Name: Bioorthogonale chemische beeldvorming van celmetabolisme gereguleerd door aromatische aminozuren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Leer bioorthogonale chemische beeldvorming van celmetabolisme gereguleerd door aromatische aminozuren met subcellulaire resolutie. Deze labelvrije methode combineert Raman-microscopie met fluorescentie voor niet-destructieve analyse van metabole activiteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken Dr. Yajuan Li en Anthony Fung voor hun technische ondersteuning en het Fraley-lab voor de cellijn. We erkennen de start-upfondsen van UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 en Hellman Fellow Award.

1. Mediavoorbereiding
<ol><li>Bereid 10 ml controle en overtollige AAAs in Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) met 50% D2O.<ol><li>Meet en meng voor de controlemedia 10 mg DMEM-poeder met 4,7 ml dubbel gedestilleerd water (ddH2O) in een conische buis van 15 ml. Het DMEM poeder bevat alle aminozuren in standaard concentraties. Draai de buis grondig om en keer deze om om ervoor te zorgen dat de oplossing goed wordt gemengd. Voeg 4,7 ml D2O, 0,5 ml foetaal runderserum (5% FBS) en 0,1 ml penicilline / streptomycine (1%) toe. Draai de buis grondig om en keer deze om om ervoor te zorgen dat de oplossing goed wordt gemengd.</li>
		<li>Meet en meng voor het 15x Phe-behandelingsmedium 10 mg DMEM-poeder met 4,7 ml ddH2O, 0,5 ml FBS (5%) en 0,1 ml penicilline/streptomycine (1%) in een conische buis van 15 ml. Draai de buis grondig om en keer deze om om ervoor te zorgen dat de oplossing goed wordt gemengd. Voeg overtollig Phe-poeder in een concentratie van 924 mg/L toe aan het medium. Draai de buis grondig om en keer deze om om ervoor te zorgen dat de oplossing goed wordt gemengd.</li>
		<li>Meet en meng voor het 15x tryp-behandelingsmedium 10 mg DMEM-poeder met 4,7 ml ddH2O, 0,5 ml FBS (5%) en 0,1 ml penicilline/streptomycine (1%) in een conische buis van 15 ml. Draai de buis grondig om en keer deze om om ervoor te zorgen dat de oplossing goed wordt gemengd. Voeg overtollig tryppoeder in een concentratie van 224 mg/l toe aan het medium. Draai de buis grondig om en keer deze om om ervoor te zorgen dat de oplossing goed wordt gemengd.</li>
		<li>Voeg methionine en threonine toe met respectievelijk 30,0 mg / ml en 95,0 mg / ml aan alle conische buizen van de vorige stappen. Draai de buis grondig om en keer deze om. Natriumpyruvaat hoeft niet aan de kweekmedia te worden toegevoegd.</li>
		<li>Filter de controle- en behandelingsmedia met een 25 mm spuitfilter met 0,22 μm polyethersulfonmembraanfilters.</li>
		<li>Sluit alle media-ingesloten conische buizen af met parafilm en bewaar bij 4 °C gedurende maximaal 3 weken. Voordat u de cellen met media behandelt, verwarmt u alle media tot 37 °C. OPMERKING: De poeder- en vloeibare reagentia moeten worden gemeten en gecombineerd op basis van het totale volume van de behandelings- en controlemedia.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Voorbereiding van het celmonster
<ol><li>Behoud baarmoederhalskanker (HeLa) cellen in een kweekkolf (d.w.z. T10, T25, enz.) met behulp van standaard DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline / streptomycine bij 37 ° C en 5% koolstofdioxide (CO2).</li>
	<li>Subkweek de HeLa-cellen in een gesplitste verhouding van 1:10 totdat ze 80% of hogere levensvatbaarheid van de cel bereiken.</li>
	<li>Zodra de cellen 80% of hogere confluentie bereiken, ga je verder met het zaaien van 2 x 105 cellen per put op een 24-well plaat met behulp van DMEM aangevuld met 0,5% FBS en 1% penicilline / streptomycine.<ol><li>Bereid voorafgaand aan het zaaien van de cel een plaat met 24 putten voor met gesteriliseerde, poly-d-lysine, laminine gecoate, ronde dekplaten met een diameter van 12 mm. Dompel de afdekstroken onder in 70% ethanol en droog voorzichtig af met pluisvrije doekjes. Plaats de schone afdekstroken in de juiste putjes van de plaat.</li>
		<li>Zodra de cellen 80% confluentie bereiken in stap 2.2, wast u de cellen eenmaal met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder magnesium- en calciumionen.</li>
		<li>Voeg 0,25% trypsine toe om de aanhangende cellen van de kolf te scheiden en incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 3 minuten.</li>
		<li>Voeg DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine toe, pipetteer voorzichtig op en neer en verzamel de cellen door centrifugeren bij 300 x g bij kamertemperatuur (RT) gedurende 3 minuten.</li>
		<li>Resuspendie van de cellen in DMEM aangevuld met 0,5% FBS en 1% penicilline/streptomycine.</li>
		<li>Tel de cellen met behulp van een hemocytometer, lichtmicroscoop en trypanblauw en zaai een dichtheid van 2 x 105 cellen per put van een 24-well plaat. Als alternatief kan een geautomatiseerde celteller worden gebruikt om de cellen te tellen.</li>
		<li>Breng de cellen terug naar de incubator bij 37 °C en 5% CO2 en schud de plaat voorzichtig om de cellen gelijkmatig te verdelen.</li>
	</ol></li>
	<li>Vervang na 8 uur de oude kweekmedia door 50% D 2O/overtollige Phe of 50% D2O/overtollige Tryp-media. Breng de cellen terug naar de incubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 36 uur.</li>
	<li>Bevestig na 36 uur de cellen op microscoopglaasjes.<ol><li>Bereid voorafgaand aan het fixeren microscoopglaasjes voor met beeldvormende afstandhouders met een diameter van 9 mm en plaats 15 μL 1x PBS aangevuld met calcium- en magnesiumionen.</li>
		<li>Spoel de cellen af met 1x PBS aangevuld met calcium- en magnesiumionen.</li>
		<li>Voeg 0,5 ml 4% methanolvrije paraformaldehyde (PFA) oplossing toe en laat de plaat ongeveer 15 minuten onder de bioveiligheidskap liggen.</li>
		<li>Zuig de PFA-oplossing aan en spoel af met 1x PBS aangevuld met calcium- en magnesiumionen tweemaal.</li>
		<li>Voeg 1,5 ml 1x PBS aangevuld met calcium- en magnesiumionen toe in elk putje.</li>
		<li>Gebruik een steriel pincet om de afdekstroken voorzichtig uit elk putje te pakken. Keer de celbevattende zijde van de afdekplaten om op de beeldafstandhouders en plaats deze om contact te maken met de PBS die in stap 2.5.1 is voorbereid. Zorg ervoor dat de niet-celbevattende zijde wordt blootgesteld aan lucht.</li>
		<li>Sluit met transparante nagellak de buitenste laag van de coverslip af met de imaging spacer.</li>
	</ol></li>
	<li>Bewaar de microscoopglaasjes bij 4 °C wanneer ze geen beeld krijgen.</li>
</ol>3. Spontane Raman spectroscopie meting (Figuur 2)
<ol><li>Gebruik een confocale Raman-microscoop om spontane Raman-spectra te verkrijgen (figuur 2A).</li>
	<li>Schakel de laser in door de toets in de AAN-positie te draaien.</li>
	<li>Dubbelklik op het LabSpec6-softwarepictogram om de acquisitiesoftware te openen.</li>
	<li>Laad het biologische monster op de monsterhouder direct onder de objectieflens.</li>
	<li>Klik in de software op het camerapictogram om de videocamera in te schakelen.</li>
	<li>Pas het scherpstelvlak aan om een interessant gebied te identificeren met de 50x objectieflens. Beweeg de joystick om de schaafvertaling van de XY-fase te regelen en draai de joystick om de scherpsteldiepte te wijzigen.</li>
	<li>Nadat u de positie voor de meting hebt gekozen, schakelt u over naar de 100x objectieflens met 40 mW excitatievermogen. Klik op het rode stoppictogram om de videocamera uit te schakelen.</li>
	<li>Selecteer een rooster van 1800 lijnen/mm en stel het acquisitiebereik in van 400 cm-1 tot 3.150 cm-1.</li>
	<li>Stel de acquisitietijd in op 90 s, de accumulatie op 3 en de binning op 4 voor de minste ruis en het meest nauwkeurige spectrum. OPMERKING: Deze beeldvormingsparameters kunnen worden geoptimaliseerd voor het experiment.</li>
	<li>Klik op het pijlpictogram om de realtime weergave in te schakelen.</li>
	<li>Stem de Raman-verschuiving (cm-1) af op een waarde naar keuze om het scherpstelvlak te verfijnen. OPMERKING: In dit experiment werd de Raman-laser gericht op de lipidedruppels, die een hoge concentratie CH 2-bindingen bevatten. Daarom werd een Raman-verschuiving van 2.850 cm-1 geselecteerd die overeenkwam met de rekmodi van de CH 2-binding voor het doel.</li>
	<li>Pas het scherpstelvlak aan met de joystick om de beste signaal-ruisverhouding te optimaliseren.</li>
	<li>Nadat u het scherpstelvlak hebt gekozen, klikt u op het rode stoppictogram voor een realtime weergave.</li>
	<li>Selecteer het cirkelpictogram om de spectrumacquisitie te starten.</li>
	<li>Zodra het cellulaire gebied is genomen, gebruikt u hetzelfde scherpstelvlak om de achtergrond te meten met PBS. Trek het achtergrondspectrum af van elk subcellulair doelspectrum met behulp van een afzonderlijke computersoftwaretoepassing, zoals Origin (figuur 1B).</li>
</ol>4. Beeldvormingsexperimenten met 2PEF en SRS
OPMERKING: Gedetailleerde beschrijvingen van SRS-laseruitlijning zijn te vinden in een eerder rapport28. Dit protocol richt zich op de werking van een multimodaal SRS- en 2PEF-beeldvormingssysteem (figuur 2C, D).
<ol><li>Klik op Start om de laser op te warmen.</li>
	<li>Volg de volgorde om de hoofdschakelaars van de besturingseenheid en de monitor in te stellen: 1) druk op de hoofdschakelaar van de besturingskast IX3-CBH op Aan, 2) druk op de hoofdschakelaar van de aanraakpaneelcontroller op Aan, 3) druk op de hoofdschakelaar van de AC-adapter van de voeding voor LD OBIS 6 Laser Remote aangesloten op de hoofdlasercombiner FV31-SCOMB op Aanen 4) druk op de hoofdschakelaar van de wisselstroomadapter van de voeding voor LD OBIS 6 Laser Remote aangesloten op de sublasercombiner FV31-SCOMB op Aan.</li>
	<li>Druk op de hoofdschakelaars van de Si-fotodiodedetector en lock-in versterker Aan.</li>
	<li>Stel de Stokes Beam in op 1.031 nm, de pulsbreedte op 6 pk en de herhalingsfrequentie op 80 MHz.</li>
	<li>Gekoppeld aan de microscoop, stelt u het picoEmerald-systeem in dat wordt geleverd met de gesynchroniseerde pompbundel met een instelbare golflengte van 720-990 nm, een pulsbreedte van 5-6 pk en een herhalingsfrequentie van 80 MHz. Het gemiddelde excitatievermogen van zowel de pomp als Stokes is 450 mW. Optimaliseer het excitatievermogen om fotoschade voor het monster te minimaliseren.</li>
	<li>Gebruik een oliecondensor met hoog numeriek diafragma (NA) (d.w.z. 1,4 NA) om de Stokes en pompbundels te verzamelen waar het monster is gemonteerd door een paar druppels op de condensor uit te stoten.</li>
	<li>Monteer het monster op de olie en plaats een grote waterdruppel bovenop de microscoopglaasje waar het monster is bevestigd. Dit is voor de water-immersie objectief lens.</li>
	<li>Stel de lock-in versterker in op 20 MHz. Verwerk het beeld nu met behulp van de superresolutiesoftwaremodule.</li>
	<li>Selecteer 512 pixels x 512 pixels en 80 μs/pixel voor de verblijftijd.</li>
	<li>Zodra het gewenste cellulaire gebied goed is scherpgesteld, verkrijgt u het beeld. Met behulp van de acquisitiesoftware van de microscoop slaat u de afbeeldingen op als een Olympus .oir grafisch bestand.</li>
	<li>Verkrijg een achtergrondafbeelding op 1.900 cm-1 en trek deze af van alle mobiele afbeeldingen.</li>
	<li>Om 2PEF-beeldvorming uit te voeren, gebruikt u dezelfde afstembare picosecondelaser en stelt u de labelvrije autofluorescentie van Flavin en NADH in op respectievelijk 800 nm en 780 nm.</li>
	<li>Gebruik een filterkubus van 460 nm/515 nm om de flavin- en NADH-autofluorescentie-teruggekaatste emissie op te vangen.</li>
	<li>Stel de verblijftijd in op 8 μs/pixel en de pixelgrootte op 512 pixels x 512 pixels. Stel de parameter voor het lasersluitervermogen in op 150 mW.</li>
	<li>Voor 3D-beeldreconstructie stemt u het gestimuleerde Raman-verlies af op 2.850 cm-1 (797 nm).</li>
	<li>Zodra de gewenste afzonderlijke cellen zijn geïdentificeerd, registreert u de laser om vanaf het bovenste focusvlak te scannen om de bovenste en onderste lagen van die cellen te detecteren. OPMERKING: 3D-modellen worden gegenereerd en opgeslagen als .oir-bestanden.</li>
</ol>5. Spectra en beeldanalyse
<ol><li>Spectra analyse<ol><li>Gebruik de Origin-software of andere relevante toepassingen om het achtergrondspectrum af te trekken van alle subcellulaire doelspectra.</li>
		<li>Gebruik de wiskundige modelleringsbewerkingen van MATLAB om de Raman-spectra te verwerken met de ingebouwde functies van de software. Python kan ook worden gebruikt voor spectraverwerking.<ol><li>Spectrale voorbewerking begint met het converteren van de bestanden naar een array. De spectra zijn geïnterpoleerd op elke wederzijdse centimeter.</li>
			<li>Voor validatie maakt u een grafiek van de onbewerkte gegevens. Voer de basislijncorrectie uit op de onbewerkte spectra met behulp van de ingebouwde functie msbackadj in MATLAB. Kortom, de ingebouwde functie schat basislijnpunten op scheidingseenheidswaarden die door gebruikers zijn geïdentificeerd en retourneert de afstand tussen aangrenzende vensters. Schat en teken vanaf de basislijnpunten een regressielijn. Pas Smoothing toe om de regressielijn vloeiend te maken om de basislijn van elk afzonderlijk onbewerkt spectrum af te trekken.</li>
			<li>Voer min-max normalisatie uit door de Raman-intensiteit van het eiwit op 2.930 cm-1 te delen door de intensiteit van elke Raman-verschuiving . Het signaal van 2.930 cm-1 is meestal de hoogste intensiteit op het Raman-spectrum . Met deze normalisatie wordt de maximale waarde omgezet in een 1 terwijl de minimumwaarde wordt omgezet in een 0. Elke andere waarde wordt omgezet in een decimaal tussen 0 en 1.</li>
			<li>Gemiddelde van de individuele spectra van dezelfde toestand in een enkel spectrum om ruis te verminderen.</li>
		</ol></li>
		<li>Eenmaal verwerkt, gebruikt u toepassingen, zoals Origin, om alle spectra tegelijkertijd weer te geven. De pieken in de spectra vertegenwoordigen een specifieke chemische binding of functionele groep.</li>
	</ol></li>
	<li>3D-beeldanalyse van lipidedruppels<ol><li>Gebruik FIJI-ImageJ-software om alle 3D-afbeeldingen te verwerken</li>
		<li>Voer de functies Bandpass-filters en Vloeiend maken uit voor de 3D-afbeeldingsstapels.</li>
		<li>Voor 3D-beeldanalyse wijst u elke lipidedruppel toe aan een bolvormige score die wordt berekend door de afstand tussen het massamiddelpunt en het oppervlak te meten. Vergelijk elke sferische partituur met een bolvormige partituur van een perfecte bol op hetzelfde Euclidische plan. Gooi lipidedruppels met lage bolvormige scores weg en evalueer de resterende lipidedruppels op hun volume en aantallen.</li>
		<li>Analyseer het volume en het aantal lipidedruppels tussen verschillende behandelingen voor statistische significantie op een geschikte statistische softwaretoepassing. Hier werd GraphPad Prism gebruikt.</li>
	</ol></li>
	<li>2D hyperspectrale beeldanalyse<ol><li>Gebruik FIJI-ImageJ-software om alle 2D-hyperspectrale beelden te verwerken.</li>
		<li>Selecteer het kanaal van 2.930 cm-1 om een maskerafbeelding te maken die 0- en 1-waarden bevat. Wijs de achtergrond toe aan 0 en het cellulaire gebied aan 1.</li>
		<li>Trek het deuterium-gelabelde eiwitkanaal (2.175 cm-1) af naar het achtergrondkanaal (1.900 cm-1) om de fluorescerende effecten te verwijderen.</li>
		<li>Deel het resulterende deuterium-gelabelde eiwitkanaal door het eiwitkanaal (2.930 cm-1) om eiwitomloopratiometrische afbeeldingen te verkrijgen.</li>
		<li>Vermenigvuldig vervolgens de maskerafbeelding die in stap 5.3.2 is gemaakt met de ratiometrische afbeeldingen om eventuele resterende achtergrondgeluiden te verwijderen. Als gevolg hiervan wordt in elke ratiometrische afbeelding een donkere achtergrond gegenereerd.</li>
		<li>Gebruik het gereedschap Selectie uit de vrije hand in FIJI-ImageJ om handmatig pixelintensiteiten te segmenteren en te berekenen die op afzonderlijke cellen worden weergegeven. De pixelintensiteiten komen overeen met de concentraties van de chemische binding die wordt gevisualiseerd.</li>
		<li>Analyseer de pixelintensiteiten voor statistische significantie op een geschikte statistische softwaretoepassing. Hier werd GraphPad Prism gebruikt. Herhaal deze analyse met de resterende ratiometrische analyse.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Wu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+amino+acids+in+nutrition+and+health%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Functional amino acids in nutrition and health.</a> Amino Acids. 45 (3), 407-411 (2013).</li>
<li>Wei, Z., Liu, X., Cheng, C., Yu, W., Yi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+amino+acids+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolism of amino acids in cancer.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 603837(2020).</li>
<li>Parthasarathy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-ring+circus%3A+Metabolism+of+the+three+proteogenic+aromatic+amino+acids+and+their+role+in+the+health+of+plants+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">A three-ring circus: Metabolism of the three proteogenic aromatic amino acids and their role in the health of plants and animals.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 29(2018).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((l-tryptophan+activates+mammalian+target+of+rapamycin+and+enhances+expression+of+tight+junction+proteins+in+intestinal+porcine+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">l-tryptophan activates mammalian target of rapamycin and enhances expression of tight junction proteins in intestinal porcine epithelial cells.</a> The Journal of Nutrition. 145 (6), 1156-1162 (2015).</li>
<li>Saxton, R. A., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+signaling+in+growth%2C+metabolism%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mTOR signaling in growth, metabolism, and disease.</a> Cell. 168 (6), 960-976 (2017).</li>
<li>Mossmann, D., Park, S., Hall, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+signalling+and+cellular+metabolism+are+mutual+determinants+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">mTOR signalling and cellular metabolism are mutual determinants in cancer.</a> Nature Reviews. Cancer. 18 (12), 744-757 (2018).</li>
<li>Kimura, T., Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tryptophan+protects+hepatocytes+against+reactive+oxygen+species-dependent+cell+death+via+multiple+pathways+including+Nrf2-dependent+gene+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Tryptophan protects hepatocytes against reactive oxygen species-dependent cell death via multiple pathways including Nrf2-dependent gene induction.</a> Amino Acids. 48 (5), 1263-1274 (2016).</li>
<li>Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+supplementation+with+aromatic+amino+acids+decreased+triglycerides+and+alleviated+hepatic+steatosis+by+stimulating+bile+acid+synthesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Function%22%5BJournal%5D)">Dietary supplementation with aromatic amino acids decreased triglycerides and alleviated hepatic steatosis by stimulating bile acid synthesis in mice.</a> Food and Function. 12 (1), 267-277 (2021).</li>
<li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+implications+of+natural+compounds+targeting+lipid+metabolism+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease%2C+obesity+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Treatment implications of natural compounds targeting lipid metabolism in nonalcoholic fatty liver disease, obesity and cancer.</a> International Journal of Biological Sciences. 15 (8), 1654-1663 (2019).</li>
<li>Lubes, G., Goodarzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GC-MS+based+metabolomics+used+for+the+identification+of+cancer+volatile+organic+compounds+as+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">GC-MS based metabolomics used for the identification of cancer volatile organic compounds as biomarkers.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 147, 313-322 (2018).</li>
<li>Di Gialleonardo, V., Wilson, D. M., Keshari, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+metabolic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">The potential of metabolic imaging.</a> Seminars in Nuclear Medicine. 46 (1), 28-39 (2016).</li>
<li>Bowman, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+lipid+coverage+and+high+spatial+resolution+MALDI-imaging+capabilities+of+oversampling+combined+with+laser+post-ionisation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of lipid coverage and high spatial resolution MALDI-imaging capabilities of oversampling combined with laser post-ionisation.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (10), 2277-2289 (2020).</li>
<li>Murphy, R. C., Hankin, J. A., Barkley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+lipid+species+by+MALDI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Imaging of lipid species by MALDI mass spectrometry.</a> Journal of Lipid Research. 50, 317-322 (2009).</li>
<li>Pirman, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+cancer+cell+metabolism+revealed+by+direct+sample+analysis+with+MALDI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Changes in cancer cell metabolism revealed by direct sample analysis with MALDI mass spectrometry.</a> PLoS One. 8 (4), e61379(2013).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+lipidomics+with+high+structural+specificity+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell lipidomics with high structural specificity by mass spectrometry.</a> Nature Communications. 12 (1), 2869(2021).</li>
<li>Miyagi, M., Kasumov, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+synthesis+of+biomolecules+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions.+Series+A%2C+Mathematical%2C+Physical+and+Engineering+Sciences%22%5BJournal%5D)">Monitoring the synthesis of biomolecules using mass spectrometry.</a> Philosophical Transactions. Series A, Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 374 (2079), 20150378(2016).</li>
<li>Wang, T., Shogomori, H., Hara, M., Yamada, T., Kobayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanical+recognition+of+sphingomyelin-rich+membrane+domains+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nanomechanical recognition of sphingomyelin-rich membrane domains by atomic force microscopy.</a> Biochemistry. 51 (1), 74-82 (2012).</li>
<li>Fung, A. A., Shi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+and+tissue+imaging+using+Raman+and+coherent+Raman+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+Systems+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell and tissue imaging using Raman and coherent Raman microscopy.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 12 (6), e1501(2020).</li>
<li>Shi, L., Fung, A. A., Zhou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+stimulated+Raman+scattering+imaging+for+tissues+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Quantitative+Imaging+in+Medicine+and+Surgery%22%5BJournal%5D)">Advances in stimulated Raman scattering imaging for tissues and animals.</a> Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 11 (3), 1078-1101 (2021).</li>
<li>Yamakoshi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+EdU%2C+an+alkyne-tagged+cell+proliferation+probe%2C+by+Raman+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Imaging of EdU, an alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman microscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 133 (16), 6102-6105 (2011).</li>
<li>Shi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+metabolic+dynamics+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of metabolic dynamics in animals.</a> Nature Communications. 9 (1), 2995(2018).</li>
<li>Bagheri, P., Hoang, K., Fung, A. A., Hussain, S., Shi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+cancer+cell+metabolic+dynamics+regulated+with+aromatic+amino+acids+using+DO-SRS+and+2PEF+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Visualizing cancer cell metabolic dynamics regulated with aromatic amino acids using DO-SRS and 2PEF microscopy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 779702(2021).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+imaging+of+lipid+metabolic+changes+in+drosophila+ovary+during+aging+using+DO-SRS+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging%22%5BJournal%5D)">Direct imaging of lipid metabolic changes in drosophila ovary during aging using DO-SRS microscopy.</a> Frontiers in Aging. 2, 819903(2022).</li>
<li>Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DO-SRS+imaging+of+metabolic+dynamics+in+aging+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">DO-SRS imaging of metabolic dynamics in aging Drosophila.</a> Analyst. 146 (24), 7510-7519 (2021).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+tracing+of+deuterium+for+imaging+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).</li>
<li>Fung, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+sub-cellular+methionine+and+insulin+interplay+in+triple+negative+breast+cancer+lipid+droplet+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Imaging sub-cellular methionine and insulin interplay in triple negative breast cancer lipid droplet metabolism.</a> Frontiers in Oncology. 12, 858017(2022).</li>
<li>Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DO-SRS+imaging+of+diet+regulated+metabolic+activities+in+Drosophila+during+aging+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">DO-SRS imaging of diet regulated metabolic activities in Drosophila during aging processes.</a> Aging Cell. 21 (4), e13586(2022).</li>
<li>Shi, L., Wei, M., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly-multiplexed+tissue+imaging+with+raman+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Highly-multiplexed tissue imaging with raman dyes.</a> Journal of Visualized Experiments. (182), e63547(2022).</li>
<li>Rysman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+lipogenesis+protects+cancer+cells+from+free+radicals+and+chemotherapeutics+by+promoting+membrane+lipid+saturation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">De novo lipogenesis protects cancer cells from free radicals and chemotherapeutics by promoting membrane lipid saturation.</a> Cancer Research. 70 (20), 8117-8126 (2010).</li>
<li>Lisec, J., Jaeger, C., Rashid, R., Munir, R., Zaidi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+lipid+class+homeostasis+is+altered+under+nutrient-deprivation+but+stable+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer cell lipid class homeostasis is altered under nutrient-deprivation but stable under hypoxia.</a> BMC Cancer. 19 (1), 501(2019).</li>
<li>Thiam, A. R., Dugail, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet-membrane+contact+sites+-+from+protein+binding+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet-membrane contact sites - from protein binding to function.</a> Journal of Cell Science. 132 (12), (2019).</li>
<li>Schott, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet+size+directs+lipolysis+and+lipophagy+catabolism+in+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet size directs lipolysis and lipophagy catabolism in hepatocytes.</a> The Journal of Cell Biology. 218 (10), 3320-3335 (2019).</li>
<li>Hoang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+resolution+DO-SRS+and+2PEF+imaging+of+metabolic+dynamics+regulated+by+L-methionine+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Optical+Biopsy+XXI%3A+Toward+Real-Time+Spectroscopic+Imaging+and+Diagnosis.+SPIE%22%5BJournal%5D)">Subcellular resolution DO-SRS and 2PEF imaging of metabolic dynamics regulated by L-methionine in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Optical Biopsy XXI: Toward Real-Time Spectroscopic Imaging and Diagnosis. SPIE. 1237303, 6-13 (2023).</li>
<li>Jang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+A-PoD%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Super-resolution stimulated Raman scattering microscopy with A-PoD.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+metabolic+imaging+uncovers+sex-+and+diet-dependent+lipid+changes+in+aging+drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Optical metabolic imaging uncovers sex- and diet-dependent lipid changes in aging drosophila brain.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-molecular+hyperspectral+PRM-SRS+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Multi-molecular hyperspectral PRM-SRS imaging.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Wei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+chemical+imaging+by+clearing-enhanced+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (14), 6608-6617 (2019).</li>
<li>Chang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+monitoring+of+cell+metabolism+and+lipid+production+in+3D+engineered+human+adipose+tissues+using+label-free+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Non-invasive monitoring of cell metabolism and lipid production in 3D engineered human adipose tissues using label-free multiphoton microscopy.</a> Biomaterials. 34 (34), 8607-8616 (2013).</li>
<li>Leica TCS SP8 CARS CARS Microscope - Label Free Imaging. Leica Microsystems. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/downloads/">https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/downloads/</a> (2023).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.

DO-SRS en 2PEF beeldvorming zijn toegepast om metabole dynamica te onderzoeken in verschillende ex vivo modellen, waaronder Drosophila en menselijke weefsels 21,22,23,24,26,27,33. De beeldvormingsmodaliteit die in deze studie wordt gebruikt, integreert DO-SRS en 2PEF-microscopie, di...

Omdat ze essentiële aromatische aminozuren (AAAs) zijn, kunnen fenylalanine (Phe) en tryptofaan (Tryp) door het menselijk lichaam worden geabsorbeerd om nieuwe moleculen te synthetiseren voor het ondersteunen van normale biologische functies1. Phe is nodig voor de synthese van eiwitten, melanine en tyrosine, terwijl Tryp nodig is voor de synthese van melatonine, serotonine en niacine 2,3. Overmatige consumptie van deze AAAs kan echter het zoogdierdoel van de rapamycine (mTOR) -route upreguleren, AMP-geactiveerd eiwitkinase remmen en interfereren met het mitochondriale metabolisme, waardoor de biosynthese van macromoleculen collectief wordt gewijzigd en leidt tot de productie van kwaadaardige voorlopers, zoals reactieve zuurstofsoorten (ROS) in gezonde cellen 4,5,6. Directe visualisatie van veranderde metabole dynamiek onder overmatige AAA-regulatie is essentieel om de rol van AAAs te begrijpen bij het bevorderen van de ontwikkeling van kanker en de groei van gezonde cellen 7,8,9.
Traditionele AAA-studies zijn gebaseerd op gaschromatografie (GC)10. Andere methoden, zoals magnetische resonantie beeldvorming (MRI), hebben beperkte ruimtelijke resoluties, waardoor het moeilijk is om cellulaire en subcellulaire analyse van biologische monsters uit te voeren11. Onlangs is matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatie (MALDI) ontwikkeld om de rol van AAAs in lipide- en eiwitsyntheses bij kankerproliferatie op te helderen met niet-invasieve biomarkers12,13,14. Deze techniek heeft echter nog steeds last van ondiepe beelddiepten, slechte ruimtelijke resolutie en uitgebreide monstervoorbereiding. Op cellulair niveau kunnen niet-toxische stabiele isotopen, zoals stikstof-15 en koolstof-13, worden getraceerd met multi-isotoopbeeldvorming en secundaire ionenmassaspectrometrie op nanoschaal om hun opname in macromoleculen te begrijpen. Deze methoden zijn echter destructief voor levende biologische monsters15,16. Atomic force microscopy (AFM) is een andere krachtige techniek die metabole dynamica kan visualiseren17. De trage snelheid van scannen tijdens AFM-beeldvorming kan daarentegen beeldvervorming van het resultaat van thermische drift veroorzaken.
We ontwikkelden een niet-invasieve biorthogonale beeldvormingsmodaliteit door deuteriumoxide (D2O) gesondeerde gesonde Raman scattering (DO-SRS) microscopie en labelvrije twee-foton excitatie fluorescentiemicroscopie (2PEF) te koppelen. Deze modaliteit bereikt een hoge ruimtelijke resolutie en chemische specificiteit bij het afbeelden van biologische monsters 18,19,20,21,22,23,24. Dit protocol introduceert de toepassingen van DO-SRS en 2PEF om de metabole dynamiek van lipiden, eiwit- en redoxverhoudingsveranderingen tijdens kankerprogressies te onderzoeken. Omdat D2O een stabiele isotoopvorm van water is, kunnen cellulaire biomoleculen worden gelabeld met deuterium (D) vanwege de snelle compensatie met totaal lichaamswater in cellen, waarbij koolstof-deuterium (C-D) bindingen worden gevormd door enzymatische uitwisseling21. De C-D-bindingen in nieuw gesynthetiseerde macromoleculen, waaronder lipiden, eiwitten, DNA / RNA en koolhydraten, kunnen worden gedetecteerd in het celstille gebied van het Raman-spectrum 20,21,22,25,26,27. Met twee gesynchroniseerde laserpulsen kunnen C-D-bindingen van nieuw gesynthetiseerde lipiden en eiwitten via hyperspectrale beeldvorming (HSI) op afzonderlijke cellen worden weergegeven zonder ze te extraheren of te labelen met cytotoxische middelen. Bovendien heeft SRS-microscopie de mogelijkheid om driedimensionale (3D) modellen te construeren van geselecteerde regio's van belang in biologische monsters door een reeks dwarsdoorsnedebeelden vast te leggen en te combineren22,26. Met hyperspectrale en 3D-volumetrische beeldvorming kan DO-SRS ruimtelijke verdelingen van nieuw gesynthetiseerde macromoleculen in afzonderlijke cellen verkrijgen, samen met het type organellen dat het proces van het bevorderen van kankergroei onder AAA-verordening22 vergemakkelijkt. Bovendien kunnen we met behulp van 2PEF autofluorescentiesignalen van flavine en nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) verkrijgen met hoge resolutie, diepe penetratiediepte en schade op laag niveau in biologische monsters21,23,24. Flavine- en NADH-autofluorescentiesignalen zijn gebruikt om redoxhomeostase en lipideperoxidatie in kankercellen te karakteriseren22,26. Als zodanig biedt de koppeling van DO-SRS en 2PEF niet alleen subcellulaire analyse van AAA-gereguleerde metabole dynamiek in kankercellen met een hoge ruimtelijke distributie, chemische specificiteitsinformatie en minimale monstervoorbereiding, maar de methode vermindert ook de noodzaak om endogene moleculen te extraheren of te labelen met toxische reagentia. In dit protocol presenteren we eerst de procedures van D2O en aminozuurpreparaat, evenals kankercelkweek. Vervolgens tonen we de protocollen van DO-SRS imaging en 2PEF imaging. Ten slotte presenteren we de representatieve resultaten van SRS- en 2PEF-beeldvorming, die AAA-gereguleerde metabole veranderingen van lipiden en eiwitten en redoxratioveranderingen in kankercellen aantonen. Een gedetailleerde illustratie van het proces is gemarkeerd in figuur 1.

<table><tbody><tr><td>10 mL Serological Pipettes&nbsp;</td><td>Avantor (by VWR)</td><td>75816-100</td><td>https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100</td></tr><tr><td>15 mL Conical Centrifuge Tube</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td>https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664</td></tr><tr><td>16% Formaldehyde, Methanol-free</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28906</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0112929</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929</td></tr><tr><td>25 mm Syringe Filter, 2 &mu;m PES</td><td>Foxx Life Sciences</td><td>381-2216-OEM</td><td>https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003</td></tr><tr><td>460 nm Filter Cube</td><td>Olympus</td><td></td><td>OCT-ET460/50M32</td></tr><tr><td>AC Adapters of the Power Supply for LD OBIS 6 Laser Remote</td><td>Olympus</td><td></td><td>Supply power to the laser</td></tr><tr><td>Band-pass Filter</td><td>KR Electronics</td><td>KR2724</td><td>8 MHz</td></tr><tr><td>BNC 50 Ohm Terminator&nbsp;</td><td>Mini Circuits</td><td>STRM-50</td><td></td></tr><tr><td>BNC Cable</td><td>Thorlabs</td><td>2249-C</td><td>Coaxial Cable, BNC Male/Male</td></tr><tr><td>Broadband Dielectric Mirror</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E03</td><td>750 - 1100 nm</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Condenser</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Corning</td><td>2850-25</td><td>https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25</td></tr><tr><td>DC power supply</td><td>TopWard</td><td>6302D</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic Mount</td><td>Thorlabs</td><td>KM100CL</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagent</td><td>mpbio&nbsp;</td><td>196055</td><td>https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle&rsquo;s Medium without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate</td><td>MilliporeSigma</td><td>38210000</td><td>https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder With Sodium Bicarbonate and without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle&rsquo;s Medium</td><td>Corning</td><td>MT10027CV</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco%27s%20Modified%20Eagle%27s%20Medium%20</td></tr><tr><td>FIJI ImageJ</td><td>ImageJ</td><td>Version 1.53t 24 August 2022</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td></tr><tr><td>Heavy Water (Deuterium Oxide)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td><td>7732-18-5</td><td>https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L</td></tr><tr><td>Hela Cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>https://www.atcc.org/products/ccl-2</td></tr><tr><td>Hemocymeter</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z359629-1EA</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB&amp;gclsrc=aw.ds</td></tr><tr><td>High O.D. Bandpass Filter</td><td>Chroma Technology</td><td>ET890/220m</td><td>Filter the Stokes beam and transmit the pump beam</td></tr><tr><td>HyClone Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Cytiva&nbsp;</td><td>SH300880340</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340</td></tr><tr><td>HyClone Trypsin 0.25% (1x) Solution</td><td>Cytiva</td><td>SH30042.02</td><td>https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445</td></tr><tr><td>Integrated SRS Laser System</td><td>Applied Physics &amp; Electronics, Inc.</td><td>picoEMERALD</td><td>picoEMERALD provides an output pulse at 1031 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam.&nbsp; The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an,interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720&ndash;950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1031 nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulses are achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope.</td></tr><tr><td>Inverted Laser-scanning Microscope</td><td>Olympus</td><td>FV1200MPE</td><td></td></tr><tr><td>IX3-CBH Control box</td><td>Olympus</td><td></td><td>Control the laser-scanning microscope</td></tr><tr><td>Kinematic Mirror Mount</td><td>Thorlabs</td><td>POLARIS-K1-2AH</td><td>2 Low-Profile Hex Adjusters</td></tr><tr><td>L-Phenalynine</td><td>Sigma</td><td>P5482-25G</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482</td></tr><tr><td>L-Tryptophan</td><td>Sigma</td><td>T8941-25G</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941</td></tr><tr><td>LabSpec 6</td><td>Horiba XploRA</td><td>N/A</td><td>https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/</td></tr><tr><td>Lock-In Amplifier</td><td>Zurich Instruments</td><td>N/A</td><td>https://www.zhinst.com/americas/en/

bioorthogonale chemische beeldvorming van celmetabolisme gereguleerd door aromatische aminozuren

Bioorthogonal Chemical Imaging of Cell Metabolism Regulated by Aromatic Amino Acids

Essentiële aromatische aminozuren (AAAs) zijn bouwstenen voor het synthetiseren van nieuwe biomassa's in cellen en het ondersteunen van normale biologische functies. Een overvloedig aanbod van AAAs is bijvoorbeeld belangrijk voor kankercellen om hun snelle groei en deling te behouden. Hiermee is er een stijgende vraag naar een zeer specifieke, niet-invasieve beeldvormingsbenadering met minimale monstervoorbereiding om direct te visualiseren hoe cellen AAAs gebruiken voor hun metabolisme in situ. Hier ontwikkelen we een optisch beeldvormingsplatform dat deuteriumoxide (D2O) sonderen combineert met gestimuleerde Raman-verstrooiing (DO-SRS) en DO-SRS integreert met twee-foton excitatiefluorescentie (2PEF) in een enkele microscoop om de metabole activiteiten van HeLa-cellen onder AAA-regulatie direct te visualiseren. Gezamenlijk biedt het DO-SRS-platform een hoge ruimtelijke resolutie en specificiteit van nieuw gesynthetiseerde eiwitten en lipiden in enkele HeLa-celeenheden. Bovendien kan de 2PEF-modaliteit autofluorescentiesignalen van nicotinamide, adeninedinucleotide (NADH) en flavine op een labelvrije manier detecteren. Het hier beschreven beeldvormingssysteem is compatibel met zowel in vitro als in vivo modellen, wat flexibel is voor verschillende experimenten. De algemene workflow van dit protocol omvat celkweek, kweekmediavoorbereiding, celsynchronisatie, celfixatie en monsterbeeldvorming met DO-SRS- en 2PEF-modaliteiten.

De toevoeging van overtollige AAAs in 15x concentraties aan de 50% D2O-bevattende celkweekmedia produceerde verschillende C-D Raman-banden van nieuw gesynthetiseerde lipiden en eiwitten in HeLa-cellen (figuur 2B). Eerdere experimenten werden uitgevoerd met verschillende concentratieniveaus, zoals 2x en 5x, en hoewel de gegevens niet worden gepresenteerd, produceerde de 15x-concentratie de meest verschillende C-D Raman-banden van nieuw gesynthetiseerde lipiden en eiwitten. Specifie...

We presenteren een protocol om metabole activiteiten in cellen gereguleerd door aminozuren direct te visualiseren met behulp van deuteriumoxide (zwaar water D2O) gesondeerde gestimuleerde Raman-verstrooiing (DO-SRS) microscopie, die is geïntegreerd met twee-foton excitatie fluorescentiemicroscopie (2PEF).

Bioorthogonale chemische beeldvorming van celmetabolisme gereguleerd door aromatische aminozuren

Essential aromatic amino acids (AAAs) are building blocks for synthesizing new biomasses in cells and sustaining normal biological functions. For example, ...

We presenteren een nieuwe beeldvormingstechniek met labelvrije mogelijkheden, hoge chemische specificiteit en subcellulaire resolutie. Onze methodologie kan een vraag beantwoorden over metabole disfunctie bij veroudering en ziekten zoals kanker Raman-beeldvorming, in combinatie met twee fotonenfluorescentie en tweede harmonische generatie, biedt een niet-destructieve en labelvrije beeldvormingstechnologie die minimale monstervoorbereiding vereist en een hoge subcellulaire resolutie bereikt zonder het celmonster te beschadigen. Verschillende beeldvormingsmodaliteiten worden gebruikt als onderdeel van ons platform.Individuen moeten ons protocol zo goed mogelijk volgen en opmerken dat ons systeem zelfgebouwd is. Onderweg moeten ze hun eigen praktijk ontwikkelen om succes te garanderen. Begin in twee afzonderlijke buizen met het meten en mengen van 10 milligram DMEM-poeder met 4,7 milliliter dubbel gedestilleerd water in een conische buis van 15 ml.Draai de buis grondig om en keer deze om om ervoor te zorgen dat de oplossing goed wordt gemengd. Voeg voor beide buizen 4,7 ml deuteriumoxide, 0,5 ml FBS en 0,1 ml penicilline en streptomycine toe voordat u de buis vortext en omkeert. Voeg vervolgens overtollige fenylalanine toe aan één buis en overtollig tryptofaanpoeder aan de tweede buis en meng opnieuw.Voeg methionine en threonine toe met respectievelijk 30 en 95 mg per ml aan beide buizen, gevolgd door vortexing en omkering van de buis. Filter daarna de voorbereide media met een spuitfilter van 25 millimeter met filters van 0,22 micrometer. Verzegel alle media met conische buizen met Parafilm.Bewaar voorbereide media bij vier graden Celsius. Behoud healercellen in een kweekkolf met behulp van standaard DMEM aangevuld met 10% FBS, 1% penicilline en streptomycine. Subcultuur de healer cellen in een split ratio van één tot 10 tot het bereiken van 80% of hoger cel levensvatbaarheid.Voordat de cellen worden gezaaid, dompelt u de gesteriliseerde Poly-D-Lysine, met laminine beklede, ronde afdekking met een diameter van 12 mm onder in 70% ethanol. Droog de afdekslips met pluisvrije doekjes en plaats de schone afdekstroken in de juiste putjes van de plaat. Was de cellen eenmaal met PBS zonder magnesium- en calciumionen.Voeg 0,25% trypsine toe om de hechtcellen van de kolf te scheiden en incubeer gedurende drie minuten bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Voeg vervolgens DMEM aangevuld met 10% FBS, 1% penicilline en streptomycine toe aan de cellen. Pipeteer zachtjes op en neer.Verzamel de cellen door centrifugeren bij 300 G gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Suspensie vervolgens de cellen opnieuw in DMEM aangevuld met 0,5% FBS en 1% penicilline en streptomycine. Tel de trypan blauwe vlekcellen met behulp van een hemocytometer onder een lichtmicroscoop en zaad met een dichtheid van twee keer 10 tot de vijfde cellen per put van een 24-putplaat.Verdeel de cellen gelijkmatig door de plaat voorzichtig te schudden. Incubeer bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Vervang na acht uur de oude kweekmedia door 50% deuteriumoxide en overtollig fenylalanine of 50% deuteriumoxide en overtollige tryptofaanmedia.Breng de cellen terug naar de incubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 36 uur. Bereid nu microscoopglaasjes voor met beeldruimtes met een diameter van negen mm. Plaats 15 microliter PBS, aangevuld met calcium- en magnesiumionen en spoel de cellen met dezelfde oplossing.Voeg 0,5 ml 4% methanolvrije paraformaldehyde-oplossing toe en laat de plaat 15 minuten onder de bioveiligheidskap liggen. Zuig de paraformaldehyde-oplossing aan en spoel deze af met PBS, tweemaal aangevuld met calcium en magnesiumijzer. Voeg een ml PBS, aangevuld met calcium- en magnesiumionen, toe aan elke put.Gebruik een steriel pincet om de afdekslip van elke put zorgvuldig te verwijderen. Keer ze om en plaats de cel met de zijkant op de beeldvormingsruimten in contact met de PBS. Sluit de buitenste laag van de afdekslip af met de imaging spacer met transparante nagellak.Laad het biologische monster op de monsterhouder direct onder de objectieflens. Klik vervolgens op het camerapictogram in de software om de videocamera in te schakelen en het scherpstelvlak aan te passen om een interessant gebied te identificeren met de 50X-objectieflens. Schakel over naar de 100X objectieflens.Klik op het stoppictogram om de videocamera uit te schakelen. Selecteer vervolgens een rooster van 1.800 lijnen per mm en stel het acquisitiebereik in van 400 tot 3.150 centimeter omgekeerd. Stel ten slotte de acquisitietijd in op 90 seconden, de accumulatie op drie en de binning op vier voor de minste ruis en het meest nauwkeurige spectrum.Klik op start om de laser op te warmen. Begin door de hoofdschakelaar van de bedieningskast IX3CBH op Aan te drukken, gevolgd door de hoofdschakelaar van de aanraakpaneelcontroller. Schakel vervolgens de hoofdschakelaar van de wisselstroomadapter van de voeding in voor LDOBIS6 laserafstandsbediening die is aangesloten op de fv31s-kam van de hoofdlasercombiner.Schakel ook de AC-adapter van de LDOBIS6 laserafstandsvoeding in die is aangesloten op de sublasercombiner FV31S-kam. Druk daarna op de hoofdschakelaars van de SI-fotodiodedetector en lock-in versterker. Stel de laser-IR in op 1031 nanometer Stel het pico smaragdsysteem in op een instelbare golflengte tussen 720 en 990 nm.Monteer het monster op de olie en plaats een grote waterdruppel op de microscoopglaasje waar het monster is bevestigd. Selecteer scangrootte als 512 bij 512 pixels. Verkrijg en bewaar de beelden als een Olympus.OIR grafisch bestand. Nadat u het signaal op 862.0 hebt ingesteld, krijgt u een achtergrondafbeelding en slaat u deze op. Stel de verblijftijd in op acht microseconden per pixel en de pixelgrootte op 512 bij 512 pixels.Stel de lasersluitervermogensparameter in op 150 milliwatt Voor 3D-beeldreconstructie stemt u het gestimuleerde Raman-verlies af op 2.850 cm inverse. Zodra de gewenste afzonderlijke cellen zijn geïdentificeerd, registreert u de laser om vanaf het bovenste focusvlak te scannen om de bovenste en onderste lagen van die cellen te detecteren. Deuteriumoxide, gesondeerd, gestimuleerd Raman-verstrooiing werd gebruikt om de ruimtelijke verdeling van CD-signalen op afzonderlijke cellen te visualiseren.De controlecellen vertoonden matige CD-, lipide- en eiwitbanden. De 15 x v en 15 x trip vertoonden echter sterkere CD-lipiden- en eiwitverboden. Kwantitatieve analyse gaf aan dat overtollige aromatische aminozuren de lipidesynthese met 10 tot 17% kunnen upreguleren, maar de eiwitsynthese met 10% kunnen downreguleren Metrische analyse van met aromatische aminozuren behandelde cellen toonde een toename van 50% in flavine gedeeld door flavine plus NADH en een toename van 10% in onverzadigde lipide gedeeld door verzadigde lipide.De gestimuleerde Raman 3D lipide druppel volume projectie in healer cellen onder controle en overtollige aromatische aminozuren condities worden getoond. Kwantitatieve analyses van 3D-lipidedruppels toonden een toename van het aantal, maar een afname in grootte van met aromatische aminozuren behandelde cellen in vergelijking met de controle. Beeldvormingsparameters voor Raman en twee foton fluorescerende beeldvorming moeten van het ene monster naar het andere worden geoptimaliseerd om de beste beeldkwaliteit te garanderen.Individuen kunnen ons systeem koppelen aan de tweede harmonische generatie om de collageenstructuur te bestuderen, die vroege metabole veranderingen in veroudering en ziekten opheldert en de progressie van neurodegeneratie of kanker begrijpt. Onze technologie is de eerste van deze soort die lipide- en eiwitsynthese visualiseert in biologische systemen met een hoge subcellulaire resolutie. De technologie kan ook worden vertaald naar een kliniek voor niet-invasieve ziektedetectie.

bioorthogonal-chemical-imaging-cell-metabolism-regulated-aromatic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

13 C-isotoop labeling is een nuttige techniek voor het bepalen van de cel centrale metabolisme voor verschillende soorten micro-organismen. Na de cellen zijn gekweekt met een specifiek gelabeld substraat, kunnen GC-MS metingen onthullen functionele metabole routes op basis van unieke patronen in de etikettering proteïnogene aminozuren.

Metabole route Bevestiging en Discovery door 13 C-etikettering van proteïnogene aminozuren

Een facile fluorescentie-bepaling is bedoeld om te evalueren van de doeltreffendheid van amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA paren integratie van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) in eiwitten uitgedrukt in zoogdiercellen. De toepassing van ncAAs op het bestuderen van de G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs) wordt beschreven, met inbegrip van foto-crosslinking toewijzing van bindende sites en bioorthogonal GPCR etiketten op levende cellen.

Optimaliseren van de genetische opneming van chemische sondes in GPCRs voor foto-crosslinking kartering en Bioorthogonal scheikunde in levende cellen van zoogdieren

Hier presenteren we een robuust protocol voor het kwantificeren van 40 verbindingen die betrokken zijn bij het centrale koolstof-en energiemetabolisme in celvrije eiwitsynthese reacties. Het celvrije synthese mengsel wordt met aniline gekwantificeerd voor effectieve scheiding met behulp van omgekeerde-fase vloeistofchromatografie en vervolgens door massaspectrometrie met behulp van isotopisch gelabelde interne normen.

Absolute kwantificering van de Celvrije eiwitsynthese metabolisme door omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometrie

Dit protocol presenteert een radioactief gelabelde aminozuuropnametest, die nuttig is voor het evalueren van aminozuurconsumptie in primaire cellen of in geïsoleerde botten.

Evaluatie van aminozuurconsumptie in gekweekte botcellen en geïsoleerde botschachten

Real-time cel metabole flux assay meet het zuurstofverbruik en de extracellulaire verzuringssnelheid, die overeenkomt met mitochondriale en glycolytische adenosinetrifosfaatproductie, met behulp van pH- en zuurstofsensoren. Het manuscript legt een methode uit om de energiestatus van osteoblasten en de karakterisering en interpretatie van de cellulaire bio-energetische status te begrijpen.

Real-time cell metabolic flux analyzer gebruiken om osteoblast bio-energetica te monitoren

Dit protocol beschrijft fluorescentiebeeldvorming en analyse van de endogene metabole co-enzymen, gereduceerd nicotinamide-adenine (fosfaat) dinucleotide (NAD (P) H) en geoxideerd flavine-adenine dinucleotide (FAD). Autofluorescentie beeldvorming van NAD(P)H en FAD biedt een labelvrije, niet-destructieve methode om het cellulaire metabolisme te beoordelen.

Autofluorescentie beeldvorming om cellulair metabolisme te evalueren

Hier presenteren we een protocol dat gebruik maakt van optische fotothermische infrarood-fluorescentie in situ hybridisatie (OPTIR-FISH), ook bekend als mid-infrarood fototherme-FISH (MIP-FISH), om individuele cellen te identificeren en hun metabolisme te begrijpen. Deze methodologie kan breed worden toegepast voor diverse toepassingen, waaronder het in kaart brengen van het cellulaire metabolisme met een resolutie van één cel.

Optische fotothermische infrarood-fluorescentie in situ hybridisatie (OPTIR-FISH)

Door gebruik te maken van een multimodaal platform dat labelvrije optische beeldvormingsmodaliteiten combineert, hebben we een protocol ontwikkeld voor het visualiseren en kwantificeren van cellulaire dynamiek en metabolisme. Door middel van beeldvorming via multifotonfluorescentie, tweede harmonische generatie en gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie kunnen we een holistisch overzicht van de cellulaire en moleculaire omgeving genereren.

Multimodaal optisch beeldvormingsplatform voor het bestuderen van cellulair metabolisme

Dit protocol integreert een op maat gemaakt bioreactorsysteem met gehyperpolariseerde ¹³C NMR-spectroscopie om het real-time pyruvaatmetabolisme in levende cellen te meten, waardoor de reproduceerbaarheid en kinetische nauwkeurigheid voor metabole studies en toepassingen voor het screenen van geneesmiddelen worden verbeterd.

Real-time metabole detectie in levende cellen met behulp van gehyperpolariseerde 13C NMR

Niet-destructieve volume visualisatie kan alleen worden bereikt door tomografische technieken, waarvan de meest efficiënte is de x-stralen micro gecomputeriseerde tomografie (CT).

Hoge resolutie 3D-beeldvorming van Ex-Vivo Biologische monsters door Micro CT

Leer bioorthogonale chemische beeldvorming van celmetabolisme gereguleerd door aromatische aminozuren met subcellulaire resolutie. Deze labelvrije methode combineert Raman-microscopie met fluorescentie voor niet-destructieve analyse van metabole activiteit.

Bioorthogonale chemische beeldvorming van celmetabolisme gereguleerd door aromatische aminozuren

Meer video's verkennen