Isolatie, karakterisering en totale DNA-extractie om endofytische schimmels in mycoheterotrofe planten te identificeren

De hier gepresenteerde technieken zijn nuttig voor het onderzoeken van de endofytische schimmelgemeenschap die verband houdt met verschillende plantenorganen. Isolatie van endofytische schimmels maakt hun identificatie mogelijk en is waardevol in andere technieken zoals symbiotische ontkieming. Bereid om te beginnen acht tot 10 centimeter PDA-kweekmedium petrischalen aangevuld met drie milliliter per liter antibioticum.

Controleer op verontreiniging door het kweekmedium petrischaaltjes voor gebruik 24 uur bij 36 graden Celsius te incuberen. Desinfecteer de volgende dag oppervlakkig gezonde mychoheterotrofe plantenfragmenten met behulp van een standaardprocedure en plaats ze in een steriele petrischaal. Om de werkzaamheid van oppervlakkige ontsmetting van monsters te evalueren, inoculeert u een paar druppels gedestilleerd water dat is gebruikt tijdens de laatste wasbeurt van de monsters op PDA.

Verdeel vervolgens met een gevlamde scalpel en een pincet de monsters in stukken van 0,2 centimeter dik. Verdeel de monsters om het oppervlak te vergroten dat in contact komt met het medium. Plaats vijf fragmenten van de ondergrondse organen in de met antibiotica aangevulde PDA-plaat zo ver mogelijk uit elkaar zonder de randen van de schotel aan te raken.

Sluit de petrischaaltjes af met vershoudfolie en bewaar ze vijf dagen in het donker bij 25 tot 27 graden Celsius. Bereid een dag voor het subcultureren petrischaaltjes van vijf centimeter met vijf tot zeven gram per liter AA-medium en broed de platen 24 uur op 36 graden Celsius uit. Om schimmelisolaten te zuiveren, differentieert u de PDA-plaatkolonies op kleur, groeipatroon, textuur en margeformaat.

Baken vervolgens de kolonieranden aan de onderkant van de schaal af. Identificeer ook de kolonies met een code. Gebruik de punt van een geautoclaveerde houten tandenstoker om een kleine hoeveelheid mycelium uit de randen van de geïdentificeerde schimmelkolonie te halen en de AA-plaat te strepen, waarbij drie striae op een centimeter van elkaar en de randen van de schotel worden geproduceerd.

Label de AA-plaat met de juiste code met stickerpapier en potlood. Sluit de platen voordat u ze drie dagen in het donker bij 25 tot 27 graden Celsius uitbroedt. Observeer na het broeden de platen zorgvuldig om fijne hyfen te identificeren die individuele kolonies vormen.

Baken het gebied van individuele kolonies af met behulp van een permanente marker. Snijd een deel van het medium met de kolonie met behulp van een geautoclaveerde tandenstoker en breng het gesneden volume over naar het midden van een nieuwe PDA-petriplaat zonder antibiotica. Nadat je de petrischaaltjes hebt gelabeld met de codes van de isolaten, sluit je ze af met huishoudfolie en bewaar je ze zeven tot 14 dagen in het donker bij 25 tot 27 graden Celsius.

Om te beginnen met het conserveren van de schimmelisolaten met de methode van Castellani, voegt u 0,5 milliliter gedestilleerd water toe aan de geautoclaveerde microcentrifugebuis van twee milliliter. Snijd met een geautoclaveerde tandenstoker 0,5 bij 0,5 centimeter kubusvormig medium uit de myceliumranden van reeds gekweekte gezuiverde isolaten. Plaats vier tot zes kubussen in de microcentrifugebuisjes met gedestilleerd water.

Bewaar de tubes zo lang als nodig is in het donker bij 25 graden Celsius. Recupereer indien nodig een kubus en plaats deze in het midden van een nieuwe PDA-schaal om een opgeslagen isolaat te laten groeien. Begin met de plaagmontagemethode door een druppel van een Toluïdine blue-O-vlek op een schoon glasplaatje te plaatsen.

Bij een dergelijke techniek kunnen verschillende vlekken worden gebruikt. Verwijder met een geautoclaveerde tandenstoker voorzichtig wat hyfen uit het gegroeide isolaat en plaats ze in de druppel vlek. Plaats een dekglaasje en analyseer het onder een lichtmicroscoop.

Voor de plakbandbevestigingsmethode plaatst u een druppel van een lactofenol katoenblauwe vlek op een schoon glasplaatje. Knip een strook transparant plakband in een maat die goed past bij het glasplaatje en de centrale vlekdruppel. Richt het kleverige oppervlak van de plakstrip op het myceliumoppervlak en probeer wat hyfen te verzamelen zonder er te veel van te drukken of te verzamelen.

Plak vervolgens de tape op het glasplaatje en zorg ervoor dat de vlek in contact komt met de verzamelde hyfen. Plaats een druppel water boven de tape en plaats een dekglaasje voordat u het glaasje onder een lichtmicroscoop analyseert. De groei van kleine groepen filamenteuze schimmelmycelen die uit het binnenste van de fragmenten tevoorschijn kwamen, werd waargenomen na vijf dagen inoculatie van het mychoheterotrofe plantenorgaanfragment op het PDA-medium.

Gedurende zeven tot 14 dagen na inoculatie van het gezuiverde isolaat, werd de centrifugale groei van de pure schimmelisolaatkolonie waargenomen op PDA, waardoor een enkel cirkelvormig mycelium werd gevormd. Mogelijke verontreinigingen werden gemakkelijk geïdentificeerd, waardoor de homogeniteit van de kolonie met betrekking tot het groeivormaspect, de kleur en de pigmentproductie in het medium in gevaar kwam. Een kolonie geïsoleerd uit de fusiforme wortels van de mychoheterotrofe orchidee, Wullschlaegelia aphylla, was ondoorzichtig zonder diffuse pigmenten of exsudaten in het medium.

De kolonie was witachtig tot grijs aan de bovenzijde en bruinachtig aan de onderzijde. De mycelia waren luchtig en overvloedig, en de randen waren onregelmatig en luchtig. De kolonie had een fluweelachtige textuur en een gerimpelde topografie zonder macroscopische structuren.

De structuren die niet gemakkelijk zichtbaar waren in het niet-gekleurde mycelium werden tentoongesteld na het kleuren van het schimmelmycelium met lactofenol katoenblauw en toluïdineblauw-O, waardoor hun identificatie werd vergemakkelijkt. De hier gepresenteerde schimmelisolatiemethoden kunnen ook worden toegepast op groene planten voor het identificeren van de schimmelendofyten. De geïsoleerde schimmels kunnen worden gebruikt in symbiotische kiemproeven.