Name: Standaardisatie van een cytometrische kralentest op basis van eigeel-antilichamen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T12:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Leer de standaardisatie van een cytometrische kralentest met IgY-antilichamen uit eigeel voor gevoelige antigeendetectie. Deze methode biedt een betrouwbaar en kosteneffectief alternatief voor immunoassays.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag de FIOCRUZ ("Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane - ILMD / Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS / ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA"), het postdoctorale programma in biotechnologie (PPGBIOTEC aan de Universidade Federal do Amazonas - UFAM), de Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) en de Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) bedanken voor het verstrekken van de beurzen. Figuur 2 en Figuur 4 zijn gemaakt met biorender.com.

OPMERKING: Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen, reagentia en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt.
1. Extractie van IgY uit eierdooiers
<ol><li>Hygiënisatie van de eieren<ol><li>Dompel de eieren (vers gelegd of tot 4 dagen na het leggen, van de Gallus gallus Dekalb White-lijn) onder in een 0,2% verdunde oplossing van natriumhypochloriet, spoel snel onder stromend water en veeg voorzichtig af voor later of onmiddellijk gebruik. OPMERKING: Indien niet onmiddellijk gebruikt, maximaal 15 dagen bij 4 °C bewaren.</li>
	</ol></li>
	<li>Scheiding van de dooiers<ol><li>Breek het ei voorzichtig en scheid de dooier van het wit met behulp van een dooierscheider.</li>
		<li>Verwijder het overtollige wit met behulp van filtreerpapier. Prik de dooier door en verzamel de binnenkant in een conische buis van 50 ml. Bewaar de dooier bij −20 °C gedurende ten minste 24 uur voor gebruik. OPMERKING: Tijdens deze experimenten (gegevens niet getoond), werd waargenomen dat het gebruik van dooiers die niet eerder waren ingevroren, de isolatie van immunoglobulinen uit het lipidegedeelte van de dooiers belemmerde.</li>
	</ol></li>
	<li>Verzuring van de dooiers<ol><li>Ontdooi de opgeslagen dooier en verdun deze in een verhouding van 1:10 in 1 mM PBS. Stel de pH van de oplossing in op 5 met 1 N HCl en incubeer de oplossing bij 4 °C gedurende 6-24 uur.</li>
		<li>Centrifugeer de oplossing gedurende 40 minuten bij 3.000 × g , win het supernatant terug en filtreer het met een cellulosefilter van 0,7 mm.</li>
	</ol></li>
	<li>Precipitatie van lipiden met caprylzuur<ol><li>Stel de pH van de supernatanten opnieuw in op 5 en voeg het caprylzuur (≥98% beginconcentratie) toe tot een eindconcentratie van 8,7% onder constant roeren gedurende 30 minuten bij 4 °C. OPMERKING: Het volume van het supernatant kan variëren afhankelijk van de lipidemassa die in stap 1.3.2 is neergeslagen. Zo moet bijvoorbeeld 3,107 ml caprylzuur worden toegevoegd aan 35 ml van het supernatant dat na filtratie wordt verkregen.</li>
		<li>Centrifugeer de monsters gedurende 15 minuten bij 18.600 × g en scheid het supernatant van het neergeslagen materiaal.</li>
		<li>Stel de pH van de oplossing opnieuw in op 7,4 met behulp van 1 M NaOH, kwantificeer de antilichamen met behulp van de Bradford-test8 en bewaar de antilichamen bij −20 °C tot het moment van gebruik. OPMERKING: De antilichamen werden verkregen in een concentratie van 1 μg/μL, die werd geverifieerd door middel van een 12% SDS-PAGE-gel.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Verzadigingscurve van IgY-antilichamen tegen latexparels
<ol><li>Koppeling van de kralen aan de IgY-antilichamen<ol><li>Voeg 21 μL 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC, beginconcentratie van 367 mM) en 21 μL N-hydroxysuccinimide (NHS, beginconcentratie van 50 mM) toe aan 21 μL latexparels (4% m/v) en pas aan tot een eindvolume van 2,1 ml met gefilterde 10 mM PBS. OPMERKING: Het pH-bereik van de PBS-oplossing moet tussen 7,2 en 7,4 liggen, omdat bij dit werk een negatieve verandering in de koppeling en andere stappen werd waargenomen bij gebruik van een oplossing buiten dit bereik.</li>
		<li>Incubeer bij 22 °C met snel schudden gedurende 3 uur.</li>
		<li>Voeg 4 μg, 2 μg, 1 μg, 0,5 μg, 0,25 μg, 0,125 μg en 0 μg van het eerder geëxtraheerde vangantilichaam IgY-PfHRP2 (zie stap 1.4.3) toe aan verschillende microbuisjes die 100 μl van de in stap 2.1.1 beschreven oplossing bevatten (0,04% eindparelconcentratie) en incubeer gedurende 16 uur onder dezelfde omstandigheden als beschreven in stap 2.1.2.</li>
		<li>Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij 857 × g bij 15 °C, gooi de supernatanten weg en was de latexparels tweemaal met 500 μL gefilterde 10 mM PBS (0,008% eindparelconcentratie) met behulp van centrifugatie- en resuspensiecycli. OPMERKING: Niet meer dan 857 × g bedragen, omdat in dit werk werd waargenomen dat de kralen na deze snelheid vervormingen ondergaan die het testresultaat negatief veranderen.</li>
	</ol></li>
	<li>De kralen blokkeren<ol><li>Resuspendeer de monsters in 1 ml blokkeringsbuffer (0,004% eindparelconcentratie) (gefilterd 10 mM PBS + runderserumalbumine, BSA, 5%) en incubeer onder dezelfde omstandigheden als beschreven in stap 2.1.2 gedurende 2 uur.</li>
		<li>Na het blokkeren wassen zoals beschreven in stap 2.1.4 en resuspensie in 10 mM PBS-buffer.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubatie met anti-kip secundaire antilichamen gelabeld met Alexa Fluor 488<ol><li>Voeg 100 μL fluorescerend anti-kippenantilichaam (2 mg/ml) verdund tot 1:2.000 in 10 mM PBS + 0,5% BSA toe aan elke microbuis, zoals beschreven in stap 2.1.3.</li>
		<li>Incubeer de monsters zoals beschreven in stap 2.1.2, dit keer in het donker, gedurende 30 minuten.</li>
		<li>Was de kralen zoals in stap 2.1.4 en resuspensie met 250 μL (0,016% eindparelconcentratie) gefilterde 10 mM PBS. Voer de meting van de flowcytometer uit zoals beschreven in rubriek 5. OPMERKING: Van de verkregen fluorescentiepercentagegegevens observeert u het beginpunt van plateauvorming (1 μg, zoals waargenomen in deze studie). We raden aan om het tweede punt van het plateau (2 μg, zoals hier waargenomen) te gebruiken voor de volgende stappen (figuur 1).</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65123/65123fig01.jpg"> Figuur 1: Grafiek van de flowcytometrieanalyse om het verzadigingspunt van de IgY-PfHRP2-antilichaamkoppeling aan de latexkorrels te bepalen. De x-as vertegenwoordigt de antilichaamconcentratie en de Y-as vertegenwoordigt het percentage fluorescentie dat wordt verkregen. Kruskal-Wallis test, p < 0,0033. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65123/65123fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
3. Flowcytometrietest op basis van latexkorrels voor antigeendetectie
<ol><li>Na het bepalen van het verzadigingspunt van de IgY-antilichamen tegen de latexparels, voert u het kraalactiveringsproces opnieuw uit, volgens stap 2.1.1.<ol><li>Koppel de kralen bij de waargenomen verzadigingsconcentratie (zoals beschreven in stap 2.1.3) en incubeer volgens stap 2.1.2. OPMERKING: In de testen uitgevoerd met het IgY-PfHRP2-antilichaam was de verzadigingsconditie 2 μg voor elke 1 μL latexkorrels.</li>
	</ol></li>
	<li>Blokkeer en was de kralen volgens stap 2.2.</li>
	<li>Incubatie met het antigeen<ol><li>Om de detectiegrens te bepalen, verdeelt u het equivalent van 100 μL van het geblokkeerde kraalpreparaat in buisjes met verschillende hoeveelheden van het recombinante eiwit Pf HRP2 (1 μg / ml) (rPfHRP2, 10 μg, 1 μg, 0,1 μg, 0,01 μg, 0,001 μg, 0,0001 μg en 0 μg) verdund in 10 mM PBS + 0,5% BSA in drievoud. OPMERKING: Dit recombinante eiwit werd ontwikkeld in het werk van Sousa et al.9.</li>
		<li>Incubeer de kraaloplossingen met rPfHRP2-eiwit zoals beschreven in stap 2.1.2 gedurende 1 uur.</li>
		<li>Voer wasbeurten uit zoals beschreven in stap 2.1.4 en gooi het supernatant weg na centrifugeren.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubatie met het primaire antilichaam<ol><li>Voeg 2 μg muis IgG-antilichaam tegen het rPfHRP2-eiwit verdund in 10 mM PBS + 0,5% BSA toe aan een eindvolume van 100 μL in elk monster. Incubeer de monsters zoals beschreven in stap 2.1.2 en gooi het supernatant na de laatste centrifugatie weg. OPMERKING: Dit antilichaam werd ontwikkeld in het werk van Sousa et al.9.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubatie met het secundaire antilichaam<ol><li>Voeg 100 μL fluorescerend antimuisantilichaam (2 mg/ml) verdund tot 1:2.000 in 10 mM PBS + 0,5% BSA toe aan elk monster. Incubeer zoals beschreven in stap 2.1.2 en resuspensie in 250 μL (0,016% eindparelconcentratie) van gefilterde 10 mM PBS. Voer de meting uit volgens sectie 5.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Flowcytometer aflezen van de monsters
<ol><li>Cytometrie-instelling: Uitlijning van de optische parameters van de cytometer gekoppeld aan een computer<ol><li>Schakel de computer en de flowcytometer in en wacht een paar minuten totdat de apparatuur op de computer is aangesloten.</li>
		<li>Klik op de cytometriesoftware die op de computer is geïnstalleerd en log hierop in. Selecteer in de softwarewerkruimte Cytometer | Opstarten | Schone modus | SIT vloeistoffen. OPMERKING: Luchtbellen en obstructies moeten worden verwijderd tijdens het cytometerinitiatieproces voorafgaand aan de monsterverzameling.</li>
	</ol></li>
	<li>Kwaliteitscontrole<ol><li>Gebruik het kwaliteitscontrolereagens om de spanningen van de fotomultiplicatorbuizen te controleren en de gevoeligheid van de cytometer te beoordelen.</li>
		<li>Plaats het reagens van de cytometeropstelling en de volgparels in een polystyreenbuis met een dikte van 12 mm x 75 mm.</li>
		<li>Meng de buis voorzichtig door vortexing.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van de suspensieparels<ol><li>Voeg voor het bepalen van de basislijn 0,5 ml verdunningsmiddel (10 mM gefilterd PBS, pH 7) en drie druppels kralen toe aan de polystyreenbuis met afdekking van 12 mm x 75 mm. Draai de tube voorzichtig voor gebruik.</li>
		<li>Selecteer in de werkruimte van de cytometersoftware de optie Cytometer | CST en wacht tot de cytometer de verbinding met de cytometersoftware-interface heeft verbroken en verbinding heeft gemaakt met de CS &T-interface. Bekijk het volgende bericht op de statusbalk van de cytometersoftware onder aan het scherm: Losgekoppelde cytometer.</li>
		<li>Gebruik de polystyreenbuis met afdekking van 12 mm x 75 mm die het kwaliteitscontrolereagens bevat en bevestig deze aan de flowcytometersonde.</li>
	</ol></li>
	<li>Verificatie van de cytometerconfiguratie<ol><li>Controleer in het venster Systeemoverzicht of de cytometerconfiguratie geschikt is voor het experiment.</li>
	</ol></li>
	<li>Instellen voor een prestatiecontrole<ol><li>Selecteer de ID van de set-kralen die overeenkomt met de partij CS&T-onderzoekskralen.</li>
	</ol></li>
	<li>Prestatiecontrole<ol><li>Bevestig de buis aan de flowcytometersonde en klik op het venster Setup Control . Selecteer Prestaties controleren en klik op Uitvoeren.</li>
		<li>Zodra de prestatiecontrole is voltooid, wacht u tot er een dialoogvenster wordt geopend. Voer een van de volgende handelingen uit:<ol><li>Om het Cytometer Performance rapport te bekijken, klikt u op View Report.</li>
			<li>Om de prestatiecontrole te voltooien en terug te keren naar de instellingsweergave van de werkruimte, klikt u op Voltooien.</li>
			<li>Bekijk het eindresultaat van de morfometrische en fluorescentiegevoeligheidsanalyse die wordt weergegeven in Systeemsamenvatting | Cytometer Performance Result met de status PASSED.</li>
			<li>Verwijder het buisje uit de cytometer. Controleer de resultaten van de cytometerprestaties die worden weergegeven in het venster Systeemoverzicht .</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>5. Monsteranalyse met behulp van flowcytometrie
<ol><li>Log in op cytometer software.<ol><li>Selecteer in de werkruimte van de cytometersoftware de optie Cytometer | Schone modus | SIT vloeistoffen.</li>
		<li>Pas aan de softwarewerkruimte aan.</li>
		<li>Definieer de gatingstrategie op basis van de morfometrische en fluorescentiekenmerken van de negatieve controledeeltjes (kralen zonder fluorescentie).</li>
		<li>Om de celmorfometrie te bepalen, kiest u Dot Plot Plot Graphic voor de analyse van FSC-A-parameters met behulp van SSC-A (aanvullende figuur 1A). </li>
		<li>Bepaal afzonderlijke cellen door SSC met behulp van Dot Plot Plot Graphic voor de analyse van SSC-H in de y-as en SSC-W in de x-as (aanvullende figuur 1B), en bepaal afzonderlijke cellen door FSC met behulp van Dot Plot Plot Graphic voor de analyse van FSC-H in de y-as en FSC-W in de x-as (aanvullende figuur 1C).</li>
		<li>Kies voor de fluorescentieanalyses voor FL1 Dot Plot Plots met FCS-A. Gebruik een polystyreenbuis met stop van 12 mm x 75 mm met niet-gelabelde monsters en monsters die eerder zijn gelabeld met alexa fluor 488 in één kleur (aanvullende figuur 1D, E).</li>
	</ol></li>
	<li>Verkrijg het monster in flowcytometrie.<ol><li>Gebruik een polystyreenbuis met stop van 12 mm x 75 mm die de eerder gelabelde monsters bevat. Meng de inhoud van de buis zorgvuldig, bevestig de buis aan de flowcytometersonde en klik met de linkermuisknop op Verwerven.</li>
		<li>Om het vermogen van de lasers in te stellen, klikt u op Parameters en past u in de onderstaande opties de spanning van de FSC aan op 182 V en de spanning van de SSC op 236 V. Om de drempel in te stellen, klikt u op Cytometer | Drempel, en in de onderstaande opties, stel de FSC in op 500 V.</li>
		<li>Stel de analysepoort in om deeltjes te karakteriseren op grootte en complexiteit, en om eencellige analyse uit te voeren.</li>
		<li>Om autofluorescentie te verwijderen, analyseert u het kleurstofvrije monster dat alleen de latexparels bevat en past u de spanningen van de detector aan: in de onderstaande opties past u de spanning van de FL1 (FITC) aan op 332 V.</li>
		<li>Stel de fluorescentieanalysepoort in vierhoekige indeling in vanaf het negatieve punt dat wordt weergegeven in de grafiek van de puntplot.</li>
		<li>Nadat de morfometrische en fluorescerende analyses zijn aangepast, configureert u het apparaat voor 50.000 gebeurtenissen: klik onder Acquisitie op Record.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+in+the+diagnosis+and+follow+up+of+human+primary+immunodeficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Electronic+Journal+of+the+International+Federation+of+Clinical+Chemistry+and+Laboratory%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies.</a> Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407(2019).</li>
<li>de Figueiredo, A. M., Glória, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mariúba, L. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+applications+of+microsphere-based+flow+cytometry%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Diagnostic applications of microsphere-based flow cytometry: A review.</a> Experimental Biology and Medicine. 247 (20), 1852-1861 (2022).</li>
<li>Morgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometric+bead+array%3A+A+multiplexed+assay+platform+with+applications+in+various+areas+of+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cytometric bead array: A multiplexed assay platform with applications in various areas of biology.</a> Clinical Immunology. 110 (3), 252-266 (2004).</li>
<li>Graham, H., Chandler, D. J., Dunbar, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genesis+and+evolution+of+bead-based+multiplexing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The genesis and evolution of bead-based multiplexing.</a> Methods. 158, 2-11 (2019).</li>
<li>Kellar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+microsphere-based+flow+cytometric+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays.</a> Experimental Hematology. 30 (11), 1227-1237 (2002).</li>
<li>Schade, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chicken+egg+yolk+antibodies+%28IgY-technology%29%3A+A+review+of+progress+in+production+and+use+in+research+and+human+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22ATLA+Alternatives+to+Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): A review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine.</a> ATLA Alternatives to Laboratory Animals. 33 (2), 129-154 (2005).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+chicken+egg+yolk+immunoglobulins+in+the+control+of+terrestrial+and+aquatic+animal+diseases%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Application of chicken egg yolk immunoglobulins in the control of terrestrial and aquatic animal diseases: A review.</a> Biotechnology Advances. 29 (6), 860-868 (2011).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
<li>Sousa, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+polyclonal+antibody-based+sandwich+ELISA+for+detection+of+Plasmodium+vivax+developed+from+two+lactate+dehydrogenase+protein+segments%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A novel polyclonal antibody-based sandwich ELISA for detection of Plasmodium vivax developed from two lactate dehydrogenase protein segments.</a> BMC Infectious Diseases. 14 (1), 49(2014).</li>
<li>Klimentzou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+immunochemical+evaluation+of+antibodies+Y+for+the+poorly+immunogenic+polypeptide+prothymosin+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly immunogenic polypeptide prothymosin alpha.</a> Peptides. 27 (1), 183-193 (2006).</li>
<li>Redwan, E. M., Aljadawi, A. A., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+protocol+for+immunoglobulin+Y+purification+from+chicken+egg+yolk%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient protocol for immunoglobulin Y purification from chicken egg yolk.</a> Poultry Science. 100 (3), 100956(2021).</li>
<li>Lee, H. Y., Abeyrathne, E. D. N. S., Choi, I., Suh, J. W., Ahn, D. U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+separation+of+immunoglobulin+Y+and+phosvitin+from+chicken+egg+yolk+without+using+organic+solvents%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Sequential separation of immunoglobulin Y and phosvitin from chicken egg yolk without using organic solvents.</a> Poultry Science. 93 (10), 2668-2677 (2014).</li>
<li>Pauly, D., Chacana, P., Calzado, E., Brembs, B., Schade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgY+Technology%3A+Extraction+of+chicken+antibodies+from+egg+yolk+by+polyethylene+glycol+%28PEG%29+precipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">IgY Technology: Extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e3084(2011).</li>
<li>Chang, H. M., Lu, T. C., Chen, C. C., Tu, Y. Y., Hwang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+immunoglobulin+from+egg+yolk+by+anionic+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of immunoglobulin from egg yolk by anionic polysaccharides.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48 (4), 995-999 (2000).</li>
<li>Ko, K. Y., Ahn, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+immunoglobulin+Y+from+egg+yolk+using+ammonium+sulfate+precipitation+and+ion+exchange+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Preparation of immunoglobulin Y from egg yolk using ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography.</a> Poultry Science. 86 (2), 400-407 (2007).</li>
<li>Polson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+IgY+from+the+yolks+of+eggs+by+a+chloroform+polyethylene+glycol+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Communications%22%5BJournal%5D)">Isolation of IgY from the yolks of eggs by a chloroform polyethylene glycol procedure.</a> Immunological Communications. 19 (3), 253-258 (1990).</li>
<li>Simonova, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((xMAP-based+analysis+of+three+most+prevalent+staphylococcal+toxins+in+Staphylococcus+aureus+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">xMAP-based analysis of three most prevalent staphylococcal toxins in Staphylococcus aureus cultures.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (25), 6447-6452 (2014).</li>
<li>Sharma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+assay+for+detection+of+staphylococcal+and+streptococcal+exotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A multiplex assay for detection of staphylococcal and streptococcal exotoxins.</a> PLoS One. 10 (8), e0135986(2015).</li>
<li>Merbah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+a+cytometric+p24-capture+bead-assay+for+the+detection+of+main+HIV-subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Standardization of a cytometric p24-capture bead-assay for the detection of main HIV-subtypes.</a> Journal of Virological Methods. 230, 45-52 (2016).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen potentiële belangenconflicten met betrekking tot het onderzoek, het auteurschap en de publicatie van dit artikel.

De methode van precipitatie van het IgY-antilichaam door pH-verlaging gevolgd door lipidenscheiding met caprylzuur is efficiënt in het isoleren van totale antilichamen zonder enig verlies van functionaliteit. De hier voorgestelde methode is eenvoudiger en goedkoper dan die gerapporteerd door Redwan et al.11, die ook precipitatie door verzuring en caprylzuur gebruikten, maar met een complexer en bewerkelijker protocol. Deze methode biedt ook voordelen ten opzichte van veelgebruikte methoden voor Ig...

Onder de immunoassay-technieken gericht op het diagnosticeren van ziekten, is de cytometrische kralentest naar voren gekomen als een zeer gevoelige en betrouwbare benadering, omdat het de analyse van duizenden deeltjes in een enkele testmogelijk maakt 1. Deze techniek heeft niet alleen een hoge productiviteit en maakt het gebruik van kleinere volumes monsters mogelijk, maar biedt ook een grote flexibiliteit, omdat het de detectie van verschillende moleculen mogelijk maakt, zoals cytokines, adhesiemoleculen, antilichaamisotypen en eiwitten 2,3.
Verschillende deeltjes worden gebruikt voor de ontwikkeling van deze testen, waaronder latexparels, die een effectieve en goedkope input zijn. Deze kunnen veranderingen op hun oppervlak vertonen, zoals de aanwezigheid van functionele groepen of eiwitten die de covalente of niet-covalente koppeling van bepaalde moleculen 3,4,5 mogelijk maken.
Deze immunoassays gebruiken componenten zoals antigenen en antilichamen om de detectie van ziektemarkers uit te voeren en vereisen vaak antilichamen van zoogdieren zoals muizen, konijnen en geiten. Dit creëert problemen met betrekking tot ethische kwesties, omdat de immunisatie van zoogdieren over het algemeen veel dieren vereist om een goede opbrengst te verkrijgen, evenals de frequente uitvoering van procedures die leiden tot het lijden van de dieren 6,7. Een alternatief hiervoor is het gebruik van IgY-antilichamen geïsoleerd uit de eierdooiers van geïmmuniseerde kippen, omdat hoge concentraties van de specifieke antilichamen tegen de geënte antigenen in de dooiers kunnen worden gevonden; De productie van een kip is gelijk aan de productie van 4,3 konijnen in de loop van een jaar 6,7.
Het doel van dit protocol is dus om een methode te bieden voor het evalueren van IgY-antilichamen verkregen uit kippeneidooiers met behulp van flowcytometrie met latexparels. Hiervoor stellen we een standaardisatiemethode voor voor een cytometrische kralenimmunoassay in sandwichformaat met latexparels. Als model gebruikten we IgY-antilichamen gericht op het Plasmodium falciparum histidine-rijk eiwit II-antigeen (IgY-PfHRP2). We beschrijven een methode voor het extraheren van de antilichamen, bespreken de kritische stappen voor het definiëren van de koppelingsconcentratie hiervan aan de latexkorrels en presenteren een evaluatie van de detectiegrens van het antigeen. De hoge nauwkeurigheid van flowcytometrie, in combinatie met de lage kosten van latexparels, maken deze techniek toepasbaar voor de analyse van immunoassay-instrumenten, zoals antilichamen en antigenen. Deze methode kan worden gebruikt voor de detectie van diverse doelen.

<table><tbody><tr><td>Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF&nbsp; 488A antibody produced in donkey</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4600031</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG (H+L), F(ab&prime;)2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4600388</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II</td><td>BD Biosciences</td><td>BF-FACSC2</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva CS&amp;T research beads (CS&amp;T research beads)</td><td>BD Biosciences</td><td>655050</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva software 7.0</td><td>BD Biosciences</td><td>655677</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td><td>Bio-Rad</td><td>#5000006</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Caprylzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3907</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5702 R</td><td>Eppendorf</td><td>Z606936</td><td></td></tr><tr><td>Chloride 37% zuur moleculaire kwaliteit</td><td>NEON</td><td>02618 NEON</td><td></td></tr><tr><td>CML latex, 4% w/v</td><td>Invitrogen</td><td>C37253</td><td></td></tr><tr><td>Megafuge 8R</td><td>Thermo Scientific</td><td>TS-HM8R</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&prime;-ethylcarbodiimide Hydrochloride Poeder (EDC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7750-1G</td><td></td></tr><tr><td>N-Hydroxysuccinimide (NHS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>130672-25G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1003335620</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Acs Cientifica</td><td>P.10.0594.024.00.27</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhypochloriet</td><td>Acs Cientifica</td><td>R09211000</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Mixer Heat/Cool</td><td>KASVI</td><td>K80-120R</td><td></td></tr></tbody></table>

standaardisatie van een cytometrische kralentest op basis van eigeel-antilichamen

Standardization of a Cytometric Bead Assay Based on Egg-Yolk Antibodies

Immunoassays zijn belangrijke tests voor de detectie van talrijke moleculaire doelwitten. Onder de methoden die momenteel beschikbaar zijn, heeft de cytometrische kralentest de afgelopen decennia aan belang gewonnen. Elke microsfeer die door de apparatuur wordt gelezen, vertegenwoordigt een analysegebeurtenis van de interactiecapaciteit tussen de geteste moleculen. Duizenden van deze gebeurtenissen worden in één test gelezen, waardoor een hoge testnauwkeurigheid en reproduceerbaarheid wordt gegarandeerd. Deze methodologie kan ook worden gebruikt bij de validatie van nieuwe inputs, zoals IgY-antilichamen, voor de diagnose van ziekten. Deze antilichamen worden verkregen door kippen te immuniseren met het antigeen van belang en vervolgens het immunoglobuline uit de dooier van de eieren van de dieren te extraheren; Daarom is dit een pijnloze en zeer productieve methode voor het verkrijgen van de antilichamen. Naast een methodologie voor de zeer nauwkeurige validatie van het antilichaamherkenningsvermogen van deze test, presenteert dit artikel ook een methode voor het extraheren van deze antilichamen, het bepalen van de beste koppelingsomstandigheden voor de antilichamen en latexkorrels en het bepalen van de gevoeligheid van de test.

Figuur 2 geeft een grafische weergave van het extractieproces van IgY-antilichamen via verzuring, gevolgd door scheiding met caprylzuur (figuur 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65123/65123fig02.jpg"> Figuur 2: Schematische weergave van de extractiestap van IgY-antilichamen en scheiding met caprylzuur . (<...

Dit protocol beschrijft een methodologie voor de bereiding van latexkorrels voor assays met behulp van IgY-antilichamen voor antigeendetectie.

Standaardisatie van een cytometrische kralentest op basis van eigeel-antilichamen

Immunoassays are important tests for the detection of numerous molecular targets. Among the methods currently available, the cytometric bead assay has ...

Onder de immunoassay-technieken gericht op het diagnosticeren van ziekten, is de cytometrische kralentest naar voren gekomen als een zeer gevoelige en betrouwbare benadering, waarbij duizenden deeltjes in één enkele test worden geanalyseerd. De hoge nauwkeurigheid van flowcytometrie, in combinatie met de lage kosten van latexparels, maken onze techniek toepasbaar voor de analyse van immunoassays-instrumenten, zoals antilichamen en antigenen. IgY-antilichamen hebben lage kosten en de ethische voordelen bij hun productie en kunnen worden gebruikt als een detectie-instrument voor zeldzame ziekten.Begin met het onderdompelen van de vers gelegde of vier dagen oude eieren, van de Gallus gallus deckle witte afstamming, in een 0,2% verdunde oplossing van natriumhypochloriet. Spoel ze snel af onder stromend water en veeg ze voorzichtig af. Breek het ei voorzichtig, scheid de dooier van het wit met behulp van een dooierscheider.En verwijder het overtollige wit met filtreerpapier. Prik de dooier door en verzamel de binnenkant in een conische buis van 50 milliliter. Bewaar de dooier bij min 20 graden Celsius gedurende ten minste 24 uur voor gebruik.Na het ontdooien van de opgeslagen dooier, verdun het in een verhouding van één tot 10 in één millimolaire PBS. Stel de pH van de oplossing in op vijf, met één normaal zoutzuur, en incubeer de oplossing bij vier graden Celsius gedurende zes tot 24 uur. Centrifugeer de oplossing gedurende 40 minuten op 3000 G en filter het teruggewonnen supernatant met behulp van een cellulosefilter van 0,7 millimeter, voordat u de pH van het supernatant op vijf zet.Voeg caprylzuur toe tot een eindconcentratie van 8,7% onder constant roeren, gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Nadat u de monsters gedurende 15 minuten hebt gecentrifugeerd, scheidt u het supernatant van het neergeslagen materiaal. Stel de pH van de oplossing opnieuw in op 7,4 met behulp van één molair natriumhydroxide.En kwantificeer de antilichamen met behulp van de Bradford-test, voordat ze worden opgeslagen bij min 20 graden Celsius. Voeg 21 microliter EDC en 21 microliter NHS toe aan 21 microliter latexkralen. En pas aan tot een eindvolume van 2,1 milliliter, met gefilterde 10 millimolaire PBS.Incubeer de oplossing bij 22 graden Celsius, met snel schudden, gedurende drie uur. Voeg het eerder geëxtraheerde afvangantilichaam, IgY PfHRP2, toe aan verschillende microbuisjes die 100 microliter van deze oplossing bevatten. En opnieuw incuberen gedurende 16 uur.Na het centrifugeren van de monsters en het weggooien van de supernatanten, was de latexparels tweemaal met 500 microliter gefilterde 10 millimolaire PBS, met behulp van centrifugatie- en resuspensiecycli. Voor het blokkeren van de kralen, resuspensie de monsters in een milliliter blokkeringsbuffer en volg dezelfde procedure die eerder is getoond om het gedurende twee uur te incuberen. Na het wassen van de kralen met PBS, resuspensie ze opnieuw in 10 millimolar PBS buffer.Voeg 100 microliter fluorescerend anti-kippenantilichaam, verdund tot één tot 2000 in 10 millimolair mengsel van PBS en BSA, toe aan elke microbuis. Incubeer de monsters in het donker gedurende 30 minuten. Na het wassen van de kralen, resuspensie ze opnieuw met 250 microliter gefilterde 10 millimolar PBS.Bepaal de detectiegrens door 100 microliter van het geblokkeerde kralenpreparaat te verdelen in buizen met verschillende hoeveelheden van het verdunde recombinante eiwit PfHRP2 in drievoud. Incubeer de kraaloplossingen met het eiwit bij 22 graden Celsius, met snel schudden, gedurende een uur. Was de kralen met 500 microliter gefilterde 10 millimolaire PBS, met centrifugatie, zoals eerder aangetoond.Voeg na het weggooien van het supernatant twee microgram muis IgG-antilichaam tegen het recombinante eiwit, verdund in 10 millimolaire PBS en BSA toe aan elk monster en volg dezelfde procedure voor incubatie. Voeg vervolgens 100 microliter van het verdunde fluorescerende antimuisantilichaam toe aan elk monster. Na incubatie resuspendeerde u het monster in 250 microliter gefilterde 10 millimolaire PBS.Schakel de computer en de flowcytometer in en wacht een paar minuten totdat de apparatuur op de computer is aangesloten. Klik op de cytometriesoftware die op de computer is geïnstalleerd en log in. Selecteer in de softwarewerkruimte Cytometer, Gevolgd door Fluidics Startup, Cleaning Modes en SIT Flush.Definieer de gatingstrategie op basis van de morfometrische en fluorescentiekenmerken van het negatieve controledeeltje. Om de celmorfometrie te bepalen, kiest u een stippenplotdiagram voor de analyse van voorwaartse verstrooiing A-parameters met behulp van zijverstrooiing A. Bepaal de afzonderlijke cellen per zijverstrooiing met behulp van de stippenplotgrafiek voor de analyse van zijverstrooiing W in de Y-as en zijverstrooiing H in de X-as. En bepaal de afzonderlijke cellen door voorwaartse verstrooiing, met behulp van dot plot plot graphic, voor de analyse van voorwaartse verstrooiing W in de Y-as, en voorwaartse spreiding H in de X-as.Kies voor de fluorescentieanalyse FL1 dot plot plots met behulp van forward scatter A.Gebruik een stoppered polystyreenbuis met niet-gelabelde monsters en monsters die eerder zijn gelabeld met alexa fluor 488 van één kleur en meng voorzichtig de inhoud van de buis. Bevestig de buis aan de flowcytometersonde en klik met de linkermuisknop op Verwerven. Om het vermogen van de lasers in te stellen, klikt u op Parameters en past u in de onderstaande opties de spanning van de voorwaartse verstrooiing aan op 182 volt en de spanning van de zijverstrooiing op 236 volt.Om de drempel op cytometer in te stellen, klikt u op Drempel en in de onderstaande opties stelt u de FSC in op 500 volt. Stel de analysepoort in om deeltjes te karakteriseren op grootte en complexiteit, en om eencellige analyse uit te voeren. Verwijder autofluorescentie door het kleurstofvrije monster te analyseren dat alleen de latexparels bevat en de spanning van de detector FL1 FITC aan te passen aan 332 volt.Stel de fluorescentieanalysepoort in vierhoekig formaat in, vanaf het negatieve punt dat wordt weergegeven in de grafiek van de puntplot. Nadat de morfometrische en fluorescerende analyses zijn aangepast, configureert u het apparaat voor 50.000 gebeurtenissen en klikt u op Opnemen. De elektroforetische profielen van het IgY PfHRP2-antilichaam, als gevolg van de scheiding met caprylzuur, worden hier weergegeven.Uit deze figuur is te zien dat de antilichamen voor en na de caprylzuurscheiding vergelijkbare elektroforetische profielen vertoonden, met karakteristieke banden van 65 kilodalton en 27 kilodalton, die verwijzen naar de lichte en zware ketens van de IgY. Daarnaast zijn ook andere banden zichtbaar, waarschijnlijk als gevolg van de C-terminale fragment eigeeleiwit vitellogenine II voorloper. Het beoordelen van de verzadigingsconcentratie van antilichamen op latexparels is van vitaal belang voor het ontwikkelen van een immunoassay met de kralen.Een curve van het percentage fluorescentie van verschillende concentraties antilichamen, gekoppeld aan elke microliter commerciële latexkralen die wordt gebruikt, wordt hier weergegeven. Naarmate de concentratie toenam, namen de procentuele waarden ook toe en plateauden ze op twee microgram antilichaamconcentratie, waardoor deze de optimale koppelingsconcentratie voor de doelantigeenimmunoassay werd. De detectiegrens werd bepaald door het fluorescentiepercentage van latexsnelheidsreactiviteit te beoordelen tegen variërende rPfHRP2-eiwitconcentraties.Uit een sandwich-immunoassay werd waargenomen dat de fluorescentie verhoogd was van 0,01 microgram PfHRP2-eiwit en plateaude op 0,1 microgram. Er was geen significant verschil in fluorescentie bij nul microgram en 0,01 microgram. Er werd echter een significant verschil in fluorescentie waargenomen bij 0,01 microgram, 0,1 microgram en 10 microgram.De wasstap van dit protocol is van cruciaal belang om het verlies van kralen te voorkomen. De meter moet goed gedefinieerd zijn, zodat er geen fouten in het verkregen resultaat zitten. De hier beschreven stappen vertegenwoordigen een belangrijke standaardisatie, die nodig is om de betrouwbaarheid van de diagnostische tests met latexparels die via volledige cytometrie worden geëvalueerd, te waarborgen.Daarom is deze methodologie een alternatief voor de klassieke sandwichtestmodellen. Deze methode kan worden toegepast op verschillende soorten testen en kan geschikt zijn voor het omgaan met verschillende moleculen aan het oppervlak van de kralen, evenals voor de detectie van verschillende analyten.

standardization-cytometric-bead-assay-based-on-egg-yolk

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Ontwikkeling van op maat assays op de ViBE platform voor meer gevoelige, reproduceerbare, geautomatiseerd resulteert in complexe matrices beschreven. De universele patroon laat testen eenvoudig worden aangepast voor gebruik met aangepaste assays. Deze veelzijdigheid maakt snelle ontwikkeling en validatie van nieuwe testen of geautomatiseerde versies van bestaande manuele testen, geïllustreerd in deze video.

Het ontwikkelen van aangepaste Chinese hamster ovarium-host Cell Protein Testen met behulp van akoestisch vlies micropartikel Technology

In dit rapport tonen we de kleuring en analyse stappen van een fenotypering test uitgevoerd op vers volbloed aan grote aangeboren en adaptieve leukocyten populaties te sommen. Wij benadrukken overwegingen voor het uitvoeren van deze procedures in het kader van een multicenter klinische studie.

Opsomming van belangrijke perifeer bloed leukocyten populaties voor Multicenter klinische proeven met behulp van een volbloed Fenotypering Assay

This video describes an immunoassay technique using fluorescent magnetic beads or microspheres coupled with different antigens to simultaneously detect various antibody isotypes in a serum sample. The assay is helpful in understanding seroconversion during an infection or post-vaccination.

Multianalyte Immunobead Assay: A Flow-Based Immunoassay Technique for Concurrent Detection of Multiple Antibody Subtypes in Human Serum Sample

This video illustrates the reconstitution of synthetic antigen-presenting cells through Bead-Supported Lipid Bilayers and their application in assessing the synaptic output generated by activated T cells.

Utilizing Bead-Supported Lipid Bilayers to Investigate the Synaptic Output from T Cells

Immature dendritische cellen kunnen selectief worden gedifferentieerd in tolerogeen of rijpe dendritische cellen om het evenwicht tussen immuniteit en tolerantie te reguleren. Dit werk presenteert een manier om vanuit onrijpe, uit monocyten afgeleide dendritische cellen (moDC's) in vitro tolerogeen en rijpe moDC's te genereren die verschillen in metabolische fenotypen.

Generatie van onrijpe, Ouder en tolerogene dendritische cellen met verschillende Metabolic Phenotypes

Hier presenteren we een stroom cytometrische protocol ter identificatie van CD4+ en CD8+ T cellen en γδ T cellen, B-cellen, NK-cellen, monocyten in perifere bloed met behulp van slechts twee fluorochromes in plaats van zeven. Met deze aanpak, kunnen vijf extra markeringen op de meeste flow cytometers worden opgeslagen.

Discriminatie van zeven immuun cel deelverzamelingen door twee-fluorescerende Stroom Cytometry

Het doel van deze methode is om de CR1-dichtheid in de erytrocyten van elk onderwerp te bepalen door te vergelijken met drie proefpersonen waarvan de erytrocyten CR1-dichtheid bekend is. De methode maakt gebruik van flow cytometrie na immunostaining van de erytrocyten van de proefpersonen door een anti-CR1 monoklonale antilichaam gekoppeld aan een versterkt systeem met behulp van fycoerythrin (PE).

Het meten van Erythroocyte Complement Receptor 1 met behulp van Flow Cytometrie

We beschrijven hierin een eenvoudige analyse van de heterogeniteit van het muriene immuun B-celcompartiment in het peritoneum, milt en beenmergweefsel door middel van flowcytometrie. Het protocol kan worden aangepast en uitgebreid naar andere muizenweefsels.

Flowcytometrische karakterisering van de ontwikkeling van murine B-cellen

In deze studie werd een methode ontwikkeld om de overdracht van experimentele instellingen en analysesjablonen tussen twee flowcytometers in twee laboratoria voor de detectie van lymfocyten bij Japanse encefalitis-gevaccineerde kinderen te vergemakkelijken. De standaardisatiemethode voor de flowcytometerexperimenten zal het mogelijk maken om onderzoeksprojecten effectief uit te voeren in meerdere centra.

Standaardisatie van overdracht tussen laboratoria tussen flowcytometers voor detectie van lymfocyten bij Japanse encefalitis gevaccineerde kinderen

We beschrijven een op fluorescentie gebaseerde assay om fosfolipide-scrambling in grote unilamellaire liposomen gereconstitueerd met opsine te meten.

Een fluorescentie-gebaseerde test fosfolipide scramblase Activity

Leer de standaardisatie van een cytometrische kralentest met IgY-antilichamen uit eigeel voor gevoelige antigeendetectie. Deze methode biedt een betrouwbaar en kosteneffectief alternatief voor immunoassays.

Standaardisatie van een cytometrische kralentest op basis van eigeel-antilichamen

Meer video's verkennen