Standaardisatie van een cytometrische kralentest op basis van eigeel-antilichamen

Onder de immunoassay-technieken gericht op het diagnosticeren van ziekten, is de cytometrische kralentest naar voren gekomen als een zeer gevoelige en betrouwbare benadering, waarbij duizenden deeltjes in één enkele test worden geanalyseerd. De hoge nauwkeurigheid van flowcytometrie, in combinatie met de lage kosten van latexparels, maken onze techniek toepasbaar voor de analyse van immunoassays-instrumenten, zoals antilichamen en antigenen. IgY-antilichamen hebben lage kosten en de ethische voordelen bij hun productie en kunnen worden gebruikt als een detectie-instrument voor zeldzame ziekten.

Begin met het onderdompelen van de vers gelegde of vier dagen oude eieren, van de Gallus gallus deckle witte afstamming, in een 0,2% verdunde oplossing van natriumhypochloriet. Spoel ze snel af onder stromend water en veeg ze voorzichtig af. Breek het ei voorzichtig, scheid de dooier van het wit met behulp van een dooierscheider.

En verwijder het overtollige wit met filtreerpapier. Prik de dooier door en verzamel de binnenkant in een conische buis van 50 milliliter. Bewaar de dooier bij min 20 graden Celsius gedurende ten minste 24 uur voor gebruik.

Na het ontdooien van de opgeslagen dooier, verdun het in een verhouding van één tot 10 in één millimolaire PBS. Stel de pH van de oplossing in op vijf, met één normaal zoutzuur, en incubeer de oplossing bij vier graden Celsius gedurende zes tot 24 uur. Centrifugeer de oplossing gedurende 40 minuten op 3000 G en filter het teruggewonnen supernatant met behulp van een cellulosefilter van 0,7 millimeter, voordat u de pH van het supernatant op vijf zet.

Voeg caprylzuur toe tot een eindconcentratie van 8,7% onder constant roeren, gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Nadat u de monsters gedurende 15 minuten hebt gecentrifugeerd, scheidt u het supernatant van het neergeslagen materiaal. Stel de pH van de oplossing opnieuw in op 7,4 met behulp van één molair natriumhydroxide.

En kwantificeer de antilichamen met behulp van de Bradford-test, voordat ze worden opgeslagen bij min 20 graden Celsius. Voeg 21 microliter EDC en 21 microliter NHS toe aan 21 microliter latexkralen. En pas aan tot een eindvolume van 2,1 milliliter, met gefilterde 10 millimolaire PBS.

Incubeer de oplossing bij 22 graden Celsius, met snel schudden, gedurende drie uur. Voeg het eerder geëxtraheerde afvangantilichaam, IgY PfHRP2, toe aan verschillende microbuisjes die 100 microliter van deze oplossing bevatten. En opnieuw incuberen gedurende 16 uur.

Na het centrifugeren van de monsters en het weggooien van de supernatanten, was de latexparels tweemaal met 500 microliter gefilterde 10 millimolaire PBS, met behulp van centrifugatie- en resuspensiecycli. Voor het blokkeren van de kralen, resuspensie de monsters in een milliliter blokkeringsbuffer en volg dezelfde procedure die eerder is getoond om het gedurende twee uur te incuberen. Na het wassen van de kralen met PBS, resuspensie ze opnieuw in 10 millimolar PBS buffer.

Voeg 100 microliter fluorescerend anti-kippenantilichaam, verdund tot één tot 2000 in 10 millimolair mengsel van PBS en BSA, toe aan elke microbuis. Incubeer de monsters in het donker gedurende 30 minuten. Na het wassen van de kralen, resuspensie ze opnieuw met 250 microliter gefilterde 10 millimolar PBS.

Bepaal de detectiegrens door 100 microliter van het geblokkeerde kralenpreparaat te verdelen in buizen met verschillende hoeveelheden van het verdunde recombinante eiwit PfHRP2 in drievoud. Incubeer de kraaloplossingen met het eiwit bij 22 graden Celsius, met snel schudden, gedurende een uur. Was de kralen met 500 microliter gefilterde 10 millimolaire PBS, met centrifugatie, zoals eerder aangetoond.

Voeg na het weggooien van het supernatant twee microgram muis IgG-antilichaam tegen het recombinante eiwit, verdund in 10 millimolaire PBS en BSA toe aan elk monster en volg dezelfde procedure voor incubatie. Voeg vervolgens 100 microliter van het verdunde fluorescerende antimuisantilichaam toe aan elk monster. Na incubatie resuspendeerde u het monster in 250 microliter gefilterde 10 millimolaire PBS.

Schakel de computer en de flowcytometer in en wacht een paar minuten totdat de apparatuur op de computer is aangesloten. Klik op de cytometriesoftware die op de computer is geïnstalleerd en log in. Selecteer in de softwarewerkruimte Cytometer, Gevolgd door Fluidics Startup, Cleaning Modes en SIT Flush.

Definieer de gatingstrategie op basis van de morfometrische en fluorescentiekenmerken van het negatieve controledeeltje. Om de celmorfometrie te bepalen, kiest u een stippenplotdiagram voor de analyse van voorwaartse verstrooiing A-parameters met behulp van zijverstrooiing A. Bepaal de afzonderlijke cellen per zijverstrooiing met behulp van de stippenplotgrafiek voor de analyse van zijverstrooiing W in de Y-as en zijverstrooiing H in de X-as. En bepaal de afzonderlijke cellen door voorwaartse verstrooiing, met behulp van dot plot plot graphic, voor de analyse van voorwaartse verstrooiing W in de Y-as, en voorwaartse spreiding H in de X-as.

Kies voor de fluorescentieanalyse FL1 dot plot plots met behulp van forward scatter A.Gebruik een stoppered polystyreenbuis met niet-gelabelde monsters en monsters die eerder zijn gelabeld met alexa fluor 488 van één kleur en meng voorzichtig de inhoud van de buis. Bevestig de buis aan de flowcytometersonde en klik met de linkermuisknop op Verwerven. Om het vermogen van de lasers in te stellen, klikt u op Parameters en past u in de onderstaande opties de spanning van de voorwaartse verstrooiing aan op 182 volt en de spanning van de zijverstrooiing op 236 volt.

Om de drempel op cytometer in te stellen, klikt u op Drempel en in de onderstaande opties stelt u de FSC in op 500 volt. Stel de analysepoort in om deeltjes te karakteriseren op grootte en complexiteit, en om eencellige analyse uit te voeren. Verwijder autofluorescentie door het kleurstofvrije monster te analyseren dat alleen de latexparels bevat en de spanning van de detector FL1 FITC aan te passen aan 332 volt.

Stel de fluorescentieanalysepoort in vierhoekig formaat in, vanaf het negatieve punt dat wordt weergegeven in de grafiek van de puntplot. Nadat de morfometrische en fluorescerende analyses zijn aangepast, configureert u het apparaat voor 50.000 gebeurtenissen en klikt u op Opnemen. De elektroforetische profielen van het IgY PfHRP2-antilichaam, als gevolg van de scheiding met caprylzuur, worden hier weergegeven.

Uit deze figuur is te zien dat de antilichamen voor en na de caprylzuurscheiding vergelijkbare elektroforetische profielen vertoonden, met karakteristieke banden van 65 kilodalton en 27 kilodalton, die verwijzen naar de lichte en zware ketens van de IgY. Daarnaast zijn ook andere banden zichtbaar, waarschijnlijk als gevolg van de C-terminale fragment eigeeleiwit vitellogenine II voorloper. Het beoordelen van de verzadigingsconcentratie van antilichamen op latexparels is van vitaal belang voor het ontwikkelen van een immunoassay met de kralen.

Een curve van het percentage fluorescentie van verschillende concentraties antilichamen, gekoppeld aan elke microliter commerciële latexkralen die wordt gebruikt, wordt hier weergegeven. Naarmate de concentratie toenam, namen de procentuele waarden ook toe en plateauden ze op twee microgram antilichaamconcentratie, waardoor deze de optimale koppelingsconcentratie voor de doelantigeenimmunoassay werd. De detectiegrens werd bepaald door het fluorescentiepercentage van latexsnelheidsreactiviteit te beoordelen tegen variërende rPfHRP2-eiwitconcentraties.

Uit een sandwich-immunoassay werd waargenomen dat de fluorescentie verhoogd was van 0,01 microgram PfHRP2-eiwit en plateaude op 0,1 microgram. Er was geen significant verschil in fluorescentie bij nul microgram en 0,01 microgram. Er werd echter een significant verschil in fluorescentie waargenomen bij 0,01 microgram, 0,1 microgram en 10 microgram.

De wasstap van dit protocol is van cruciaal belang om het verlies van kralen te voorkomen. De meter moet goed gedefinieerd zijn, zodat er geen fouten in het verkregen resultaat zitten. De hier beschreven stappen vertegenwoordigen een belangrijke standaardisatie, die nodig is om de betrouwbaarheid van de diagnostische tests met latexparels die via volledige cytometrie worden geëvalueerd, te waarborgen.

Daarom is deze methodologie een alternatief voor de klassieke sandwichtestmodellen. Deze methode kan worden toegepast op verschillende soorten testen en kan geschikt zijn voor het omgaan met verschillende moleculen aan het oppervlak van de kralen, evenals voor de detectie van verschillende analyten.