Name: Verlenging van de levensduur van neutrofielen met CLON-G en een in vitro spontane doodstest (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Leer hoe u de levensduur van neutrofielen verlengt met CLON-G-medium voor immunologisch onderzoek. Deze methode behoudt celviabiliteit en functionaliteit gedurende meer dan vijf dagen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit project werd ondersteund door het Haihe Laboratory of Cell Ecosystem Innovation Fund (22HHXBSS00036, 22HHXBSS00019), het Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) Innovation Fund for Medical Sciences (2021-I2M-1-040,2022-I2M-JB-015), het Special Research Fund for Central Universities, Peking Union Medical College (3332022062) en het Science and Technology Support Program van de provincie Sichuan (NR. 2021YJ0480).

Het Boston Children's Hospital en State Key Laboratory of Experimental Hematology (SKLEH) Animal Care and Use Committee keurde en controleerde alle procedures. Figuur 1 toont een stroomschema van neutrofielenkweek met CLON-G en de in vitro doodstest.
1. Verlenging van de levensduur van neutrofielen met CLON-G
OPMERKING: Alle genoemde bewerkingen en materialen moeten steriel zijn. Zorg ervoor dat alle oplossingen goed gemengd en gelijkmatig verdeeld zijn.
<ol><li>Behoud van de CLON-G componenten<ol><li>Los 50 mg Q-VD-oph (zie materiaaltabel) op tot een eindconcentratie van 100 mM door toevoeging van 973,7 μl dimethylsulfoxide (DMSO) en pipetteer de vloeistof totdat het mengsel helder wordt. Aliquot 50 μL per buis, en bewaren bij −20 °C. LET OP: DMSO is een schadelijke chemische vloeistof. Draag een laboratoriumjas, een bril en een masker om huidcontact, oogcontact en inademing te voorkomen.</li>
		<li>Ontdooi Hsp70 (zie materiaaltabel) bij 4 °C en draai de inhoud van de injectieflacon af. Aliquot 1 μL Hsp70 per buis op ijs, en bewaren bij −80 °C. OPMERKING: Hsp70 is een eiwit; Ultrakoude opslag is nodig om het stabiel te houden. Vermijd de vries-dooicyclus.</li>
		<li>Los 1 mg DFO op (zie materiaaltabel) met 7,61 ml RPMI 1640 om een voorraad van 200 μM te verkrijgen. Aliquot 500 μL per buis, en bewaar bij −20 °C.</li>
		<li>Los 0,1 g NAC (zie materiaaltabel) op met 2,5 ml RPMI 1640 in een centrifugebuis van 15 ml en stel de pH in op 7-7,4 met NaOH. Voeg RPMI 1640 toe aan een eindvolume van 3,06 ml om een 200 mM NAC-voorraad te maken. Filter het met een filtereenheid van 0,2 μm. Aliquot 500 μL per buis, en bewaren bij −20 °C. OPMERKING: Het oplossen van NAC in deze hoge concentratie is niet eenvoudig en vortexing kan helpen het op te lossen. Fenolrood in RPMI 1640 is een perfecte indicatie van de pH; wanneer de NAC net is opgelost, is de kleur geelachtig; Pas het aan totdat het rozeachtig wordt. NAC-voorraadoplossingen zijn tot 1 maand stabiel bij −20 °C.</li>
		<li>Los 10 mg Nec-1's (zie materiaaltabel) op tot 20 mM met 1,8 ml DMSO en pipetteer het mengsel totdat het helder wordt. Aliquot 50 μL per buis, en bewaren bij −20 °C. Bescherm tegen licht.</li>
		<li>Los 250 μg G-CSF (zie materiaaltabel) op tot 200 μg/ml met 1,25 ml RPMI 1640. Aliquot 50 μL per buis, en bewaren bij 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van 2x CLON-G kweekmedium<ol><li>Bereid het basismedium voor. Voeg 39,5 ml RPMI 1640, 10 ml foetaal runderserum (FBS) en 0,5 ml pen-strep (antibiotica) toe aan een buis van 50 ml om RPMI 1640 te maken met 20% FBS en 1% PS als basismedium. OPMERKING: Deze hoge concentratie FBS wordt gebruikt om te zorgen voor de langdurige kweek van neutrofielen, die langer dan 5 dagen kan zijn. Als de kweektijd 1-2 dagen is, is 10% -15% FBS voldoende.</li>
		<li>Ontdooi alle voorraadoplossingen van de CLON-G componenten op ijs.</li>
		<li>Verdun 1 μL Hsp70 tot 20 μM door 606 μL van het basismedium toe te voegen. Verdun 1 μL van 200 μg/ml g-csf tot 20 μg/ml door toevoeging van 9 μl van het basismedium.</li>
		<li>Voeg 976 μL basisch medium toe aan een centrifugebuis van 15 ml. Voeg 1 μL Q-VD-oph (100 mM), 10 μL DFO (200 μM), 1 μL Hsp70 (20 μM), 10 μL NAC (200 mM), 1 μL Nec-1s (20 mM) en 1 μL G-CSF (20 μg / ml) toe om 1 ml 2x CLON-G medium te maken. OPMERKING: Het 2x CLON-G medium moet onmiddellijk na bereiding worden gebruikt. Men kan de 2x CLON-G tijdelijk bewaren bij 4 °C. Restanten van 20 μM Hsp70 moeten worden weggegooid.</li>
	</ol></li>
	<li>Neutrofielencultuur<ol><li>Isoleer neutrofielen van muizen door gradiëntcentrifugatie volgens een eerder rapport25. Resuspendeer de geïsoleerde neutrofielen van muizen in het basismedium (1 miljoen cellen/100 μL). OPMERKING: Vermijd het activeren van de neutrofielen door ze voorzichtig te hanteren. Vermijd schuimvorming tijdens het hele proces.</li>
		<li>Voeg 500 μL 2x CLON-G medium, 400 μL van het basismedium en 100 μL van de celsuspensie toe aan 24-well non-tissue gekweekte kweekplaten (zie Tabel van Materialen) en pipetteer voorzichtig drie tot vier keer. OPMERKING: Hoge concentraties van de componenten in het 2x CLON-G medium kunnen de neutrofielen beschadigen; Vermijd ze samen te voegen zonder het basismedium. De niet-weefselgekweekte kweekplaat is noodzakelijk om neutrofiele hechting te voorkomen.</li>
		<li>Plaats de kweekplaat soepel in een 37 °C en 5 % CO2 incubator. OPMERKING: Het is niet nodig om het celmedium binnen 7 dagen te vervangen. De uiteindelijke concentraties van de CLON-G-samenstelling zijn 50 μM Q-VD-Oph, 1 μM DFO, 10 pM Hsp70, 1 mM NAC, 10 μM Nec-1 s en 10 ng/ml G-CSF.</li>
		<li>Bevlek de gekweekte neutrofielen met Wright Giemsa-samengestelde kleuring (zie tabel met materialen) en analyseer met een lichtmicroscoop (figuur 2A-D). U kunt ook kleuren met APC-CD11b- en PE-Cy7-Ly6G-antilichamen en analyseren met flowcytometrie (figuur 2E-I) zoals eerder beschreven26.</li>
	</ol></li>
</ol>2. In vitro spontane doodstest van neutrofielen
<ol><li>Flowcytometrie analyse<ol><li>Kweek geïsoleerde neutrofielen met een dichtheid van 1 miljoen cellen/ml in het basismedium bij 37 °C en 5% CO2. De 24-well kweekplaat is niet-weefselgekweekt. Voeg 1 ml celmedium per put toe.</li>
		<li>Los 1 g CaCl 2 op met 45 ml zoutoplossing om 200 mM CaCl2 te maken. Filter het met een filtereenheid van 0,2 μm. Bewaren bij 4 °C.</li>
		<li>Bereid de kleuringsmix voor. Voeg 7 μL zoutoplossing per monster toe aan een buis van 1,5 ml en voeg 0,4 mg/ml FITC-Annexin-V, 0,5 mg/ml propidiumjodide (PI) en 200 ml CaCl2-oplossing toe met elk 1 μl per monster. Meng goed. Gebruik de oplossing onmiddellijk na bereiding.</li>
		<li>Pipetteer het celmedium vijf tot zeven keer voorzichtig om goed te mengen, gevolgd door het overbrengen van 100 μL naar een flowcytometriebuis op de gewenste tijdstippen. OPMERKING: Vermijd schuimvorming tijdens het hele proces.</li>
		<li>Vortex tellende kralen (zie Tabel van Materialen) om ze goed te mengen. Pipetteer 10 μL van de goed gemengde telparels aan dezelfde flowcytometriebuis als in stap 2.1.4.</li>
		<li>Voeg 10 μL het bereide kleuringsmengsel (stap 2.1.3) toe aan de flowcytometriebuis. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten uit de buurt van het licht.</li>
		<li>Voeg 100 μL zoutoplossing toe aan de buis en meng goed om de gelijkmatige verdeling van de telparels en cellen te garanderen.</li>
		<li>Voer flowcytometrie-analyse van het celmedium uit. Verzamel de cellen met een lage snelheid met ~400 gebeurtenissen/s. Gate de APC-PE-Cy7-cellen naar FSC-A en SSC-A, en gate de intacte cellen met medium FSC-A- en SSC-A-posities naar de FITC-Annexin-V en PE-PI; de Annexin-V−PI− populatie is geclassificeerd als gezonde cellen. OPMERKING: De volgende vergelijkingen bepalen het totale aantal gezonde cellen per monster en de levensvatbaarheid van de neutrofielen: Totaal aantal gezonde cellen per monster27 = (1.000/aantal telparels) × aantal Annexin-V−PI− populatie × 10 Levensvatbaarheid van neutrofielen = totaal aantal gezonde cellen op het aangegeven tijdstip/totaal aantal gezonde cellen op tijdstip nul</li>
	</ol></li>
	<li>Fluorescerende beeldtest<ol><li>Kweek geïsoleerde neutrofielen met een dichtheid van 1 miljoen cellen/ml in het basismedium bij 37 °C en 5% CO 2 in een confocale plaat met2 ml celmedium per plaat. OPMERKING: Een confocale fluorescentiemicroscoop heeft de beste beeldkwaliteit, maar elke fluorescentiemicroscoop met 488/561/DIC-kanalen is voldoende om dit experiment te ondersteunen.</li>
		<li>Haal de plaat er voorzichtig uit op het aangegeven tijdstip. Voeg 10 μL elk van 0,4 mg/ml FITC-Annexin-V, 0,5 mg/ml PI en 200 mM CaCl2 gelijkmatig toe aan de plaat. Bevlek bij kamertemperatuur gedurende 5 min. OPMERKING: Vermijd schudden tijdens het hele proces. Voeg de kleuringsmiddelen gelijkmatig en voorzichtig toe.</li>
		<li>Leg fluorescentiebeelden vast op 488 (annexine-V)/561 (PI)/DIC-kanalen met behulp van een confocale fluorescentiemicroscoop met een 20x objectieflens (zie materiaaltabel). Stel de belichtingstijd van het 488-kanaal in op 500 ms, het 561-kanaal op 200 ms en het DIC-kanaal op 100 ms. Selecteer 5-10 willekeurige gebieden voor elke plaat. De celtypen zijn gedefinieerd in ons eerder gepubliceerde rapport14.</li>
	</ol></li>
</ol>

De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd zonder belangenverstrengeling.

Neutrofielen spelen een vitale rol in aangeboren en adaptieve immuniteit en hun homeostase is strak gereguleerd. Neutrofielen zijn de meest voorkomende leukocyten in menselijk perifeer bloed en ze hebben een robuuste en snelle omzet. Een gezonde volwassene kan dagelijks 1 x 109 neutrofielen/kg uit het beenmergafgeven 28. De dood van neutrofielen is daarom een van de raadselachtige raadsels van dit veld geworden en er is veel moeite gedaan om ze beter te begrijpen. Caspase 29,30,31,32, L...

Van neutrofielen is bekend dat ze bestaan uit een arsenaal van overvloedige cytoplasmatische korrels, nicotinamide adenine dinucleotidefosfaat (NADPH) oxidase, antimicrobiële enzymen en verschillende organellen die zich verdedigen tegen binnendringende microben; Bovendien zijn ze zeer beweeglijk en zijn ze de eerste cellen die op de ontstekingsplaats worden gerekruteerd, wat betekent dat neutrofielen de eerste verdedigingslinie zijn van het aangeboren immuunsysteem 1,2. Granulocytentransfusietherapie is daarom een veelbelovende klinische behandeling geworden voor neutropenie-gerelateerde infecties om de immuniteit van neutrofielen tijdelijk te verhogen 3,4,5. Recente ontdekkingen hebben duidelijk aangetoond dat neutrofielen ook functioneren als meerzijdige effectoren in veel fysiopathologische scenario's6. De gemiddelde levensduur van een neutrofiel is minder dan 24 uur, en dus zijn fundamenteel onderzoek naar neutrofielen en de toepassing van neutrofielenstudies enorm moeilijk vanwege de beperkingen in verband met stabiele genetische manipulatie en langdurige opslag 7,8,9,10,11 . Er zijn enkele cellijnen die gedeeltelijk enkele neutrofiele functies kunnen vertonen, zoals HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 en geïnduceerde pluripotente stamcellen12. Deze cellijnen kunnen effectieve genbewerking en cryopreservatie bereiken; Ze verschillen echter nog steeds enorm van primaire neutrofielen en kunnen dus neutrofiele functies niet getrouw samenvatten13. Het grootste deel van het onderzoek op dit gebied is dus nog steeds afhankelijk van vers geïsoleerde primaire neutrofielen. Het veld vertrouwt nog steeds op het genereren van dure en tijdrovende voorwaardelijke knock-out muizen om specifieke genfuncties in neutrofielen te onderzoeken, maar er bestaan momenteel geen menselijke modellen.
Na onze inspanningen te hebben gedaan om de heterogene processen te onderzoeken die betrokken zijn bij neutrofielendood en de meerdere routes die deze processen reguleren14,15, werd onlangs een nieuwe behandeling genaamd CLON-G (caspases-lysosomale membraanpermeabilisatie-oxidant-necroptose-remming plus granulocytkoloniestimulerende factor) gemeld 16. CLON-G bestaat uit Q-VD-oph (quinolyl-valyl-O-methylaspartyl-[-2,6-difluorfenoxy]-methylketon), Hsp70 (heat shock protein 70), DFO (deferoxamine), NAC (N-acetylcysteïne), Nec-1s (necrostatine-1s) en G-CSF (granulocytkoloniestimulerende factor). Neutrofiele spontane dood wordt gemedieerd door meerdere routes, waaronder apoptose, necroptose en pyroptose. Q-VD-oph remt de apoptose van neutrofielen als pan-caspaseremmer door zich te richten op caspase 1, caspase 3, caspase 8 en caspase 917. Neutrofiele necroptose is afhankelijk van een signaalroute met receptor-interagerend eiwitkinase-1 (RIPK1) en gemengd lineage kinase domein-achtig eiwit (MLKL)18. Als RIPK1-remmer remmen Nec-1's de necroptose van neutrofielen. Hsp70 en DFO kunnen lysosomale membraanpermeabilisatie (LMP) remmen, wat neutrofiele apoptose19 en pyroptose20 kan induceren. Reactieve zuurstofsoorten (ROS) spelen een vitale rol bij neutrofielensterfte door LMP19 en apoptose21 te bemiddelen en door overlevingssignalente remmen 22. Als een antioxidant die ROS-accumulatie kan verminderen, vertraagt NAC de dood van neutrofielen. Als groeifactor activeert G-CSF neutrofiele overlevingssignalen en remt calpain-geïnduceerde apoptose23,24. Door zich tegelijkertijd te richten op meerdere neutrofiele spontane doodsroutes, kan de levensduur van neutrofielen effectief worden verlengd tot meer dan 5 dagen zonder hun functie in gevaar te brengen. CLON-G-behandeling breidt de mogelijkheden van neutrofielenbehoud, transport en genmanipulatie uit, wat het onderzoek in de neutrofielengemeenschap kan versnellen. Ondertussen, op basis van de kennis van neutrofielendood, kunnen de momenteel goedgekeurde protocollen voor celdoodtests onverwachte schade aan neutrofielenveroorzaken 14, dus deze protocollen zijn verfijnd om meer geschikt te zijn voor neutrofiele studies. Dit rapport biedt gedetailleerde protocollen voor neutrofielenkweek met CLON-G en een in vitro celdoodtest van neutrofielen van muizen met behulp van flowcytometrie en fluorescentiebeeldvorming. CLON-G is effectief op zowel muis als menselijke neutrofielen; De muismonsters worden hier echter gedemonstreerd om dit protocol te vereenvoudigen. De concentratie NAC is 1 mM voor neutrofielen bij muizen en 10 μM voor menselijke neutrofielen. Hsp70 is soortspecifiek en moet dus worden gebruikt volgens de bron van de neutrofiel. Voor dit protocol maakt het niet uit of neutrofielen worden geïsoleerd uit perifeer bloed of beenmerg en hoe ze worden geïsoleerd.
Voor de huidige studie werden neutrofielen geïsoleerd uit het beenmerg van de muis om voldoende neutrofielen voor de experimenten te bereiken, aangezien ongeveer 1 x 10 7-1,5 x 107 neutrofielen uit het beenmerg kunnen worden verkregen, terwijl slechts 1 x 10 6 neutrofielen kunnen worden geïsoleerd uit het perifere bloed van een enkele 8-12 weken oude C57BL /6-muis (van beide geslachten). Gradiëntcentrifugatie werd uitgevoerd om mogelijke schade en activering door de mechanische stimulatie van FACS-sortering of MACS-sortering te voorkomen.

<table><tbody><tr><td>0.2 &micro;m spuitfilter</td><td>Pall Corporation</td><td>4612</td><td>Filtraat bereid CLON-G componenten.</td></tr><tr><td>1.5 mL micro centrifugebuis</td><td>LABSELECT</td><td>MCT-001-150</td><td>Lab consumptieartikel.</td></tr><tr><td>15 mL Centrifugebuizen</td><td>LABSELECT</td><td>CT-002-15</td><td>Lab consumptieartikel.</td></tr><tr><td>24 wel celcultuurplaat</td><td>Falcon</td><td>351147</td><td>Neutrofielcultuurplaat.</td></tr><tr><td>50 mL Centrifugebuizen</td><td>LABSELECT</td><td>CT-002-50</td><td>Lab consumptieartikel.</td></tr><tr><td>BD LSRII</td><td>BD</td><td></td><td>Instrument voor flowcytometrieanalyse van neutrofieldood.</td></tr><tr><td>Calciumchloride (CaCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td>Assistent van Annexin-V binding&nbsp; naar fosfatidylserine.</td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Perkinelmer</td><td>UltraVIEW VOX</td><td>Instrument voor fluorescente analyse van neutrofieldood.</td></tr><tr><td>Confocale plaat</td><td>NEST</td><td>801001-20mm</td><td>Lab consumptieartikel voor fluorescente beeldtest.</td></tr><tr><td>Tellingkralen</td><td>Thermo Fisher</td><td>C36950</td><td>Kwantificering in flowcytometrieanalyse van neutrofieldood.</td></tr><tr><td>DFO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9533</td><td>Component van CLON-G. LMP-remmer.</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td>Oplosmiddel voor Q-VD-oph en Nec-1s.</td></tr><tr><td>Fetaal runderserum</td><td>Gibco</td><td>10099141C</td><td>Component van neutrofielcultuurbasismedium. Voedingsvoorziening.</td></tr><tr><td>FITC-Annexin-V</td><td>BD</td><td>51-65874X</td><td>Annexin-V kan zich binden aan fosfatidylserine van verouderde cellen. Dit is op FITC-kanaal.</td></tr><tr><td>Hsp70</td><td>Abcam</td><td>ab113187</td><td>Component van CLON-G. LMP-remmer.</td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165</td><td>Component van CLON-G. Antioxidant.</td></tr><tr><td>Nec-1s</td><td>EMD Millipore</td><td>852391-15-2</td><td>Component van CLON-G. Necroptose-remmer.</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine Oplossing (PS)</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td>Component van neutrofielcultuurbasismedium. Antibiotica om cellen te beschermen tegen bacteriënvervuiling.</td></tr><tr><td>Propidium Jodide (PI)</td><td>BioLegend</td><td>421301</td><td>Voor neutrofieldoodtest. Een kleine fluorescente molecuul die zich bindt aan DNA&nbsp; maar niet passief door cellen met een intact plasmamembraan kan trekken.</td></tr><tr><td>Q-VD-oph</td><td>Selleck chem</td><td>S7311</td><td>Component van CLON-G. Pan-caspase-remmer.</td></tr><tr><td>Recombinant Humaan Granulocyt-Colony-stimulerend Factor voor Injectie (CHO-cel)(G-CSF)</td><td>Chugai Pharma China</td><td>GRANOCYTE</td><td>Component van CLON-G.&nbsp; Bevordert neutrofieloverleving via Akt-route.</td></tr><tr><td>Rondbodem Polystyreenbuizen</td><td>Falcon</td><td>100-0102</td><td>Lab consumptieartikel voor flowcytometrieanalyse.</td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Gibco</td><td>C11875500BT</td><td>Component van neutrofielcultuurbasismedium.</td></tr><tr><td>Saline</td><td>LEAGENE</td><td>R00641</td><td>Oplossing voor flowcytometrieanalyse van neutrofieldood.</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide (NaOH)</td><td>FENG CHUAN</td><td>13-011-00029</td><td>pH-aanpassing voor NAC.</td></tr><tr><td>Wright-Giemsa-kleuroplossing</td><td>Solarbio</td><td>G1020</td><td>Neutrofielcytospinkleuring.</td></tr></tbody></table>

verlenging van de levensduur van neutrofielen met clon-g en een in vitro spontane doodstest

Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay

De gemiddelde levensduur van een neutrofiel is minder dan 24 uur, wat fundamenteel onderzoek naar neutrofielen en de toepassing van neutrofielenstudies beperkt. Ons eerdere onderzoek gaf aan dat meerdere routes de spontane dood van neutrofielen konden bemiddelen. Een cocktail werd ontwikkeld door zich tegelijkertijd te richten op deze routes, caspasen-lysosomale membraanpermeabilisatie-oxidant-necroptose-remming plus granulocytkoloniestimulerende factor (CLON-G), die de levensduur van neutrofielen verlengde tot meer dan 5 dagen zonder de neutrofiele functie aanzienlijk in gevaar te brengen. Tegelijkertijd werd ook een betrouwbaar en stabiel protocol ontwikkeld voor het beoordelen en evalueren van neutrofielensterfte. In dit werk laten we zien dat CLON-G de levensduur van neutrofielen in vitro kan verlengen tot meer dan 5 dagen, en we tonen de verlenging van de levensduur van neutrofielen met FACS en confocale fluorescentiemicroscopie. Dit rapport introduceert procedures voor de bereiding van CLON-G en toont een in vitro spontane doodstest van neutrofielen, die kan worden gebruikt voor de studie van neutrofielen en voor het vervolgens ondervragen van neutrofielendood, waardoor een betrouwbare bron voor de neutrofielengemeenschap wordt geboden.

De Wright-Giemsa-gekleurde morfologie (figuur 2A-D) en FACS-fenotypen (figuur 2E-J) van de met CLON-G behandelde neutrofielen werden niet beïnvloed. De levensvatbaarheid van de met CLON-G behandelde neutrofielen na 24 uur was ongeveer 90%+ op basis van flowcytometrie-analyse (figuur 3) en de fluorescerende beeldtests (figuur 4). Een lag...

Dit protocol beschrijft de voorbereiding van CLON-G om de levensduur van neutrofielen te verlengen tot meer dan 5 dagen en biedt een betrouwbare procedure voor het evalueren van neutrofielensterfte met flowcytometrie en confocale fluorescentiemicroscopie.

Verlenging van de levensduur van neutrofielen met CLON-G en een in vitro spontane doodstest

The average lifespan of a neutrophil is less than 24 h, which limits basic research on neutrophils and the application of neutrophil studies. Our previous ...

Ons protocol biedt een cocktailmedium om de levensduur van neutrofielen te verlengen tot meer dan vijf dagen zonder de neutrofiele functies in gevaar te brengen. Het biedt ook betrouwbare in vitro dialyse voor neutrofielen. CLON-G-behandeling breidt de mogelijkheden van neutrofielenbehoud, transport en genmanipulatie uit, wat het onderzoek in de neutrofielengemeenschap kan versnellen.Bereid om te beginnen het basismedium voor door RPMI 1640 FBS en pen-strep toe te voegen aan een buis van 50 milliliter. Ontdooi tegelijkertijd alle stamoplossingen van de CLON-G-componenten op ijs. Verdun vervolgens HSP 70 en 200 microgram per milliliter G-CSF in het basismedium.Breng 976 microliter basismedium over in een centrifugebuis van 15 milliliter. Voeg hieraan de CLON-G componenten toe om één milliliter 2x CLON-G medium te bereiden zoals beschreven in het manuscript. Bereid vervolgens de neutrofielencultuur voor door de geïsoleerde neutrofielen van de muis in het basismedium te suspenseren.Voeg CLON-G medium, gevolgd door het basismedium toe aan 24 goed niet-weefselgekweekte platen. Voeg vervolgens 100 microliter van de voorbereide celsuspensie toe en pipetteer drie tot vier keer zachtjes. In

neutrophil-lifespan-extension-with-clon-g-an-vitro-spontaneous-death

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In dit protocol presenteren we een methode om te...

Het meten van Caenorhabditis elegans Levensduur in 96 Well microtiterplaten

De toepasselijkheid van de Monogene assay voor het evalueren van reproductieve levensvatbaarheid is vastgesteld voor meer dan 50 jaar. Hier laten we zien de algemene procedure voor het uitvoeren van de Monogene assay met hechtende cellen.

Monogene Assay: hechtende cellen

Een protocol wordt beschreven voor in vivo detectie van effecten van mitochondriale remmers in het modelorganisme Caenorhabditis elegans en voor identificatie van potentiële versterkende verbindingen. Dit protocol kan worden gebruikt om geneesmiddelenbibliotheken te screenen op verbindingen die de mitochondriale functie moduleren.

Een Screenbare<em&gt; In Vivo</em&gt; Test voor Mitochondriale Modulators gebruik van Transgene Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

We beschrijven hier een werkwijze voor het verkrijgen en identificeren van een nieuw kenmerk subpopulatie van neutrofielen afgeleide reus fagocyten. Deze cellen ontwikkelen in de cultuur van verse menselijk bloed neutrofielen, en worden gekenmerkt door fagocytose, autofagie, immens groot formaat, en verlengde levensduur. Deze methode is van essentieel belang om verder te onderzoeken deze unieke neutrofielen afgeleid subpopulatie.

Ontwikkeling en Identificatie van een nieuw subpopulatie van Human neutrofielen afgeleide Giant Fagocyten In Vitro

Proteostatische achteruitgang is een kenmerk van veroudering en vergemakkelijkt het begin van neurodegeneratieve ziekten. We schetsen een protocol om proteostase kwantificeerbaar te meten in twee verschillende Caenorhabditis elegans-weefsels door heterologe expressie van polyglutamine-herhalingen gefuseerd met een fluorescerende verslaggever. Dit model maakt een snelle in vivo genetische analyse van proteostase mogelijk.

Kwantificering van weefselspecifieke proteostatische achteruitgang van Caenorhabditis elegans

Hier is een protocol om genetische interacties te identificeren door middel van een verhoogde kopie nummer suppressor scherm in Saccharomyces cerevisiae. Deze methode stelt onderzoekers in staat om te identificeren, klonen, en testen suppressors in kortstondige gist mutanten. We testen het effect van de toename van het kopieeraantal van SIR2 op de levensduur in een autofagie null mutant.

Een suppressor scherm voor de karakterisering van genetische links reguleren chronologische levensduur in Saccharomyces cerevisiae

Caenorhabditis elegans dienen als een uitstekend modelsysteem met robuuste en goedkope methoden voor het onderzoeken van de gezondheid, levensduur en veerkracht tegen stress.

Onderzoek naar goedkope methoden om levensduur en gezondheid te meten in Caenorhabditis elegans

Hier wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd voor het kweken van geïsoleerde individuele nematoden op vaste media in microgefabriceerde multi-well-apparaten. Met deze aanpak kunnen individuele dieren gedurende hun hele leven worden gevolgd op een verscheidenheid aan fenotypen die verband houden met veroudering en gezondheid, waaronder activiteit, lichaamsgrootte en -vorm, bewegingsgeometrie en overleving.

Langetermijnkweek en monitoring van geïsoleerde Caenorhabditis elegans op vaste media in multiwell-apparaten

Hier presenteren we een protocol om geïsoleerde individuele nematoden op vaste media te kweken voor levenslange fysiologische parametertracking en fluorescentiekwantificering. Dit kweeksysteem omvat een palmitinezuurbarrière rond putten met één worm om te voorkomen dat dieren vluchten, waardoor aversieve interventies mogelijk zijn, waaronder pathogene bacteriën en chemische stressoren.

Langetermijnkweek van individuele Caenorhabditis elegans op vaste media voor longitudinale fluorescentiemonitoring en aversieve interventies

Dit protocol beschrijft hoe de MEDUSA-analysemethode kan worden gebruikt om het doodregulerende effect van elke genknock-out te kwantificeren. Het bevat instructies voor het bepalen van experimentele omstandigheden die de gevoeligheid optimaliseren en een stapsgewijze zelfstudie over het uitvoeren van de analyse.

MEDUSA voor het identificeren van doodregulerende genen in chemo-genetische profileringsgegevens

Dit protocol biedt een eenvoudige, goedkope procedure om het tempo van embryonale dodelijkheid bij Caenorhabditis elegans te kwantificeren. Het maakt eenvoudige detectie van embryonale afwijkingen in populaties mogelijk zonder gespecialiseerde apparatuur of wormplukexpertise. Het protocol kan worden gebruikt om de effecten van genetische mutaties, RNA-interferentie-gemedieerde gen-knockdowns en dieet te kwantificeren.

Kwantificatie van embryonale dodelijkheidsgraad bij Caenorhabditis elegans

Leer hoe u de levensduur van neutrofielen verlengt met CLON-G-medium voor immunologisch onderzoek. Deze methode behoudt celviabiliteit en functionaliteit gedurende meer dan vijf dagen.

Verlenging van de levensduur van neutrofielen met CLON-G en een in vitro spontane doodstest

Meer video's verkennen