<ol><li>Plaat primaire preadipocyten met een hoge dichtheid, zoals 1 x 105 cellen / put in een 24-well plaat in 1 ml / put kweekmedia (15% foetaal runderserum (FBS) en 1x penicilline-streptomycine-glutamine in DMEM / F12).</li>
			<li>Nadat de cellen 100% confluentie hebben bereikt, differentiëren met 5 μM dexamethason, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine, 1 μg / ml insuline en 1 μM thiazolidinedion (TZD) in kweekmedia gedurende 3 dagen. Schakel vervolgens over op kweekmedia met 1 μg / ml insuline gedurende ten minste 3 dagen om lipidedruppels te laten groeien. Gebruik 1 ml/put media in de 24-well plaat.</li>
			<li>Vervang de kweekmedia (1 ml/put) met insuline om de 2 of 3 dagen. De cellen kunnen tot 2 weken in media met insuline worden gehouden. Gebruik alleen culturen waarin de differentiatiepercentages meer dan 90% zijn en vergelijkbaar zijn tussen groepen voor deze test, omdat verminderde differentiatie verkeerd kan worden geïnterpreteerd als een verlaging van de lipolytische snelheid.</li>
			<li>Kweek de cellen in insulinevrije media gedurende 24 uur voorafgaand aan het meten van lipolyse. OPMERKING: Insuline in de media onderhoudt lipidedruppels, maar remt ook lipolyse. Incubatie zonder insuline gedurende 24 uur zorgt voor volledige lipolytische activering zonder verlies van lipidedruppelvolume. In sommige systemen moet de kweektijd zonder insuline mogelijk worden verkort of verlengd.</li>
		</ol></li>
		<li>Was de cellen eenmaal met DPBS om het resterende serum uit de kweekmedia te verwijderen. OPMERKING: Dit protocol omvat geen serumuithongering, die lipolyse kan activeren. Serumhonger kan naar goeddunken van de onderzoeker worden gebruikt.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer ex vivo cultuur uit zoals hieronder beschreven.<ol><li>Bereid een plaat met 6 putten voor, met één put voor elk weefsel dat van elke muis moet worden verzameld. Plaats 4 ml DMEM op kamertemperatuur in elke te gebruiken put. OPMERKING: BSA in de verzamelmedia is niet nodig.</li>
		<li>Bereid een plaat met 48 putten voor de lipolysetest, met één put voor elke replicatie. Plaats 400 μL DMEM op kamertemperatuur in elke te gebruiken put. Gebruik twee tot vier controle- en twee tot vier gestimuleerde putjes per weefsel per muis.</li>
		<li>Euthanaseer de muis door cervicale dislocatie onder anesthesie, met een secundaire methode zoals bilaterale pneumothorax. Hier gebruikten we een 32 g, 7 maanden oude vrouwelijke C57BL / 6J-muis, gevoed met een 45% vetrijk dieet gedurende 4 maanden. OPMERKING: Dit protocol kan ook worden gebruikt voor mannen, evenals andere stammen, diëten en leeftijden.</li>
		<li>Spray met 70% ethanol en gebruik een schaar om een kleine (~ 1 cm) laterale incisie in het midden van de buikhuid te maken, trek de huid uit elkaar door aan weerszijden met duim en wijsvinger te knijpen en vouw de onderbuikhuid om om de achterste onderhuidse depots te onthullen. Lokaliseer en verwijder de inguinale lymfeklier en ontleed het inguinale vetweefsel onmiddellijk na de inguinale lymfeklier met een tang.</li>
		<li>Om het gonadale vetweefsel te verzamelen, maakt u een laterale en een verticale incisie in het peritoneum om toegang te krijgen tot de peritoneale holte. Houd het gonadale vetkussen vast met een pincet en snijd langs de baarmoeder (of bijbal voor mannen) om het gonadale vetweefsel te verwijderen. Plaats de verzamelde depots in een 6-well plaat.</li>
		<li>Verwijder het weefsel goed, leg het op een siliconenmat en snijd met een schaar in stukjes van 5 tot 7 mg.</li>
		<li>Weeg 25 tot 30 mg (vijf of zes brokken) voor elke test goed af en plaats in een 48-well assay-plaat. Dep de tissue op een schone handdoek voordat u weegt om eventuele media te verwijderen. Weeg het gewicht na verwijdering van het weefsel en noteer het gewicht van eventuele achtergebleven resten. Veeg de gewichtsboot schoon tussen de monsters en reparaer indien nodig. Gebruik een nieuwe gewichtsboot voor elk weefsel.</li>
		<li>Zodra alle weefselmonsters zijn gewogen, plaatst u de 48-well assay plate in een 37 °C, 10% CO 2-incubator gedurende 15 minuten.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Lipolyse-test
<ol><li>Mediaverzameling uitvoeren. Voer de overdracht van de media en de daaropvolgende monsterverzameling uit in een steriele zuurkast om mogelijke verontreiniging door externe bronnen te minimaliseren.<ol><li>Bij t = 0 verwijdert u de media en voegt u 400 μL per put controle- of stimulatiemedia toe en plaatst u de plaat in een 37 °C, 10% CO 2-incubator. Voor ex vivo weefselkweek, verwijder media voorzichtig met behulp van een pipet; zuigkracht mag nooit worden gebruikt. OPMERKING: U kunt ook een tweede plaat met controle- en stimulatiemedia voorbereiden en de weefsels overbrengen.</li>
		<li>Verzamel bij t = 1, 2, 3 en 4 uur 200 μL media, vervang door 200 μL van de juiste controle- of stimulatiemedia en breng de testplaat terug naar de incubator. Bewaar de opvangplaat bij 4 °C. Om de FFA-buffercapaciteit van de BSA-media te bepalen, gebruikt u een extra verzameling na 24 uur. OPMERKING: De experimenten kunnen hier worden gestopt en de verzamelde media kunnen worden opgeslagen bij -20 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>4. FFA colorimetrische assay
<ol><li>Verwarm de reagentia tot kamertemperatuur en los één fles kleurreagens A op met één fles oplosmiddel A en één fles kleurreagens B met één fles oplosmiddel B. Vanaf de datum van reconstitutie kunnen deze reagentia het beste binnen 1 week worden gebruikt. 1 maand na reconstitutie weggooien.</li>
	<li>Ontdooi en meng de monsters.</li>
	<li>Maak een FFA-standaardcurve. De standaardoplossing is 1 mM. Gebruik het volgende volume met de reagentia voor de standaardcurve: 25 μL, 20 μL, 15 μL, 10 μL, 10 μL (1:2 verdunning), 10 μL (1:4 verdunning), 10 μL (1:8 verdunning) en 10 μL water voor maximaal bereik. Voor lage FFA-niveaus kan de standaard 10 μL van 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM en 0,05 mM meer van toepassing zijn.</li>
	<li>Pipetstandaarden en monsters in een 96-well assayplaat. Het aanbevolen monstervolume is 10 μL. Neem drie putjes op met hetzelfde volume BSA-media als de monsters voor achtergrondcorrectie. OPMERKING: Als de monsterconcentraties buiten het bereik van de standaardcurve vallen, herhaalt u de test en stelt u het monstervolume in op 2-25 μl.</li>
	<li>Voeg 150 μL reagens A toe aan elke put en meng. Vermijd het genereren van bubbels. Knal eventuele bubbels met een fijne naald. Incubeer de testplaat bij 37 °C gedurende 5 min.</li>
	<li>Lees de absorptie van de plaat af bij 550 nm en 660 nm referentie (aflezing A).</li>
	<li>Voeg 75 μL reagens B toe aan elke put en meng. Vermijd het genereren van bubbels. Knal eventuele bubbels met een fijne naald. Incubeer de testplaat bij 37 °C gedurende 5 min.</li>
	<li>Lees de absorptie van de plaat opnieuw af bij 550 nm en 660 nm referentie (Reading B).</li>
</ol>5. Glycerol colorimetrische assay
<ol><li>Reconstitueer het vrije glycerolreagens met 36 ml ultrapuur water en acclimatiseer aan kamertemperatuur. Deze reagentia kunnen het beste binnen enkele weken worden gebruikt. 2 maanden na reconstitutie weggooien.</li>
	<li>Ontdooi en meng de monsters.</li>
	<li>Maak een glycerolstandaardcurve door een zevenpunts, 2-voudige seriële verdunning van de glycerolstandaardoplossing en een waterblanco te maken. OPMERKING: De standaardcurve is relatief lineair tot 25 μL van 2,8 mM glycerol, maar niet lineair bij hogere concentraties.</li>
	<li>Pipetteer 25 μL elk van de standaard en monsters in de 96-well assay plaat. Voeg drie putten toe aan de BSA-media voor achtergrondcorrectie.</li>
	<li>Voeg 175 μL vrij glycerolreagens toe aan elke put en meng. Vermijd het genereren van bubbels. Knal eventuele bubbels met een fijne naald. Incubeer de testplaat bij 37 °C gedurende 5 min.</li>
	<li>Lees de absorptie van de plaat bij 540 nm.</li>
</ol>6. Berekening van de lipolytische snelheid
<ol><li>Begin met optische dichtheidswaarden (OD). Gebruik voor glycerol direct A540 OD-waarden. Bereken de OD van de FFA-test volgens de volgende formule: OD = (Lezing B: A 550 - A 660) - (Lezing A: A550 - A 660)</li>
	<li>Gebruik de standaardcurve om de FFA- en glycerolniveaus in de verzamelde monsters te berekenen. Zet de standaard OD-waarden uit op de y-as en gebruik op de x-as standaardconcentraties ten opzichte van het monstervolume (d.w.z. de concentratie van de putten met 20 μL van 1 mM FFA-standaard op een plaat met 10 μL-monsters is gelijk aan 2 mM). Pas een lineaire trendlijn aan: y = mx + b</li>
	<li>Inspecteer de standaardcurve visueel en verwijder alle punten buiten het lineaire bereik van de test. Bereken de monsterconcentraties met behulp van de vergelijking: Monsterconcentratie: x = (OD - b) ÷ m</li>
	<li>Pas monsters aan en test deze opnieuw die buiten het lineaire testbereik vallen. Om de uiteindelijke monsterconcentratie te verkrijgen, trekt u de concentratie van de achtergrondputten die alleen BSA-media bevatten af van de concentratie van de monsters.</li>
	<li>Bereken de mol FFA en glycerol geproduceerd door elk monster op elk tijdstip, volgens de formule: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65106/65106eq01.jpg" style="margin: auto;"> waarbij C n = concentratie op tijdstip t = n; Vt = totaal volume in de put; Vs = volume van de monsterneming; en M n = mol geproduceerd op tijdstip t = n (wanneer de concentraties in mM zijn en de volumes in ml zijn, is de output μMol). Voorbeelden, op verschillende tijdstippen: M 1 = C1 × Vt M 4 = C4 × Vt + (C1 + C2+ C3)Vs of M 4 = C4 × Vt + C3 × V s + C2 × V s + C1 ×V s</li>
	<li>Normaliseer tot weefselgewicht door het weefselgewicht voor elk monster in grammen te delen om eenheden μmol/g te verkrijgen. Voor gekweekte cellen worden waarden gepresenteerd als μmol/well. Zorg ervoor dat het celaantal en de differentiatie-efficiëntie vergelijkbaar zijn van goed tot goed. OPMERKING: Verschillen in proliferatie- of differentiatie-efficiëntie zullen de interpretatie van resultaten bemoeilijken en een andere methode van normalisatie vereisen (bijv. Normalisatie naar eiwit; zie discussie).</li>
	<li>Bereken de helling van de geproduceerde μmol/g (y-as) versus tijd (x-as) voor elk monster afzonderlijk.<ol><li>In een spreadsheet kan dit worden gedaan met behulp van de functie =SLOPE(known_ys,known_xs). Typ in een nieuwe cel "=SLOPE" (gebruik vervolgens de cursor om de glycerol- of FFA-waarden van het monster in μmol/g te markeren en vervolgens de bijbehorende tijdwaarden te markeren).</li>
		<li>Controleer de lineariteit van de gegevens. R2-waarden zijn een snelle manier om de lineariteit van de monsters te bepalen. In een spreadsheet kan dit worden gedaan met behulp van de functie =RSQ(known_ys,known_xs), op dezelfde manier als beschreven in stap 6.7.1, maar de initiële invoer is =RSQ. Zorg ervoor dat de R2-waarden > 0,98 zijn; lagere waarden duiden op afwijking van de lineariteit. Dit kan het gevolg zijn van een meet-/bemonsteringsfout of verlies van lineariteit.<ol><li>Een andere manier om de lineariteit te testen, is door voor elk monster een lineaire regressie uit te voeren en de residuen uit te zetten. Genereer in statistische analysesoftware een XY-tabel met één Y-waarde voor elk tijdstip. Selecteer Analyseren > Eenvoudige lineaire regressie en selecteer het vakje voor Residuele plot voordat u op OK drukt. De resterende grafiek wordt weergegeven als een nieuwe grafiek.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Gebruik de FFA- en glycerolproductiesnelheid (d.w.z. helling [(μmol/g/h]) voor elk monster als een individueel gegevenspunt om statistische analyse uit te voeren en waarden uit te zetten als verschillende lipolytische omstandigheden worden vergeleken. Als lipolytische snelheden worden vergeleken tussen genotypen, gebruik dan twee of drie monsters per dier als technische replicaties en gebruik het gemiddelde voor één gegevenspunt per dier, zodat de steekproefgrootte gelijk is aan het aantal dieren.</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier bieden we een basisprotocol voor het meten van de snelheid van lipolyse in adipocyten en ex vivo vetweefsel. Om lipolyse te kwantificeren, is het belangrijk om de lipolytische snelheid in de lineaire fase te meten. We maken gebruik van een seriële bemonsteringstechniek, waarbij een groot deel van de media wordt verzameld en op regelmatige tijdstippen wordt vervangen door verse media. Deze semiconservatieve methode maakt de toevoeging van verse BSA met FFA-buffercapaciteit mogelijk en vertraagt feedbackremmi...

Overtollige voedingsstoffen worden opgeslagen in wit vetweefsel in de vorm van triglyceriden in de neutrale lipidekern van lipidedruppels. Triglyceridevoorraden worden gemobiliseerd via lipolyse, een proces waarbij de vetzuurzijketens sequentieel worden gesplitst door vetweefseltriglyceridilase (ATGL), hormoongevoelige lipase (HSL) en monoglyceride lipase (MGL), wat resulteert in de afgifte van vrije vetzuren (FFA's) en de glycerol-ruggengraat 1,2. Lipolyse wordt geactiveerd door catecholaminesignalering in het vetweefsel. Sympathische zenuwuiteinden geven lokaal catecholaminen af, die binden aan β-adrenerge receptoren op het adipocytenplasmamembraan. Bij ligandbinding activeren deze G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's) adenylylcyclase via Gαs. Daaropvolgende activering van proteïnekinase A (PKA) door cAMP resulteert in de upregulatie van zowel ATGL als HSL. De fosforylering van perilipine-1 door PKA veroorzaakt de dissociatie van ABHD5 (ook bekend als CGI-58), dat ATGL3 bindt en coactiveert. PKA fosforyleert HSL direct en bevordert de translocatie van het cytosol naar de lipidedruppel, waar interactie met gefosforyleerd perilipine-1 de lipase-activiteit verder bevordert 4,5,6,7. De derde lipase die betrokken is bij lipolyse, MGL, lijkt niet te worden gereguleerd door catecholaminesignalering8. Belangrijk is dat triglyceridensynthese in adipocyten wordt gemedieerd door de glycerollipidesyntheseroute, die niet de vorming van monoglyceriden als tussenproduct met zich meebrengt; in plaats daarvan katalyseren glycerol-3-fosfaat acyltransferasen de vorming van lysofosfatidinezuur, dat wordt gecombineerd met een ander vette acyl-CoA om fosfatidisch zuur te vormen en vervolgens wordt geïsomeriseerd tot diglyceriden vóór de uiteindelijke synthese van triglyceriden (figuur 1) 9,10,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65106/65106fig01.jpg"> Figuur 1: Lipolyse en glycerol lipide synthese routes. Top: Lipolytische route; enzymen in rood: vetweefsel triglyceride lipase (ATGL), hormoongevoelige lipase (HSL) en monoglyceride lipase (MGL). Onder: glycerol lipide synthese route; enzymen in het groen: diglyceride acyltransferase (DGAT), fosfatidinezuurfosfatase (PAP), lysofosfatidinezuuracyltransferase (LPAT, ook bekend als LPAATs) en glycerol-3-fosfaatacyltransferase (GPAT). Lipiden: triglyceride (TG), diglyceride (DG), monoglyceride (MG), vrij vetzuur (FFA), vette acyl-CoA (FA-CoA), lysofosfatidinezuur (LPA) en fosfatidinezuur (PA). Andere metabolieten: anorganisch fosfaat (Pi) en glycerol 3-fosfaat (G3P). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65106/65106fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Extracellulaire adenosine is een andere belangrijke regulator van lipolyse, die werkt via G s- en Gi-gekoppelde GPCR's om de adenylcyclase-activiteit te beïnvloeden. De overheersende adenosinereceptor in adipocyten, ADORA1, remt adenylylcyclase en dus lipolyse door de activering van Gi12. Uitgedrukt op lagere niveaus, en voornamelijk in bruine adipocyten, activeert ADORA2A lipolyse via Gs signalering13. ADORA1 beïnvloedt zowel basale lipolyse als de respons op adrenerge agonisten. Het effect van adenosine op lipolyse kan worden gecontroleerd door adenosinedeaminase toe te voegen om adenosine te neutraliseren, evenals de ADORA1-specifieke agonist fenylisopropyladenosine14,15. Hormonale activering van G q-gekoppelde GPCR's kan ook de lipolyse beïnvloeden via de activering van fosfolipase C en eiwitkinase C16,17,18,19. Ontstekingssignalen hebben ook invloed op de lipolytische snelheden. TLR4-activering door LPS (en andere endotoxinen) verhoogt de lipolytische snelheid door ERK te activeren, dat perilipine-1 en HSL20 fosforyleert. TNF-α activeert ook lipolyse via ERK- en NF-κB-activering, evenals transcriptionele downregulatie van het fosfodiësterase PDE-3B en CIDEC21,22,23. IL-6 is ook in verband gebracht met verhoogde adipocytenlipolyse, vooral in mesenterisch vetweefsel, waarvan de FFA-afgifte van invloed is op leversteatose en gluconeogenese24,25,26.
Lipolyse wordt onderdrukt tijdens de gevoede toestand door insuline. AKT fosforyleert en activeert PDE-3B om cAMP-signalering te onderdrukken en PKA-activering te voorkomen27. Insuline downreguleert ook transcriptioneel ATGL28. Obesitas bevordert catecholamineresistentie door middel van een verscheidenheid aan mechanismen, waaronder de downregulatie van β-adrenerge receptoren in adipocyten 29,30,31,32,33. Adipocyten brengen alle drie de β-adrenerge receptoren tot expressie (β-1, β-2 en β-3). Terwijl β-1 en β-2 adrenerge receptoren alomtegenwoordig tot expressie komen, wordt de β-3 adrenerge receptor voornamelijk uitgedrukt in adipocyten in muizen34,35. Adrb3-expressie wordt geïnduceerd door C/EBPα tijdens adipogenesis36. De β-3 adrenerge receptor komt sterk tot expressie in volwassen adipocyten. De activering van β-1 en β-2 adrenerge receptoren is zelfbeperkend als gevolg van feedbackremming door β-arrestine37. Feedbackremming van de β-3 adrenerge receptor wordt gemedieerd door andere signaalroutes, die de Adrb3-expressie 33,38,39 verminderen.
Talrijke verbindingen kunnen worden gebruikt om adipocytenlipolyse te activeren. Catecholamines zijn belangrijke fysiologische activatoren van lipolyse. Noradrenaline (of noradrenaline) en epinefrine (of adrenaline) activeren alle drie de β-adrenerge receptoren40. Noradrenaline en epinefrine beïnvloeden ook lipolyse via activering van α-adrenerge receptorsignalering41. Veelgebruikte β-adrenerge receptoragonisten zijn isoproterenol, een niet-selectieve β-adrenerge receptoragonist, en de β-3 adrenerge receptoragonisten CL-316,243 en mirabegron42. Aangezien adipocyten voornamelijk de β-3 adrenerge receptor tot expressie brengen, gebruiken we hier CL-316,243 als voorbeeld. De specificiteit voor de β-3 adrenerge receptor maakt het ook een relatief specifieke activator van adipocyte catecholamine signalering, die ook veilig in vivo kan worden gebruikt. Merk op dat de veelgebruikte concentratie van 10 μM CL-316,243 in celcultuur ordes van grootte hoger is dan de ~ 0,1 μM dosis die nodig is om een maximale responste bereiken 33. Forskolin omzeilt de adrenerge receptor, direct activeren adenylyl cyclase en downstream lipolytische signalering. Er zijn veel meer activatoren, evenals onderdrukkers van lipolyse. Bij het selecteren van een verbinding om lipolyse te stimuleren, moeten de receptorspecificiteit en downstream signaalroutes zorgvuldig worden overwogen binnen het experimentele ontwerp.
De snelheid van lipolyse in wit vetweefsel is een belangrijke metabolische factor die van invloed is op de koudetolerantie en de beschikbaarheid van voedingsstoffen tijdens vasten of lichaamsbeweging43,44,45,46. Het doel van dit protocol is om de snelheid van lipolyse in adipocyten en vetweefsel te meten, wat het begrip van adipocytenmetabolisme zal vergemakkelijken en hoe dit het metabole fenotype van verschillende muizenmodellen kan beïnvloeden. Om de lipolytische snelheid te kwantificeren, meten we het uiterlijk van lipolytische producten in de media (d.w.z. FFA's en glycerol). De methode is gebaseerd op het vrijkomen van lipolytische producten uit de adipocyt in de media. Aangezien witte adipocyten lage niveaus van glycerolkinase tot expressie brengen, zijn de heropnamepercentages van glycerol laag47. Omgekeerd moet ook de productie van FFA's en glycerol door andere metabole routes dan lipolyse worden overwogen. Adipocyten lijken een fosfatase uit te drukken met activiteit tegen glycerol-3-fosfaat, waardoor de productie van glycerol uit glycerol-3-fosfaat afgeleid van glucose48,49,50 mogelijk is. Glycolyse is een bron van glycerol-3-fosfaat dat wordt gebruikt voor FFA-herverestering in witte adipocyten. Wanneer de glucosespiegels beperkt zijn, vereist glyceroneogenese andere 3-koolstofbronnen, zoals lactaat en pyruvaat51. De kanalisatie van FFA's die vrijkomen door lipolyse in de cel en hun metabolische lot is slecht begrepen; FFA's die vrijkomen door lipolyse moeten worden omgezet in vette acyl-CoA, voordat ze opnieuw worden veresterd of β-oxidatie ondergaan. Het lijkt erop dat FFA's die vrijkomen door lipolyse waarschijnlijk de cel verlaten voordat ze weer worden opgenomen en omgezet in vette acyl-CoA 52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62 . FFA's kunnen buiten de cel worden gesekwestreerd door albumine. Belangrijk is dat van FFA's met een lange keten bekend is dat ze de lipolyse remmen als ze niet worden gesekwestreerd door albumine 63,64,65,66,67. Het optimaliseren van de FFA-buffercapaciteit van de media tijdens de lipolyse-assay is dus van cruciaal belang. De hier beschreven procedure is vergelijkbaar met eerder gepubliceerde methoden om de lipolytische snelheid in adipocyten en ex vivo vetweefsel van muizen en mensen te meten 15,68,69,70,71. Dit protocol verschilt door het gebruik van seriële bemonstering; Door seriële bemonstering uit te voeren, kunnen we intern valideren dat lipolyse wordt gemeten in de lineaire fase en meerdere metingen gebruiken om de snelheid van lipolyse te berekenen, waardoor de meetfout wordt verminderd om het vertrouwen in de uiteindelijke berekende waarde te vergroten. Het nadeel van seriële bemonstering is dat de test meer tijd en reagentia vereist; Het langere tijdsbestek vermindert echter de impact van meetfouten op de standaardfout van de schattingen van het tarief. Bovendien meet dit protocol zowel FFA als glycerolafgifte en beschouwt het de verhouding FFA: glycerolafgifte met als doel een 3: 1-verhouding te bereiken, zoals zou worden verwacht van volledige lipolyse en afgifte van lipolytische producten in de media72.

<table><tbody><tr><td>24-Well tissue culture treated plate</td><td>Corning Inc</td><td>3527</td><td>Moet voor weefselkweek worden behandeld voor adipocyte differentiatie</td></tr><tr><td>48-Well flat bottom plate with lid</td><td>Corning Inc</td><td>353078</td><td>Kan voor weefselkweek worden behandeld</td></tr><tr><td>6-Well flat bottom plate with lid</td><td>Corning Inc</td><td>353046</td><td>Kan voor weefselkweek worden behandeld</td></tr><tr><td>96-Well PCR Plate</td><td>USA sceintific</td><td>1402-9100</td><td>Elke conische 0,2 mL PCR-plaat is handig&nbsp;</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td>FFA-vrije BSA zoals A8806, wordt ook vaak gebruikt. De BSA mag geen detecteerbare FFA hebben, ook kunnen lot-to-lot variaties in BSA van invloed zijn op de waargenomen snelheid van lipolyse</td></tr><tr><td>CL-316,243</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5976</td><td>CAS #: 138908-40-4 verkrijgbaar bij andere leveranciers</td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>PHCBI</td><td>MCO-170AICUVH</td><td>CO2 moet idealiter worden ingesteld op 10% voor vetweefsel, echter 5% CO2 zal ook werken</td></tr><tr><td>DMEM, low glucose, no phenol red</td><td>Thermofischer</td><td>11054020</td><td>Elk phenolroodvrij medium zou moeten werken, DMEM/F12, RPMI, maar moet een vluchtige buffercapaciteit bevatten, d.w.z. biocarbonaat</td></tr><tr><td>FFA-vrij bovien serumalbumine</td><td>Equitech-Bio, Inc,&nbsp;</td><td>BAH66</td><td></td></tr><tr><td>Free Glycerol Reagent</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6428</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol Standard Solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7793&nbsp;</td><td>Dit kan ook worden gemaakt door glycerol te verdunnen tot de gewenste concentratie</td></tr><tr><td>HR Series NEFA Standard Solution</td><td>Fujifilm</td><td>276-76491</td><td></td></tr><tr><td>HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A</td><td>Fujifilm</td><td>999-34691</td><td></td></tr><tr><td>HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B</td><td>Fujifilm</td><td>991-34891</td><td></td></tr><tr><td>HR Series NEFA-HR (2) Solvent A&nbsp;</td><td>Fujifilm</td><td>995-34791</td><td></td></tr><tr><td>HR Series NEFA-HR (2) Solvent B&nbsp;</td><td>Fujifilm</td><td>993-35191</td><td></td></tr><tr><td>Microbiological Incubator</td><td>Fischer Scientific</td><td>S28668</td><td>Elke incubator bij 37C kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-Well Plates</td><td>Thermo Scientific</td><td>269620</td><td>Elke optisch heldere, platte bodem 96-well plaat werkt</td></tr><tr><td>Silicone Laboratory Benchtop Mat</td><td>VWR</td><td>76045-300</td><td>Een glazen plaat kan ook worden gebruikt. Absorberende oppervlakken worden niet aanbevolen</td></tr><tr><td>Spectrophotometer/Microplate Reader</td><td>Molecular devices</td><td>SpectraMax i3x&nbsp;</td><td>Elke plate reader die kan lezen op 540, 550 en 660 mm zal werken</td></tr><tr><td>V Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>810531</td><td></td></tr><tr><td>WypAll X70 Wipers</td><td>Kimberly-Clark</td><td>41200</td><td>Elke hoogwaardige papieren handdoek zal werken</td></tr></tbody></table>

het meten van de snelheid van lipolyse in ex vivo muizenvetweefsel en primaire preadipocyten gedifferentieerd in vitro

Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro

Adipocyten slaan energie op in de vorm van triglyceriden in lipidedruppeltjes. Deze energie kan worden gemobiliseerd via lipolyse, waarbij de vetzuurzijketens sequentieel worden gesplitst van de glycerol-ruggengraat, wat resulteert in de afgifte van vrije vetzuren en glycerol. Vanwege de lage expressie van glycerolkinase in witte adipocyten zijn de heropnamesnelheden van glycerol verwaarloosbaar, terwijl de heropname van vetzuren wordt bepaald door de vetzuurbindende capaciteit van mediacomponenten zoals albumine. Zowel glycerol als vetzuurafgifte in media kunnen worden gekwantificeerd door colorimetrische assays om de lipolytische snelheid te bepalen. Door deze factoren op meerdere tijdstippen te meten, kan men de lineaire snelheid van lipolyse met hoge betrouwbaarheid bepalen. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de meting van lipolyse in in vitro gedifferentieerde adipocyten en ex vivo vetweefsel van muizen. Dit protocol kan ook worden geoptimaliseerd voor andere preadipocytencellijnen of vetweefsel van andere organismen; Overwegingen en optimalisatieparameters worden besproken. Dit protocol is ontworpen om nuttig te zijn bij het bepalen en vergelijken van de snelheid van adipocytenlipolyse tussen muismodellen en behandelingen.

We maten de basale en gestimuleerde lipolytische snelheid van in vitro gedifferentieerde adipocyten. Primaire preadipocyten uit inguinaal wit vetweefsel werden gedifferentieerd in adipocyten door de behandeling van confluente cellen met 5 μM dexamethason, 0,5 mM IBMX, 1 μg/ml insuline en 1 μM troglitazon gedurende 4 dagen, gevolgd door een aanvullende behandeling van 3 dagen met 1 μg/ml insuline. Cellen werden geïncubeerd in media zonder insuline gedurende 24 uur voorafgaand aan de lipolysetest. Op het moment = ...

Triglyceride lipolyse in adipocyten is een belangrijk metabolisch proces dat resulteert in de afgifte van vrije vetzuren en glycerol. Hier bieden we een gedetailleerd protocol om basale en gestimuleerde lipolyse te meten in adipocyten en ex vivo vetweefsel van muizen.

Het meten van de snelheid van lipolyse in ex vivo muizenvetweefsel en primaire preadipocyten gedifferentieerd in vitro

Adipocytes store energy in the form of triglycerides in lipid droplets. This energy can be mobilized via lipolysis, where the fatty acid side chains are ...

Dit protocol beschrijft de bepaling van de snelheid van adipocytenlipolyse in gekweekte adipocyten of ex vivo vetweefsel, waardoor de lipolytische snelheden tussen muizenmodellen of behandelingen kunnen worden vergeleken. Dit protocol maakt gebruik van seriële bemonstering, waardoor men intern kan valideren dat lipolyse wordt gemeten in de lineaire fase en de meetfout vermindert. Met optimalisatie kan dit protocol worden gebruikt om lipolyse te meten in bruin vetweefsel, vetweefsel van andere organismen of adipogene cellijnen.Ex vivo weefsels moeten in kleine stukjes van consistente grootte en vorm worden gehakt om sekwestratie van de vrijgekomen vrije vetzuren door BSA in de media mogelijk te maken. Om te beginnen, bereid het 5% BSA-medium door vijf gram runderserumalbumine of BSA op te lossen in 100 milliliter Dulbecco's Modified Eagle's Medium, of DMEM, zonder fenolrood. Roer voorzichtig de oplossing om de BSA op te lossen.Bereid vervolgens werkconcentraties van controle- en stimulatiemedia voor. Verwarm voor gebruik de media tot 37 graden Celsius. Label een plaat met 96 putten voor mediaverzameling.Voer in een steriele zuurkast isolatie en differentiatie uit van 100% confluente

measuring-rate-lipolysis-ex-vivo-murine-adipose-tissue-primary

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Vetweefsel (AT) kan de homeostase van het hele lichaam beïnvloeden, daarom is het begrijpen van de moleculaire mechanismen van adipocytendifferentiatie en -functie van belang. We bieden een protocol voor het verkrijgen van nieuwe inzichten in deze processen door adipocytenhomeostase, differentiatie en blootstelling aan hypoxie te analyseren als een model voor geïnduceerde adipocytenapoptose.

Mechanisme van de verordening van Adipocyte Numbers in volwassen organismen door differentiatie en apoptose Homeostasis

Dit protocol beschrijft de methode voor het bepalen van basale en forskolin gestimuleerde lipolyse in inguineuze vetkussens die worden verkregen uit normale Chow Diet (NCD) of met hoge vet dieet (HFD) ± capsaicine gevoed wild type muizen. Als een index voor lipolyse werd de glycerol-afgifte gemeten van ingewanden van adipose vetpads.

Meting van basale en forskolin-gestimuleerde lipolyse in buikvlies vetpads

Dit artikel biedt drie eenvoudige en toegankelijke testen voor het beoordelen van het lipidemetabolisme bij muizen.

Beoordeling van de lipidenbehandelingscapaciteit van het hele lichaam bij muizen

Preadipocyten worden geïsoleerd uit de stromale vasculaire fractie van interscapulier bruin vetweefsel van pasgeboren muizen en gedifferentieerd tot cellen die lipidedruppeltjes accumuleren, moleculaire markers tot expressie brengen en de mitochondriale morfologie van volwassen bruine vetcellen vertonen. Deze cellen worden verder geanalyseerd door middel van immunofluorescentie en transmissie-elektronenmicroscopie.

Differentiatie en beeldvorming van bruine vetcellen uit de stromale vasculaire fractie van interscapulier vetweefsel van pasgeboren muizen

Dit protocol beschrijft de semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie (SVF) uit muizenvetweefsel om preadipocyten te verkrijgen en adipocytendifferentiatie in vitro te bereiken. Het gebruik van een weefseldissociator voor collagenasevertering vermindert experimentele variatie en verhoogt de reproduceerbaarheid.

Semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie uit muizenwit vetweefsel met behulp van een weefseldissociator

Hier beschrijven we een protocol voor het isoleren, kweken en fenotyperen van microvasculaire endotheelcellen uit menselijk onderhuids vetweefsel (hSATMVEC's). Daarnaast beschrijven we een experimenteel model van hSATMVEC-adipocyte overspraak.

Bestudering van overspraak van vet-endotheelcellen en adipocyten in menselijk onderhuids vetweefsel

De grootte en kwetsbaarheid van rijpe vetcellen hebben de technieken en hulpmiddelen die beschikbaar zijn voor hun studie en isolatie beperkt. Hier wordt een protocol beschreven voor de isolatie van rijpe muizenadipocyten, dat gemakkelijk kan worden aangepast voor verschillende vetdepots en muizendiëten.

Isolatie en kweek van primaire adipocyten van muizen van magere en zwaarlijvige muizen

Met een ex vivo explant-model worden kleine stukjes van het rostrale deel van visceraal wit vetweefsel van magere muizen 7–10 dagen gekweekt, waardoor ontsteking in vetweefsel tijdens vetrijke voeding kan worden geïnduceerd en bestudeerd.

Een ex vivo muismodel voor vetrijke vetachtige vetweefselontsteking

Deze procedure beschrijft een methode voor de isolatie en de cultuur van het muriene orgaan van Corti, met of zonder de spiraal limbus en spiraal ganglion neuronen. We tonen ook aan een methode voor de expressie van een exogeen reportergen in het orgaan van Corti explant door elektroporatie.

Primaire Cultuur en Plasmide Elektroporatie van de muizen orgaan van Corti.

De eileider (FT) is in opkomst als een alternatieve site van oorsprong voor de sereuze ovariumcarcinoom (SOC). Dit protocol beschrijft een nieuwe methode voor de isolatie...

Ex Vivo Cultuur van primaire menselijke eileider epitheelcellen

Leer lipolysemeting in muizenadipocyten en ex vivo vetweefsel met seriële bemonstering en enzymatische assays. Deze methode valideert lineaire lipolytische snelheden voor metabool onderzoek.

Het meten van de snelheid van lipolyse in ex vivo muizenvetweefsel en primaire preadipocyten gedifferentieerd in vitro

Meer video's verkennen