Verrijking van inheemse en recombinante extracellulaire blaasjes van mycobacteriën

Het verrijken van mycobacteriële EV's helpt bij het afbakenen van hun inhoud, het ontcijferen van hun facties en het ontwerpen van manieren om recombinante EV's te construeren en te genereren die voornamelijk gebruik maken van kandidaat-vaccins. Zes reeksen genereren uit verschillende locaties van het bacteriële oppervlak. Ze hebben geen geconserveerde markeringen.

Daarom kunnen op affiniteit gebaseerde benaderingen slechts een subset van de EV's verrijken. Onze methode daarentegen vangt alle gegenereerde mycobacteriën EV's op. De procedure wordt gedemonstreerd door Mohd Ilyas, een promovendus uit mijn laboratorium.

Voeg om te beginnen een milliliter glycerolbouillon van wildtype of recombinant Mycobacterium smegmatis toe aan een centrifugebuis van 50 milliliter met 10 milliliter voorverwarmde 7H9-bouillon. Sluit het deksel en draai de buis rond voordat u de cultuur een nacht incubeert bij 37 graden Celsius tussen 200 en 220 RPM. De volgende dag, wanneer de optische dichtheid bij 600 nanometer ongeveer één bereikt, centrifugeert u de cultuur bij 3.200 G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en gooit u het supernatans weg in een vloeibare weggooicontainer.

Voeg een milliliter voorverwarmde Sautons-media toe en resuspendeer voorzichtig om een uniforme suspensie te verkrijgen. Vul het volume aan tot 10 milliliter met behulp van Sautons-media. Centrifugeer opnieuw en gooi het supernatant weg.

Na het wassen de bacteriecellen resuspenderen. in 20 milliliter voorverwarmde Sautons-media en meet de optische dichtheid op 600 nanometer. Inoculeer het benodigde volume bacteriële suspensie in een erlenmeyer van één tot twee liter met 330 milliliter Sautons-media en incubeer bij 37 graden Celsius in 200 RPM totdat de optische dichtheid 0,3 bereikt.

Was de cellen de volgende dag één keer zoals eerder aangetoond en resuspendeer de pellet in 330 milliliter Sautons met 1/10 Tween 80. Verdeel 50 milliliter van de celsuspensie over zes kolven van één liter, elk met 280 milliliter voorverwarmde Sautons met 1/10 Tween 80. Incubeer de culturen bij 37 graden Celsius in 200 RPM totdat de optische dichtheid twee tot 2,5 bereikt.

Voeg twee liter culturen in het midden van het exponentiële stadium toe aan zes flessen van 400 milliliter en centrifugeer bij 8.000 G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Verzamel het supernatans en de voorgekoelde geautoclaveerde kolven of bekers en bewaar een hoeveelheid van de pellet voor analytische procedures. De pellet is gekleurd als de EV's recombinant zijn voor mCherry en bruin als ze wild-type zijn of recombinant voor niet-fluorescerende eiwitten.

Filtreer het kweeksupernatans door een verwijderingsfilter van 0,45 micron, gevolgd door filtratie door een filter van 0,22 micron om alle sporen van bacteriën te verwijderen. Was vervolgens de 30 kilodalton membraanconcentrators voor met 15 milliliter dubbel gedestilleerd water op 4.000 G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Was vervolgens met 15 milliliter voorgefilterde koude Sautons-media onder dezelfde omstandigheden om alle sporen van chemicaliën te verwijderen.

Voeg na het wassen 15 milliliter gefilterd gekweekt supernatans toe aan een concentrator en concentreer op 4.000 G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Breng het concentraat over in een koude Oak Ridge centrifugebuis van 40 milliliter of een verse Falcon centrifugebuis van 50 milliliter. Zodra de volledige twee liter kweekfiltraat is geconcentreerd, brengt u het concentraat over in een dubbel gedestilleerde, gewassen en voorgekoelde polypropyleen centrifugebuis van 50 milliliter en onderwerpt u deze aan een centrifugatie in twee stappen.

Eerst bij 4.000 G en vervolgens bij 15.000 G.Breng het gecentrifugeerde concentraat over in een voorgekoelde ultracentrifugebuis van 38,5 milliliter en draai vier uur lang bij 100.000 G bij vier graden Celsius. Vang het supernatans op in een voorgekoelde verse Falcon-centrifugebuis van 50 milliliter. keer de ultracentrifugebuis om op vers, pluisvrij absorberend papier om sporen van het supernatans te verwijderen en resuspendeer de pellet in 600 microliter HEPES-buffer.

Leg de geresuspendeerde pellet op de bodem van een voorgekoelde UltraClear polypropyleen ultracentrifugebuis van 13 milliliter en meng voorzichtig met vier milliliter inerte jodixanoloplossing met een dichtheidsgradiënt van 60%. Bedek vervolgens met een milliliter elk van 40% 30% 20% en 10% jodixanol. Vul de tube door aan de bovenkant vier milliliter 6% jodixanol toe te voegen.

Na het zorgvuldig wegen van de buis in een glazen bekerglas of een standaard, brengt u deze voorzichtig over in de zwaaiemmers en vervolgens in de rotor van de zwaaiemmer voor ultracentrifugatie bij 141.000 G gedurende 16 uur bij vier graden Celsius. Verwijder na ultracentrifugatie voorzichtig de buis en verzamel een fractie van één milliliter in geautoclaveerde microcentrifugebuisjes. TEM-analyse toonde aan dat mycobacteriële EV's cirkelvormig zijn en nano-tracking-analyse bevestigde EV's van verschillende grootte met diameters variërend tussen 20 en 250 nanometer.

Toen het N-terminale uiteinde van mCherry translationeel werd gefuseerd met het C-terminale uiteinde van CFP-29, werd een deel van de verrijkte mEV's van Msm roze, wat wijst op het vermogen van cf-29 om een vreemd eiwit van belang te dragen. CFP-29 werd vervolgens gebruikt om de levering van EsxA in Msm EV's te evalueren. Mtb's EsxA werd waargenomen in Msm EV's in kleine hoeveelheden.

CFP-29 EsxA 3X FLAG was stabieler en accumuleerde op hogere niveaus in mEV's. Het verrijken van de EV's van mycobacteriën die onder fysiologisch verschillende omstandigheden worden gekweekt, geeft inzicht in hun veranderde inhoud en gewijzigde functies die aanhoudende besmettelijkheid, pathogenese en verspreiding van pathogenen dicteren.