Name: Generatie van 3D-tumorsferoïden voor geneesmiddelenevaluatiestudies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Leer een gestandaardiseerde methode voor het genereren van 3D-tumorsferoïden met high-throughput beeldvorming en deep-learning analyse. Deze aanpak verbetert de nauwkeurigheid van geneesmiddelentests aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken alle leden van onze laboratoria voor hun kritische inbreng en suggesties. Dit onderzoek werd ondersteund door het Key Project van Jiangsu Commission of Health (K2019030). Conceptualisatie werd uitgevoerd door C.W. en Z.C., de methodologie werd uitgevoerd door W.H. en M.L., het onderzoek werd uitgevoerd door W.H. en M.L., de datacuratie werd uitgevoerd door W.H., Z.Z., S.X., en M.L., de oorspronkelijke conceptvoorbereiding werd uitgevoerd door Z.Z., J.Z., S.X., W.H., en X.L., de beoordeling en bewerking werd uitgevoerd door Z.C., de projectadministratie werd uitgevoerd door C.W. en Z.C., en de financieringsacquisitie werd uitgevoerd door C.W. Alle auteurs hebben de gepubliceerde versie van het manuscript gelezen en ermee ingestemd.

1. Sferoïde constructie
<ol><li>Anti-hechtingsbehandeling van de kweekplaat<ol><li>Pipetteer 100 μL anti-adhesiereagens in elke put van een 48-putplaat met een U-vormige putbodem en bewaar gedurende 10 minuten. Zuig na 10 minuten het coatingreagens op en was tweemaal met gesteriliseerde PBS.</li>
		<li>Plaats de kweekplaat in een incubator (37 °C in bevochtigde lucht met 5% CO2) tot gebruik.</li>
	</ol></li>
	<li>Celvoorbereiding, verzameling en tellen<ol><li>Gebruik het kweekmedium dat specifiek is voor de cellen om de cellen in celkweekkolven te kweken (aanvullende tabel 2). NCI-H23- en CT-26-cellen worden bijvoorbeeld gekweekt in RPMI 1640 en HT-29-cellen worden gekweekt in McCoy's 5A-medium. Deze twee media worden aangevuld met respectievelijk 10% warmte-geïnactiveerde FBS en 1% P/S.</li>
		<li>Houd alle cellen in standaard kweekomstandigheden (37 °C in bevochtigde lucht met 5% CO2) tijdens proliferatie. Hier wordt de NCI-H23-cellijn als voorbeeld gebruikt in de volgende stappen.</li>
		<li>Was cellen gekweekt in een T25-kolf tweemaal met 1x PBS om het kweekmedium te verwijderen (het is beter om cellen in de logaritmische fase te kiezen en de cellen te passeren met een samenvloeiing van 80% -90%).</li>
		<li>Behandel de geëxpandeerde cellen met 1 ml 0,25% trypsine/EDTA gedurende 1- 2 minuten in een couveuse bij 37 °C, 5% CO2. Bevestig de celvorm (normaal gesproken cirkelvormig in dit geval) onder de microscoop en stop vervolgens de trypsinebehandeling. Zuig hiervoor de gebruikte trypsine/EDTA-suspensie op in de T25-kolf en was de cellen met 4 ml vers medium.</li>
		<li>Breng alle suspensie (5 ml) over in een buis van 15 ml. Gebruik 1 ml vers medium om de resterende cellen af te spoelen en voeg het toe aan de buis. Centrifugeer de cellen op 186,48 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Verwijder het supernatant en voeg 10 ml vers medium toe aan de celpellet, gevolgd door voorzichtig pipetteren totdat de cellen zich in een homogene suspensie bevinden.</li>
		<li>Zuig 0,1 ml celsuspensie op in een nieuwe centrifugebuis, voeg 0,9 ml vers medium toe en pipetteer de suspensie goed.</li>
		<li>Extract 10 μL van de celsuspensie voor celtelling. Voer dit proces twee of drie keer uit en neem een gemiddelde waarde.</li>
		<li>Verdun de suspensie tot een uiteindelijke zaaidichtheid van 50.000 cellen/ml, afhankelijk van de concentratie verkregen uit het celtellingsproces in stap 1.2.7.</li>
	</ol></li>
	<li>Celkweek en sferoïdevorming<ol><li>Voeg 200 μL van de celsuspensie toe aan elke put van een U-bodemplaat met 48 putten.</li>
		<li>Wikkel de afdichtingsfolie om de plaat en centrifugeer deze op 119,35 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Haal de plaat voorzichtig uit de centrifuge en trek de beschermfolie eraf. Voeg vervolgens 5-8 ml gesteriliseerd water toe aan het waterkanaal rond de putten (om verdamping te voorkomen) en incubeer gedurende 5 dagen bij 37 °C. Ververs/vul gedurende de periode geen water aan het waterkanaal.</li>
		<li>Observeer de celaggregatie gedurende de volgende 5 dagen. OPMERKING: Over het algemeen beginnen de cellen binnen 5 dagen als kolonies samen te klonteren. Het proces van sferoïde constructie kan echter sneller of langzamer zijn met verschillende celtypen en celdichtheden. Hierdoor moeten de cellen elke dag worden geobserveerd met behulp van een van de drie mogelijke methoden. Ten eerste kunnen de cellen worden waargenomen via de bodem van de putplaat. Wanneer de cellen nog geen sferoïde hebben gevormd, is onderaan een enkele laag cellen te zien. Wanneer de cellen een sferoïde vormen, kan een dicht 3D-construct worden waargenomen op de U-bodem van elke put. Een andere methode is het controleren van de cellen onder een microscoop. Wanneer de cellen een tumorsferoïde worden, omvat de constructie drie lagen (een prolifererende laag, een inactieve laag en een necrotische kern, van de buitenkant naar de binnenkant van de sferoïde), die een transparantiegradiënt hebben. Ten slotte kan de kleur van het kweekmedium ook worden gebruikt voor observatiedoeleinden. Dit kan handig zijn wanneer de drielaagse structuur niet duidelijk kan worden gezien, zelfs niet met behulp van een digitale microscoop. Wanneer het medium van paarsrood naar geel verandert, kan het proces van het inbedden van de sferoïden in de gel beginnen. Het medium mag niet worden vervangen tijdens de celaggregatieperiode.</li>
	</ol></li>
	<li>Gel inbedding OPMERKING: De gels moeten worden bewaard bij een temperatuur onder −20 °C. In het bijzonder moeten gels ver weg van de koelkastdeur worden geplaatst om temperatuurschommelingen te voorkomen. Merk op dat de gels zich in dit stadium van het proces in een bevroren toestand bevinden.<ol><li>Neem de bevroren gel uit de koelkast van −20 °C en leg deze tijdens het experiment de hele tijd op een ijskast.</li>
		<li>Observeer de celsferoïden onder de microscoop. Voordat de gelinbedding begint, moet de status van de sferoïden opnieuw worden gecontroleerd met een digitale microscoop.</li>
		<li>Verwijder voorzichtig 150 μL van het medium. De plaat moet ook op de ijskast worden geplaatst.</li>
		<li>Sluit elke sferoïde in de gel in door de vloeibare gel langzaam vanaf de wandzijde van de put toe te voegen terwijl de voorgekoelde pipetpunt rond en in de put wordt verplaatst. Wacht 5 minuten en als de gel zich niet gelijkmatig verspreidt, pipetteer de gel dan voorzichtig met een pipetpunt van 10 μL. Elk putje bevat een tumorsferoïde, 25 μL 3,5 mg/ml gel en 50 μL compleet kweekmedium. Voeg ook 75 μL medium toe aan de bedieningselementen. OPMERKING: Elke put bevat één sferoïde.</li>
		<li>Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 30 minuten totdat de hydrogelatie volledig is voltooid. Bevestig de gelatatiestatus onder de microscoop.</li>
		<li>Bedek 125 μL van het verse medium op elk monster.</li>
		<li>Kweek de sferoïden nog eens 7-10 dagen. Bereid groepen sferoïden voor met elk vier tot zes putten en kies er ten minste drie voor analyse. OPMERKING: Als u een drugstest uitvoert, bereid dan twee groepen voor op één monster. De ene groep wordt gebruikt voor het testen van de levensvatbaarheid, terwijl de andere wordt gebruikt voor het vastleggen en analyseren van afbeeldingen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Medicamenteuze behandeling
<ol><li>Los het medicijn op volgens de instructies van de fabrikant. Bereid 100x werkende oplossingen voor met DMSO. Bereid ten minste vijf doses van het geneesmiddel in seriële verdunning. Hier wordt het longkanker therapeutisch medicijn, AMG 510, als voorbeeld gebruikt. De samenstelling is weergegeven in aanvullende tabel 1.</li>
	<li>Gebruik 0,1% DMSO als positieve controle.</li>
	<li>Voeg 125 μL met geneesmiddelen behandeld medium toe aan elke put en plaats de plaat terug in de couveuse (37 °C in bevochtigde lucht met 5% CO2). In dit stadium bevat elke put een tumorsferoïde, 25 μL van 3,5 mg / ml gel en 175 μL van het medium. De bedieningselementen bevatten 200 μL van het medium.</li>
</ol>3. Levensvatbaarheid van sferoïde
<ol><li>Meet de levensvatbaarheid van de sferoïde met behulp van een Alamar Blue-testkit volgens de richtlijnen van de fabrikant. Meet de levensvatbaarheid met behulp van een microplaatfotometer (absorptie bij 570 nm en 600 nm) nadat de behandeling met Alamar Blue is uitgevoerd.</li>
	<li>Meet de levensvatbaarheid op dag 1, dag 4, dag 7 en dag 10 na het insluiten van de sferoïden in de gel, respectievelijk, of zoals aangegeven. OPMERKING: Bij gebruik van een Alamar Blue-test is ten minste 16 uur reactietijd vereist. Voeg daarom 20 μL Alamar Blue toe in de middagen van dag 0, dag 3, dag 6 en dag 9.</li>
	<li>Zuig 100 μL van het bovennatuurlijke medium uit elke put naar een nieuwe testplaat en voeg 80 μL vers medium toe aan elke put van de kweekplaat. Vervang vervolgens nog eens 100 μL van het met geneesmiddelen behandelde medium. Zorg ervoor dat er geen overblijfselen van Alamar Blue in de put zitten. OPMERKING: Mediumvervanging wordt uitgevoerd bij elke gelegenheid dat de levensvatbaarheid wordt getest en het met geneesmiddelen behandelde medium van de beeldvormingsanalysegroepen moet op dezelfde dag worden vervangen.</li>
</ol>4. Sferoïde observatie en deep learning analyse door middel van beelden in de drugstest
<ol><li>Beeldvorming<ol><li>Zuig 100 μL van het medium uit voor de beeldvorming.</li>
		<li>Plaats de plaat op het podium. Verkrijg digitale beelden van de sferoïden met behulp van een geautomatiseerde microscoop met een 10x objectief (2x objectief eerst). De microscoop kan deze sferoïden automatisch scherpstellen en centraliseren. OPMERKING: De autofocusfunctie en het gebruikte algoritme zijn eerder gerapporteerd door Yazdanfar et al.17.</li>
		<li>Wacht op de automatische beeldvorming. Voor elke sferoïde worden vier beelden verkregen. Een geïntegreerd beeld wordt gevormd en verwerkt met de software die is aangesloten op het high-content imaging systeem.</li>
		<li>Klik op de knop "Image patch process" en kies de geïntegreerde afbeeldingen in de software.</li>
		<li>Kies "U-NET model" en typ de conversieratio in (10x objectieve afbeeldingen hebben een conversieratio van 3.966). Klik onderaan het onderstaande scherm om de beeldverwerking te starten. Sla vervolgens de diameter-, omtrek- en ruwheidsgegevens op in spreadsheetsoftware.</li>
		<li>Bereken de excess perimeter index (EPI). De EPI is de verhouding tussen de sferoïde omtrek (P 0) en de equivalente omtrek (Pe), zoals berekend door Eq. 1. Meet het gebied van de sferoïde in het brandpuntsvlak (S) met behulp van afbeelding J. Bereken vervolgens de equivalente omtrek van de sferoïde met behulp van Eq. 2. EPI = (P o− P e)/Pe (Eq. 1) <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65125/65125eq01.jpg" style="margin: auto;">(Eq. 2) OPMERKING: De sferoïde perimeter wordt gegenereerd door de software met deep-learning algoritmen op basis van het ontwikkelde U-NET model.</li>
		<li>Voeg 100 μL vers medium toe aan het medicijn en plaats de plaat terug in de couveuse (37 °C in bevochtigde lucht met 5% CO2).</li>
	</ol></li>
	<li>Sferoïde remming<ol><li>Bereken de tumorgroeiremming (TGI) met behulp van Eq. 3. Het relatieve sferoïde volume (RTV) is het eindvolume over het oorspronkelijke volume (Eq. 4). Het sferoïde volume (V) wordt automatisch berekend door de software met behulp van Eq. 5 volgens de sferoïde diameter output. TGI = (RTV-controle− RTV-behandeling)/RTV-regeling × 100% (Eq. 3) RTV =V-aansluiting/V-origineel (Eq. 4) V = 4/3π(d/2)3 (Eq. 5) OPMERKING: De TGI wordt verkregen met betrekking tot in vivo groeiremming en de tumorgewichten worden vervangen door RTV. RTV-controle is het relatieve sferoïde volume van de controlegroep, RTV-behandeling is het relatieve sferoïde volume van de geteste groep met geneesmiddelen,V-terminal is het volume van de sferoïde op de laatste dag,V-origineel is het volume van de sferoïde op de eerste kweekdag en d vertegenwoordigt de sferoïde diameter.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Carioli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((European+cancer+mortality+predictions+for+the+year+2021+with+focus+on+pancreatic+and+female+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">European cancer mortality predictions for the year 2021 with focus on pancreatic and female lung cancer.</a> Annals of Oncology. 32 (4), 478-487 (2021).</li>
<li>Katti, A., Diaz, B. J., Caragine, C. M., Sanjana, N. E., Dow, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+in+cancer+biology+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">CRISPR in cancer biology and therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 22 (5), 259-279 (2022).</li>
<li>Abrantes, R., Duarte, H. O., Gomes, C., Walchili, S., Reis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-Ts%3A+New+perspectives+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letter%22%5BJournal%5D)">CAR-Ts: New perspectives in cancer therapy.</a> FEBS Letter. 596 (4), 403-416 (2022).</li>
<li>Shokooohi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+targeted+therapy+and+immunotherapy+on+advanced+nonsmall-cell+lung+cancer+outcomes+in+the+real+world%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effect of targeted therapy and immunotherapy on advanced nonsmall-cell lung cancer outcomes in the real world.</a> Cancer Medicine. 11 (1), 86-93 (2022).</li>
<li>Chen, K., Zhang, Y., Qian, L., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+strategies+to+target+RAS+signaling+in+human+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">Emerging strategies to target RAS signaling in human cancer therapy.</a> Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 116(2021).</li>
<li>Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroids+as+in+vitro+preclinical+models+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research.</a> Pharmaceutics. 12 (12), 1186(2020).</li>
<li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33(2020).</li>
<li>Qin, Y., Hu, X., Fan, W., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stretchable+scaffold+with+electrochemical+sensing+for+3D+culture%2C+mechanical+loading%2C+and+real-time+monitoring+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">A stretchable scaffold with electrochemical sensing for 3D culture, mechanical loading, and real-time monitoring of cells.</a> Advanced Science. 8 (13), 2003738(2021).</li>
<li>Wartenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+multidrug+resistance+transporter+P-glycoprotein+in+multicellular+tumor+spheroids+by+hypoxia-inducible+factor+%28HIF-1%29+ad+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor (HIF-1) ad reactive oxygen species.</a> FASEB Journal. 17 (3), 503-505 (2003).</li>
<li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+penetration+in+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drug penetration in solid tumours.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (8), 583-592 (2006).</li>
<li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+the+third+dimension%3A+How+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Deconstructing the third dimension: How 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li>
<li>Brüningk, S. C., Rivens, I., Box, C., Oelfke, U., Ter Haar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tumour+spheroids+for+the+prediction+of+the+effects+of+radiation+and+hyperthermia+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D tumour spheroids for the prediction of the effects of radiation and hyperthermia treatments.</a> Scientific Reports. 10, 1653(2020).</li>
<li>Graves, E. E., Maity, A., Thu Le, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+microenvironment+in+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">The tumor microenvironment in non-small-cell lung cancer.</a> Seminars in Radiation Oncology. 20 (3), 156-163 (2010).</li>
<li>Kunz-Schughart, L. A., Frreyer, J. P., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+3-D+cultures+for+high-throughput+screening%3A+The+multicellular+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model.</a> Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).</li>
<li>Carragher, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concerns%2C+challenges+and+promises+of+high-content+analysis+of+3D+cellular+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Concerns, challenges and promises of high-content analysis of 3D cellular models.</a> Nature Review Drug Discovery. 17 (8), 606(2018).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+morphological+and+physiological+monitoring+of+three-dimensional+tumor+spheroids+using+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Longitudinal morphological and physiological monitoring of three-dimensional tumor spheroids using optical coherence tomography.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59020(2019).</li>
<li>Yazdanfar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+robust+image-baed+autofocusing+for+digital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Simple and robust image-baed autofocusing for digital microscopy.</a> Optics Express. 16 (12), 8670-8677 (2008).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+evaluation+of+tumor+spheroid+behavior+in+3D+culture+using+deep+learning-based+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Automated evaluation of tumor spheroid behavior in 3D culture using deep learning-based recognition.</a> Biomaterials. 22 (272), 120770(2021).</li>
<li>Boucherit, N., Gorvel, L., Olive, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tumor+models+and+their+use+for+the+testing+of+immunotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">3D tumor models and their use for the testing of immunotherapies.</a> Frontiers in Immunology. 11, 603640(2020).</li>
<li>Anastasiou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment+factors+shaping+the+cancer+metabolism+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microenvironment factors shaping the cancer metabolism landscape.</a> British Journal of Cancer. 116 (3), 277-286 (2017).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+clinical+significance+of+mechanical+tumor+microenvironment%3A+Cancer+cell+sensing%2C+mechanobiology+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Communications%22%5BJournal%5D)">Functions and clinical significance of mechanical tumor microenvironment: Cancer cell sensing, mechanobiology and metastasis.</a> Cancer Communications. 43 (5), 374-400 (2022).</li>
<li>Zhu, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+KRAS+cancers%3A+From+druggable+therapy+to+druggable+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting KRAS cancers: From druggable therapy to druggable resistance.</a> Molecular Cancer. 21 (1), 159(2022).</li>
<li>Ando, Y., Mariano, C., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+in+vitro+tumor+models+for+cell-based+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Engineered in vitro tumor models for cell-based immunotherapy.</a> Acta Biomaterialia. 132, 345-359 (2021).</li>
<li>Timmins, N. E., Dietmair, S., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hanging-drop+multicellular+spheroids+as+a+model+of+tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Hanging-drop multicellular spheroids as a model of tumor angiogenesis.</a> Angiogenesis. 7 (2), 97-103 (2004).</li>
<li>Costa, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tumor+spheroids%3A+An+overview+on+the+tools+and+techniques+used+for+their+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">3D tumor spheroids: An overview on the tools and techniques used for their analysis.</a> Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).</li>
<li>Sant, S., Johnston, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+production+of+3D+tumor+spheroids+for+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today.+Technologies%22%5BJournal%5D)">The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 23, 27-36 (2017).</li>
<li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening%3A+A+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Scientific Reports. 6, 19103(2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De micro-omgeving speelt een belangrijke rol bij tumorgroei. Het kan de levering van extracellulaire matrices, zuurstofgradiënten, voeding en mechanische interactie beïnvloeden en dus de genexpressie, signaalroutes en vele functies van tumorcellen beïnvloeden 19,20,21. In veel gevallen produceren 2D-cellen dergelijke effecten niet of zelfs tegengestelde effecten, waardoor de evaluatie van medicamenteuze behandelingen wordt beïnv...

Kanker is een van de ziekten die het meest gevreesd wordt door de mens, niet in de laatste plaats vanwege het hoge sterftecijfer1. In de afgelopen jaren is de mogelijkheid om kanker te behandelen toegenomen omdat nieuwe therapieën zijn geïntroduceerd 2,3,4,5. Tweedimensionale (2D) en driedimensionale (3D) in vitro modellen worden gebruikt om kanker in een laboratoriumomgeving te bestuderen. 2D-modellen kunnen echter niet onmiddellijk en nauwkeurig alle belangrijke parameters beoordelen die wijzen op antitumorgevoeligheid; daarom slagen ze er niet in om in vivo interacties volledig weer te geven bij het testen van medicamenteuze therapie6.
Sinds 2020 is de wereldwijde driedimensionale (3D) cultuurmarkt sterk gestimuleerd. Volgens een rapport van NASDAQ OMX zal de wereldwijde waarde van de 3D-celkweekmarkt tegen het einde van 2025 meer dan USD 2,7 miljard bedragen. In vergelijking met 2D-kweekmethoden vertoont 3D-celkweek voordelige eigenschappen, die niet alleen kunnen worden geoptimaliseerd voor proliferatie en differentiatie, maar ook voor overleving op lange termijn 7,8. Op dergelijke manieren kunnen in vivo cellulaire micro-omgevingen worden gesimuleerd om nauwkeurigere tumorkarakterisering te verkrijgen, evenals metabole profilering, zodat genomische en eiwitveranderingen beter kunnen worden begrepen. Daarom moeten 3D-testsystemen nu worden opgenomen in reguliere geneesmiddelenontwikkelingsoperaties, vooral die met een focus op het screenen en evalueren van nieuwe antitumorgeneesmiddelen. Driedimensionale gezwellen van vereeuwigde gevestigde cellijnen of primaire celculturen in sferoïde structuren bezitten in vivo kenmerken van tumoren zoals hypoxie en geneesmiddelpenetratie, evenals celinteractie, respons en resistentie, en kunnen worden beschouwd als een strikt en representatief model voor het uitvoeren van in vitro geneesmiddelenscreening 9,10,11.
Deze 3D-cultuurmodellen hebben echter ook last van verschillende problemen die enige tijd kunnen duren om op te lossen. Celsferoïden kunnen worden gevormd met behulp van deze protocollen, maar ze verschillen in bepaalde details, zoals kweektijd of inbeddingsgels12, dus deze geconstrueerde celsferoïden kunnen niet goed worden gecontroleerd onder een beperkt groottebereik. De grootte van de sferoïden kan de consistentie van de levensvatbaarheidstest en beeldvormingsanalyse beïnvloeden. De groeimicro-omgevingen en groeifactoren variëren ook, wat kan leiden tot verschillende morfologieën als gevolg van verschillen in de differentiatie tussen cellen13. Er is nu een duidelijke behoefte aan een standaard, eenvoudige en kosteneffectieve methode voor het construeren van alle soorten tumoren met gecontroleerde groottes.
Vanuit een ander perspectief, hoewel homogene assays en high-content imaging benaderingen zijn ontwikkeld om morfologie, levensvatbaarheid en groeisnelheid te evalueren, blijft de high-throughput screening van 3D-modellen een uitdaging om verschillende redenen die in de literatuur worden gerapporteerd, zoals het gebrek aan uniformiteit in de positie, grootte en morfologie van tumorsferoïden14,15,16.
In het hier gepresenteerde protocol vermelden we elke stap in de constructie van 3D-tumorsferoïden en beschrijven we een methode voor sferoïde observatie en analyse met behulp van een high-throughput, high-content beeldvormingssysteem dat autofocus, auto-imaging en analyse omvat, naast andere voordelige kenmerken. We laten zien hoe deze methode 3D-tumorsferoïden van uniforme grootte kan produceren die geschikt zijn voor high-throughput beeldvorming. Deze sferoïden vertonen ook een hoge gevoeligheid voor de behandeling van kankergeneesmiddelen en morfologische veranderingen in de sferoïden kunnen worden gevolgd met behulp van beeldvorming met een hoog gehalte. Samenvattend tonen we de robuustheid van deze methodologie aan als een middel om 3D-tumorconstructies te genereren voor geneesmiddelenevaluatiedoeleinden.

<table><tbody><tr><td>0.5-10 &mu;L Pipette tips</td><td>AXYGEN</td><td>T-300</td><td></td></tr><tr><td>1.5&nbsp;mL Boil proof microtubes</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>100-1000&mu;L Pipette tips</td><td>KIRGEN</td><td>KG1313</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Centrifuge Tube</td><td>Nest</td><td>601052</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;L Pipette tips</td><td>AXYGEN</td><td>T-200-Y</td><td></td></tr><tr><td>3D gel</td><td>Avatarget</td><td>MA02</td><td></td></tr><tr><td>48-well U bottom Plate</td><td>Avatarget</td><td>P02-48UWP</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Centrifuge Tube</td><td>Nest</td><td>602052</td><td></td></tr><tr><td>Alamar Blue</td><td>Thermo</td><td>&nbsp;DAL1100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td><td>STEMCELL</td><td>#07010</td><td></td></tr><tr><td>Certified FBS</td><td>BI</td><td>04-001-1ACS</td><td></td></tr><tr><td>Deionized water</td><td>aladdin</td><td>W433884-500ml</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Excel sofware&nbsp;</td><td>Microsoft office</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graphpad prism sofware&nbsp;</td><td>GraphPad software&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>High Content Imager and SMART system</td><td>Avatarget</td><td>1-I01</td><td></td></tr><tr><td>Image J software</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X)</td><td>Gibco</td><td>51300-044</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>P1020</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin Sol</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Scientific Fluoroskan Ascent</td><td>Thermo</td><td>Fluoroskan Ascent</td><td></td></tr><tr><td>T25 Flask</td><td>JET Biofil</td><td>TCF012050</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, 0.25% (1X)</td><td>Hyclone</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr></tbody></table>

generatie van 3d-tumorsferoïden voor geneesmiddelenevaluatiestudies

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

In de afgelopen decennia zijn, naast monolaag-gekweekte cellen, driedimensionale tumorsferoïden ontwikkeld als een potentieel krachtig hulpmiddel voor de evaluatie van geneesmiddelen tegen kanker. De conventionele kweekmethoden missen echter het vermogen om de tumorsferoïden op een homogene manier op driedimensionaal niveau te manipuleren. Om deze beperking aan te pakken, presenteren we in dit artikel een handige en effectieve methode voor het construeren van tumorsferoïden van gemiddelde grootte. Daarnaast beschrijven we een methode van beeldgebaseerde analyse met behulp van op kunstmatige intelligentie gebaseerde analysesoftware die de hele plaat kan scannen en gegevens over driedimensionale sferoïden kan verkrijgen. Verschillende parameters werden bestudeerd. Door gebruik te maken van een standaardmethode van tumorsferoïde constructie en een high-throughput beeldvormings- en analysesysteem, kunnen de effectiviteit en nauwkeurigheid van medicijntests die worden uitgevoerd op driedimensionale sferoïden drastisch worden verhoogd.

Figuur 1A,B toont het proces dat in deze studie wordt gebruikt voor het construeren van tumorsferoïden. We hebben de cellen eerst gezaaid in een 48-well U-bodemplaat. Deze stap is bijna hetzelfde als die wordt gebruikt in 2D-celcultuur. We bewaarden de plaat in een gemeenschappelijke incubator met water rond de putten, zodat de afgezette cellen sferoïden begonnen te vormen in een zelfassemblageproces. Onder normale operationele omstandigheden werden de meeste soorten tumors...

Dit artikel demonstreert een gestandaardiseerde methode voor het construeren van driedimensionale tumorsferoïden. Een strategie voor sferoïde observatie en beeldgebaseerde deep-learning analyse met behulp van een geautomatiseerd beeldvormingssysteem wordt ook beschreven.

Generatie van 3D-tumorsferoïden voor geneesmiddelenevaluatiestudies

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...

Dit protocol demonstreerde een gestandaardiseerde methode voor het construeren van driedimensionale tumoren van sferoïden. En deze methodologie bood een hoog circuit en een hoge inhoudsanalyse van 3D-tumorconstructies. Door gebruik te maken van een standaardmethode van tumorachtige sferoïde constructie en een beeldvormings- en analysesysteem met hoge doorvoer, kunnen de effectiviteit en nauwkeurigheid van medicijntests gevormd op driedimensionale sferoïden drastisch worden verhoogd.In dit protocol gebruikten we AMG510 om NCI-H23 sferoïde als voorbeeld te behandelen. Uit het experiment konden we een significant effect van kankerachtig gericht medicijn op de tumorsferoïden waarnemen. Om te beginnen, pipetteer 100 microliter anti-adhesiereagens in elke put van een 48-putplaat met een U-vormige putbodem en bewaar gedurende 10 minuten.Zuig na 10 minuten het coatingreagens op en was tweemaal met gesteriliseerde PBS. Plaats de kweekplaat in een incubator bij 37 graden Celsius in bevochtigde lucht met 5% koolstofdioxide tot gebruik. Observeer de cellen onder de microscoop.Was vervolgens de cellen gekweekt in een T25-kolf tweemaal met PBS om het kweekmedium te verwijderen en behandel de geë

generation-of-3d-tumor-spheroids-for-drug-evaluation-studies

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

We introduceren een protocol voor het aanleggen van grote aantallen (duizenden tot honderdduizenden) van gelijke grootte-en-samenstelling gecontroleerde bolvormige tumoren, met behulp van in de handel verkrijgbare microputjesplaten.

De productie van grote aantallen grote gecontroleerde bolvormige tumoren met behulp microputjesplaten

Invasie van omliggende normale weefsels is een typerend kenmerk van kwaadaardige tumoren. We bieden hier een eenvoudige, semi-geautomatiseerde microplaattest van invasie in een natuurlijke 3D biomatrix die met een aantal modellen van gevorderde menselijke kankers is geëxemplifeerd.

Driedimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Er wordt een protocol gepresenteerd voor robotisch afdrukken van kankercelsferoïden in een 96-wellsplaatformaat met hoge doorvoer met behulp van een waterig tweefasensysteem.

Robotic productie van Cancer Cell sferoïden met een waterige tweefasensysteem voor Drug Testing

Van patiënten afgeleide xenografts van glioblastoma multiforme kunnen worden geminiaturiseerd tot levende microtumoren met behulp van een 3D-menselijke biogel-kweeksysteem. Deze in vivo-achtige 3D-tumortest is geschikt voor het testen van de reactie op geneesmiddelen en moleculair profileren, inclusief kinoomanalyse.

Genereren van Microtumors Met behulp van 3D Human Biogel Cultuur System en Patient afgeleide glioblastoma Cellen voor Kinomic Profiling and Drug Response Testen

Over een breed scala van indicaties van de ziekte, meer fysiologisch relevante modellen worden ontwikkeld en uitgevoerd in drug discovery-programma's. Het nieuwe modelsysteem hier beschreven demonstreert hoe driedimensionale tumor spheroïden kunnen worden gekweekt en vertoond in een high-throughput 1536-well plaat-gebaseerd systeem om te zoeken naar nieuwe oncologie drugs.

Generatie van High-Throughput driedimensionale Tumor spheroïden voor Drug Screening

Optische coherentie tomografie (OCT), een driedimensionale imaging technologie, werd gebruikt om te controleren en te karakteriseren de kinetiek van de groei van meercellige tumor spheroïden. Precieze volumetrische kwantificering van tumor spheroïden met behulp van een voxel tellen aanpak, en label-vrije dood weefsel detectie in de spheroïden op basis van intrinsieke optische demping daarentegen werden gedemonstreerd.

Longitudinale morfologische en fysiologische Monitoring van driedimensionale Tumor spheroïden met behulp van optische coherentie tomografie

Dit protocol beschrijft het genereren van door patiënten afgeleide spheroïden en downstreamanalyses, waaronder de kwantificering van proliferatie, cytotoxiciteits testen, Flowcytometrie, immunofluorescentie kleuring en confocale beeldvorming, om de geneesmiddelen te beoordelen potentiële kandidaten als anti-neoplastische Therapeutics. Dit protocol ondersteunt precisie geneeskunde met identificatie van specifieke geneesmiddelen voor elke patiënt en stadium van de ziekte.

Fysiologisch patiënt afgeleide 3D-Spheroids voor anti-neoplastische geneesmiddelen screening om kanker stamcellen te targeten

Uitgebreide in vitro modellen die de relevante menselijke ziekte getrouw samenvatten, ontbreken. De huidige studie presenteert driedimensionale (3D) tumor sferoïde creatie en cultuur, een betrouwbaar in vitro hulpmiddel om de tumor-stromale interactie in humaan hepatocellulair carcinoom te bestuderen.

Een driedimensionaal sferoïde model om de tumor-stromale interactie bij hepatocellulair carcinoom te onderzoeken

Het huidige protocol beschrijft het genereren van 3D-tumorcultuurmodellen van primaire kankercellen en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen met behulp van cel-levensvatbaarheidstests en microscopische onderzoeken.

Het vaststellen van 3-dimensionale sferoïden uit van de patiënt afgeleide tumormonsters en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen

Hier presenteren we een methode om verbindingen te identificeren die het ADCC-mechanisme moduleren, een belangrijk kankerceldodend mechanisme van antitumorantilichamen. Het cytotoxische effect van NK-cellen wordt gemeten in sferoïden van borstkankercellen in aanwezigheid van Trastuzumab. Beeldanalyse identificeert levende en dode killer- en doelcellen in sferoïden.

Kwantificering van antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit in een tumorsferoïde model: aanvraag voor ontdekking van geneesmiddelen

Leer een gestandaardiseerde methode voor het genereren van 3D-tumorsferoïden met high-throughput beeldvorming en deep-learning analyse. Deze aanpak verbetert de nauwkeurigheid van geneesmiddelentests aanzienlijk.

Generatie van 3D-tumorsferoïden voor geneesmiddelenevaluatiestudies

Meer video's verkennen